一种海藻硫酸多糖的应用

一种海藻硫酸多糖的应用
【专利摘要】本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种海藻硫酸多糖的应用。所述海藻硫酸多糖在防治微波辐射方面的应用。通过一系列实验研究证明，海藻硫酸多糖在防治微波辐射方面具有很好地效果。
【专利说明】
一种海藻硫酸多糖的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种海藻硫酸多糖的应用。
【背景技术】
[0002] 大量流行病学调查、实验研究发现，电磁辐射可损伤多器官系统，如神经系统、生 殖系统、免疫系统等，引起DNA损伤和蛋白质异常表达等。2011年，IRAC( International Agency for Research on Cancer,国际癌症研究中心)将电磁福射列为可能致癌物，更加 引起人们对电磁辐射的普遍关注。当前，电磁辐射损伤机制尚未完全阐明。有研究指出，氧 化应激损伤HPM辐射生物损伤效应的主要机制之一。
[0003] 高功率微波武器是当今发展最迅速的高新技术武器之一，是现代和未来信息化战 争的标志性武器，不仅干扰和破坏武器系统电子设备/装备，还可造成平、战时部队人员的 损伤。已有的研究结果显示，HPM辐射可损伤多器官系统，如神经系统、生殖系统、免疫系统 等，但其损伤机制尚未完全阐明，能量代谢障碍、自由基所致氧化应激损伤、凋亡相关蛋白 异常表达、DNA损伤、信号转导通路异常等在其中发挥重要作用，而氧化应激损伤是HPM辐射 生物损伤效应的主要机制之一。HPM辐射损伤的防治除了屏蔽与吸收等物理防护外，目前市 面上尚无疗效显著且安全性高的防治药物。
[0004] 海藻硫酸多糖，全名为海藻多糖硫酸酯，是从海带提取的一种大分子多糖复合物。 前期研究表明，海藻硫酸多糖能清除羟自由基和超氧阴离子自由基，降低丙二醛(MDA)和蛋 白质羰基(PCO)含量，升高谷胱苷肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性， 且具有无毒副作用，原药材价格低廉，便于制备，易于使用等众多优点。根据前期探索性实 验所确定的敏感指标和敏感脏器，本部分实验通过免疫学指标血常规，CD3+、CD4+、CD8+淋 巴细胞亚群及氧化应激指标XOD、MP0、SOD、GSH-PX、CAT、MDA、PCO含量或活性检测，结合海马 和睾丸组织的形态学改变，确定海澡硫酸多糖对脑和睾丸氧化应激损伤有效剂量，为最终 获得军特药临床批件打下坚实的基础。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种海藻硫酸多糖的应用，证明海藻硫酸多糖在防治微波辐 射方面具有很好的效果。
[0006] 为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种海藻硫酸多糖的应用，所述海藻硫酸多糖在防治微波辐射方面的应用。
[0008] 可选的，所述硫酸海藻多糖在制备防治微波辐射的药物上的应用。
[0009] 可选的，所述微波辐射中微波为频率2-4GHZ、波长为150-75. OOmm的S波段微波。
[0010] 可选的，所述微波为频率2.856GHz的微波。
[0011 ]可选的，所述微波平均功率密度为30mW/cm2，峰值功率密度为200mW/cm2，脉冲频率 为 300pps，脉宽为 500ns。
[0012]其中所用海藻多糖由以下提取方法提取所得：
[0013] (1)将海带置入于其自身质量38 - 42倍的水中浸泡35 - 45分钟后，用于其自身质 量38 - 42倍量的水冲洗干净；
[0014] (2)对海带进行预处理，剔除叶黄、叶碎和发霉的不合格海带，将合格海带切成面 积7 -10平方厘米的碎片；
[0015] (3)将海带加入到于其自身质量9 - 11倍的水中煎煮三次，分别为1.9 - 2.1小时、 1.4 一 1.6 小时、1.4 一 1.6 小时；
[0016] (4)将三次煎煮液合并后减压浓缩至相对密度1.05 - 1.15得浓缩液I;
[0017] (5)向浓缩液I中加入乙醇至乙醇体积浓度29 - 31 %，静置过夜后离心得上清液和 沉渣；
[0018] (6)对沉渣进行检测，若沉渣中S〇42_的质量百分含量大于5%，向沉渣中加入乙醇 至乙醇体积浓度29 - 31%，静置至分层后离心得上清液;若沉渣中SO42-的质量百分含量小 于等于5%，弃沉渣；
[0019] (7)将步骤S50及步骤S60中的上清液合并，减压浓缩至相对密度1.1 一 1.2得浓缩 液II;
[0020] (8)向浓缩液II中加入乙醇至乙醇体积浓度83 - 86%，静置过夜后，弃上清液，沉 淀用体积百分数74 - 76%的乙醇洗涤后离心；
[0021 ] (9)将离心后的沉淀用7 - 9倍量的水溶解后进行喷雾干燥得海藻硫酸多糖。
[0022]上述提取方法中，步骤（1)中将海带置入于其自身质量40倍的水中浸泡40分钟后， 用于其自身质量40倍量的水冲洗干净；
[0023]步骤(2)中，将合格海带切成面积9平方厘米的碎片；
[0024]步骤(3)中，将海带加入到于其自身质量10的水中煎煮三次，分别为2小时、1.5小 时、1.5小时；
[0025]步骤(4)中，将三次煎煮液合并后减压浓缩至相对密度1.1得浓缩液I;
[0026] 步骤(5)中，向浓缩液I中加入乙醇至乙醇体积浓度30%，静置过夜后离心得上清 液和沉渣；
[0027] 步骤(6)中，若沉渣中SO42+的质量百分含量大于5%，向沉渣中加入乙醇至乙醇体 积浓度30%，静置至分层后离心得上清液；
[0028] 步骤(7)中，将步骤S50及步骤S60中的上清液合并，减压浓缩至相对密度1.17得浓 缩液Π;
[0029] 步骤(8)中，向浓缩液II中加入乙醇至乙醇体积浓度85%，静置过夜后，弃上清液， 沉淀用体积百分数75%的乙醇洗涤后离心；
[0030]步骤(9)中，将离心后的沉淀用8倍量的水溶解后进行喷雾干燥得海藻硫酸多糖。 [0031]本发明通过一系列实验研究证明，海藻硫酸多糖在防治微波辐射方面具有很好地 效果，明确了海藻硫酸多糖对HPM辐射损伤防治作用的有效剂量，证明中剂量(50mg/kg/d) 药物组是其最佳给药浓度。同时，海藻硫酸多糖可降低X0D、MP0等自由基生成相关酶活性， 增加SOD、CAT等抗氧化酶活性，降低MDA、PCO等自由基代谢产物含量，为其防治HPM所致机体 氧化损伤的机制之一。
【附图说明】
[0032]图1大鼠灌胃给药期间体重变化；
[0033]图2正常对照组停药后ld，海马神经元大多结构正常，血管周间隙轻度增宽；
[0034]图3正常对照组停药后3d，海马神经元结构正常，血管周间隙轻度增宽；
[0035]图4辐射组停药后ld，海马神经元固缩深染增多，细胞和血管周间隙轻度增宽； [0036]图5辐射组停药后3d，海马神经元固缩深染明显增多，细胞和血管周间隙明显增 宽；
[0037]图6辐射组停药后7d，海马神经元固缩深染减少，细胞和血管周间隙仍明显增宽；
[0038]图7低剂量药物组停药后ld，海马神经元固缩深染增多，细胞和血管周间隙轻度增 宽；
[0039]图8低剂量药物组停药后3d，海马神经元固缩深染增多，细胞和血管周间隙轻度增 宽；
[0040] 图9低剂量药物组停药后7d，海马神经元固缩明显减少，细胞和血管周间隙轻度增 宽；
[0041] 图10中剂量药物组停药后ld，少数海马神经元固缩深染，血管周间隙轻度增宽； [0042]图11中剂量药物组停药后3d，少数海马神经元固缩深染，血管周间隙轻度增宽； [0043]图12中剂量药物组停药后7d，海马神经元结构基本正常，血管周间隙轻度增宽； [0044]图13高剂量药物组停药后ld，少数海马神经元固缩深染，血管周间隙轻度增宽； [0045]图14高剂量药物组停药后3d，部分海马神经元固缩深染，血管周间隙轻度增宽；
[0046] 图15高剂量药物组停药后7d，海马神经元结构基本正常，血管周间隙轻度增宽；
[0047] 图16阳性药物组停药后ld，少数海马神经元固缩深染，细胞和血管周间隙轻度增 宽；
[0048] 图17阳性药物组停药后I d，少数海马神经元固缩深染，细胞和血管周间隙轻度增 宽；
[0049] 图18阳性药物组停药后ld，少数海马神经元固缩深染，细胞和血管周间隙轻度增 宽；
[0050] 图19中剂量药物对照组停药后ld，海马神经元结构基本正常，血管周间隙轻度增 宽；
[0051] 图20中剂量药物对照组停药后7d，海马神经元结构基本正常，血管周间隙轻度增 宽；
[0052]图21正常对照组停药后ld，睾丸生精小管各级生精细胞结构正常、层次清晰，精子 丰富；
[0053]图22辐射组停药后Id，生精上皮层明显水肿，生精细胞排列疏松，精子细胞和精子 不同程度减少；
[0054]图23辐射组停药后3d，生精小管内生精上皮层水肿，腔内可见蛋白水肿液积聚； [0055]图24辐射组停药后7d，生精小管内生精上皮层水肿和蛋白水肿液积聚仍存在，但 有所减轻；
[0056]图25低剂量药物组停药后ld，生精上皮层水肿，腔内可见蛋白水肿液积聚；
[0057]图26低剂量药物组停药后3d，生精上皮层明显水肿，生精细胞排列疏松；
[0058]图27低剂量药物组停药后7d，生精上皮层明显水肿，生精细胞排列疏松；
[0059] 图28中剂量药物组停药后ld，生精上皮层轻中度水肿；
[0060] 图29中剂量药物组停药后3d，生精上皮层轻度水肿；
[00611图30中剂量药物组停药后7d，生精小管各级生精细胞结构正常；
[0062]图31高剂量药物组停药后ld，生精上皮层较明显水肿；
[0063]图32高剂量药物组停药后3d，生精上皮层轻中度水肿；
[0064]图33中剂量药物组停药后7d，生精上皮层水肿尚未完全恢复正常；
[0065]图34阳性药物组停药后ld，生精上皮层较明显水肿；
[0066]图35阳性药物组停药后3d，生精上皮层较明显水肿，蛋白水肿液积聚；
[0067]图36阳性药物组停药后7d，生精上皮层水肿尚未完全恢复正常；
[0068]图37中剂量药物对照组停药后ld，睾丸生精小管各级生精细胞结构正常；
[0069]图38中剂量药物对照组停药后7d，睾丸生精小管各级生精细胞结构正常；
[0070]图39正常对照组停药后ld，颗粒细胞形态结构正常；
[0071]图40正常对照组停药后ld，锥体细胞形态结构正常，线粒体轻度肿胀；
[0072]图41正常对照组停药后7d，胶质细胞形态结构正常；
[0073]图42正常对照组停药后ld，血管周围间隙正常；
[0074]图43正常对照组停药后ld，突触结构稍模糊；
[0075]图44正常对照组停药后7d，胶质细胞轻度水肿；
[0076]图45辐射组停药后ld，海马神经元核染色质疏松，线粒体肿胀、空化、嵴紊乱，溶酶 体增多；
[0077]图46辐射组停药后7d，胶质细胞明显肿胀，胞浆细胞器稀疏；
[0078]图47辐射组停药后ld，突触间隙模糊；
[0079]图48辐射组停药后Id，血管周间隙明显增宽；
[0080]图49低剂量药物组停药后ld，颗粒细胞线粒体肿胀、内质网和高尔基体轻度扩张； [0081 ]图50低剂量药物组停药后IcU颗粒细胞明显肿胀，褪变；
[0082]图51低剂量药物组停药后ld，颗粒细胞染色质凝集边移，呈细胞凋亡；
[0083]图52低剂量药物组停药后ld，锥体细胞线粒体明显肿胀，出现噬神经细胞现象；
[0084]图53低剂量药物组停药后Id，突触间隙模糊；
[0085]图54辐射组停药后Id，血管周间隙明显增宽；
[0086]图55中剂量药物组停药后Id，颗粒细胞线粒体轻度肿胀；
[0087]图56中剂量药物组停药后7d，颗粒细胞线粒体轻度肿胀；
[0088]图57中剂量药物组停药后7d，锥体细胞少数线粒体肿胀、灶性空化；
[0089]图58中剂量药物组停药后ld，胶质细胞结构正常，血管周围间隙轻度增宽；
[0090]图59中剂量药物组停药后Id，突触间隙稍模糊；
[0091]图60中剂量药物组停药后7d，血管周围间隙无明显增宽；
[0092]图61高剂量药物组停药后ld，颗粒细胞线粒体较明显肿胀、空化；
[0093]图62高剂量药物组停药后ld，锥体细胞线粒体较明显肿胀、灶性空化，，噬神经细 胞现象；
[0094]图63高剂量药物组停药后Id，突触间隙稍模糊；
[0095]图64高剂量药物组停药后ld，血管周围间隙轻度增宽；
[0096]图65高剂量药物组停药后7d，颗粒细胞线粒体轻度肿胀；
[0097]图66高剂量药物组停药后7d，锥体细胞见部分线粒体肿胀、空化；
[0098]图67正常对照组停药后ld，正常精原细胞；
[0099] 图68正常对照组停药后7d，正常精母细胞；
[0100]图69正常对照组停药后ld，正常精子；
[0101]图70辐射组停药后IcU精原细胞染色质浓缩边移；
[0102 ]图71辐射组停药后7d，精原细胞褪变；
[0103]图72辐射组停药后7d，精母细胞坏死；
[0104]图73辐射组停药后Id，精母细胞线粒体明显肿胀、空化；
[0105] 图74辐射组停药后I d，精子细胞明显肿胀、褪变；
[0106] 图75辐射组停药后7d，精子细胞明显肿胀、褪变；
[0107]图76辐射组停药后ld，精子形态基本正常；
[0108] 图77低剂量药物组停药后ld，精原细胞染色质浓缩边移；
[0109] 图78低剂量药物组停药后ld，精原细胞染色质浓缩边移；
[0110] 图79低剂量药物组停药后ld，精子形态正常；
[0111] 图80低剂量药物组停药后Id，间质Ledig细胞染色质浓缩边移；
[0112]图81中剂量药物组停药后ld，精原细胞和精母细胞形态正常，精母细胞线粒体肿 胀、空化；
[0113]图82中剂量药物组停药后7d，精原细胞和精母细胞形态正常，精母细胞线粒体肿 胀、空化；
[0114] 图83中剂量药物组停药后ld，精原细胞核染色质团块状凝聚；
[0115] 图84中剂量药物组停药后ld，精子形态结构正常；
[0116] 图85高剂量药物组停药后ld，精原细胞和精母细胞形态正常，精母细胞线粒体肿 胀、空化；
[0117] 图86高剂量药物组停药后ld，精原细胞染色质凝集边移；
[0118] 图87高剂量药物组停药后7d，精原细胞染色质凝集团块状凝集；
[0119] 图88高剂量药物组停药后7d，精母细胞线粒体肿胀、空化；
[0120]图89高剂量药物组停药后ld，精子形态结构正常；
[0121] 图90高剂量药物组停药后7d，精子形态结构正常；
[0122] 图91活性氧在细胞代谢中的产生与消除途径。
【具体实施方式】
[0123] 实施例1
[0124] 海藻硫酸多糖生产工艺参数
[0125] (1)海带选择和鉴定
[0126] 产地:中国北方海域。
[0127] 形式:晾干打捆。
[0128] 鉴定：由专业人员按海藻硫酸多糖质量标准逐一鉴定，剔除叶黄、叶碎、发霉等不 合格海带。
[0129] (2)浸泡工序
[0130] 投料:200千克海带。
[0131] 浸泡方式:分四批，每批50千克放入不锈钢水池中，使海带松开后上下全部浸入40 倍量水中。
[0132] 浸泡时间：40分钟。
[0133] (3)清洗和切碎工序
[0134] 清洗方式:用40倍量水冲洗海带至干净。
[0135] 清洗时间:每批10分钟。
[0136] 切碎尺寸:粒径3厘米大小碎片。
[0137] (4)水萃取工序
[0138] 取海带碎片放入萃取罐，经过先后三次蒸煮萃取，每次加入10倍量的水，第一次煮 沸2小时，第二、三次各煮沸1.5小时。
[0139] (5)浓缩一
[0140] 三次萃取液集中于浓缩罐进行第一次浓缩。
[0141] 方式:减压浓缩。
[0142] 终浓度:相对密度1. 10(50°C热测）。
[0143] (6)醇沉一
[0144] 浓缩液加入乙醇至体积浓度30%，进行第一次沉淀，静置过夜。
[0145] (7)离心一
[0146] 离心后收集上清液，并取沉渣样品，进行含量测定。【沉渣检测】按海藻硫酸多糖质 量标准进行。
[0147] (8)沉渣重溶
[0148] 若沉渣S〇A>5 %时，用30 %乙醇再溶沉渣，静置过夜。
[0149] (9)再离心
[0150] 至沉渣中S〇42\5 %时，离心去沉渣，收集上清液。
[0151] (10)浓缩二
[0152] 离心上清液集中于浓缩罐。
[0153] 方式:减压浓缩。
[0154] 终浓度:相对密度1.17 (50°C热测）。
[0155] (11)醇沉二
[0156] 浓缩液加入乙醇至终浓度85%，静置过夜。
[0157] (12)洗沉淀
[0158]倾去上清液，加乙醇至体积浓度75%，洗沉淀，静置过夜。
[0159] (13)离心二
[0160] 离心后取沉淀样品进行含量测定。
[0161] (14)喷雾干燥
[0162] 离心后，加8倍量水溶解，喷雾干燥，即得海藻硫酸多糖。
[0163] 制成总量：200千克海带获得5~6千克提取物。喷雾干燥工序后获得3~5千克干 粉。得率1.5~2.5%。
[0164] 通过下述一系列实验来证实海藻硫酸多糖对微波辐射具有防治作用。
[0165] 一、实验动物和分组
[0166] 二级健康雄性Wistar大鼠210只，体重200 ± 20g，根据体重随机分7组:正常对照组 (NC)、HPM辐射组(HR)、低剂量药物防治组(LDP)、中剂量药物防治组(MDP)、高剂量药物防治 组(HDP)、阳性药物组(PD)和中剂量药物对照组(MDC)。实验动物详细分组情况见表1。
[0167] 表1海藻硫酸多糖对HPM致大鼠氧化损伤防治作用研究动物分组情况
[0169] 二、给药方法
[0170] 各组大鼠于辐射前7d每天8:00~10:00灌胃给药，持续至辐射后7d，共给药14d。药 物组药物浓度分别为LDP组2.5mg/ml海藻硫酸多糖；MDP组5mg/ml海藻硫酸多糖；HDP组 I Omg/ml海藻硫酸多糖；PD组9mg/ml普罗布考，购自齐鲁制药有限公司，产品批号 4110511此。％组、册组均给予等比体积的生理盐水。1?)(：组511^/1111海藻硫酸多糖。每日给药 前称重，按当日体重决定每只大鼠的给药量。
[0171]三、S波段HPM辐射装置及辐射方法
[0172] 采用军事医学科学院自建的S波段HPM源，HR组、LDP组、MDP组、HDP组、组的辐射 平均功率密度为30mW/cm 2 (频率:2.856GHz，峰值功率密度:200mW/cm2，脉冲频率:300pps，脉 宽：500ns)，辐射时间60min(辐射15min，间歇15min)。大鼠置于有孔的有机玻璃盒内，照射 台顺时针缓慢旋转以保证大鼠全身照射均匀。NC组和MDC组进行假辐射，其他条件相同。
[0173] 四、大鼠体重测量
[0174] 每次灌胃给药前和活杀取材时前均测量记录各组大鼠体重。
[0175] 五、大鼠免疫系统损伤相关指标检测
[0176] (一)大鼠血血常规检测
[0177] 1.主要仪器设备
[0178] 全自动血细胞分析仪，Sysmex 2100,株式会社，日本。
[0179] 2.实验步骤
[0180] (1)分别于停药后ld、3d、7d随机从各组大鼠中挑选10只，经1%戊巴比妥钠腹腔注 射麻醉后，腹主静脉取血Iml至抗凝管中混匀。
[0181] (2)采用Sysmex 2100全自动血细胞分析仪检测大鼠血白细胞数、红细胞数、淋巴 细胞数及血红蛋白含量。
[0182] (二)大鼠血⑶3+、⑶4+、⑶8+淋巴细胞亚群检测
[0183] 1.主要仪器设备及试剂
[0184] (1)流式细胞仪，FACscalibur，BD公司，美国
[0185] (2)低温高速离心机，CR-22E，HITACHI公司，日本
[0186] (3)CD3+、CD4+、CD8+检测试剂盒，BioLegend公司，美国
[0187] (4)红细胞裂解液，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，中国
[0188] 2.实验步骤
[0189] (1)各组大鼠分别于停药后1(1、3(1、7(1，随机挑选10只，经1%戊巴比妥钠腹腔注射 麻醉，自腹主静脉取血1〇〇μ1，加入肝素钠抗凝后再加入FITC anti-rat CD3抗体0.5ul，PE anti-rat CD4抗体 1.25ul，PerCP anti-rat CD8a抗体5ul，室温放置30min。
[0190] (2)每管加入红细胞裂解液lml，室温放置5min。
[0191] (3)将各管置于4°C的低温离心机中，800rpm离心5min，弃上清液。
[0192] (4)加入500μ1 PBS洗涤两次后，加入PBS重悬。
[0193] (5)lh内使用流式细胞仪检测。
[0194] 六、大鼠脑和睾丸组织相关氧化指标的检测
[0195] 1.主要仪器设备及试剂
[0196] (1)多功能酶标仪，Victor_X3，PerkinElmer公司，美国
[0197] (2)旋涡混匀器，GF-I，江苏其林医用仪器厂，中国 [0198] (3)96孔微孔板，Corning公司，中国
[0199] (4)低温高速离心机，CR-22E，HITACHI公司，日本
[0200] (5)多功能酶标仪，Victor_X3，PerkinElmer公司，美国 [0201] (6)移液枪，Gilson公司，法国
[0202] (7)恒温水浴箱，北京长风仪器仪表公司，中国
[0203] (8)乂00、1^0、300、63!?^、041'、1?^及？0)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所， 中国
[0204] 2.主要步骤
[0205] (I)XOD含量测定
[0206]①样品前处理:准确称取脑和睾丸组织重量，按重量体积比加入9倍体积的生理盐 水制成组织匀浆，离心后取适量上清液测定。
[0207]②测定管:采用南京建成生物工程研究所的货号为A002的XOD测试盒，分别从各组 样品上清液中取样IOul加入试管中，再依次加入1ml试剂一、0.05ml试剂二、0.2ml试剂三、 0.02ml试剂四。
[0208]③空白管：加入IOul蒸馏水于试管中，再依次加入1ml试剂一、0.05ml试剂二、 0.2ml试剂三、0.02ml试剂四。
[0209 ]④混匀各管中的试剂，置于37 °C水浴锅中水浴20min。
[0210] ⑤取出各试管，每管分别加入1ml试剂五，混匀。
[0211] ⑥取上清，蒸馏水调零后，530nm、Icm光径测各管吸光度值。
[0212] ?血清遞活力j定^g -空白管⑶值x反应液总体积x_1_ L J (?/L) 呈色物摩尔消光系数 取样量 光径X反应时间
[0213] (2)MP0含量测定
[0214]①样本前处理:采用南京建成生物工程研究所的货号为A044的MPO测试盒，取样与 试剂二按1:1比例稀释，充分混匀后，用移液器准确取〇. 9ml混合液，加入0.1 ml试剂三，混和 均匀后置于37 °C水浴锅中水浴15分钟。
[0215]②对照管:取3ml双蒸水于试管中，再分另_入0.2ml样本、0.2ml试剂四。
[0216] ③测定管:取0.2ml样本溶液于试管中，再分别加入0.2ml试剂四、3ml显色剂。
[0217] ④混匀各管中的试剂后，置于37 °C水浴锅中水浴30min。
[0218]⑤取出各试管，每管分别加入〇.〇5ml试剂七。
[0219] ⑥混匀各管中的试剂后，置于60°C水浴锅中水浴lOmin。
[0220] ⑦取上清，蒸馏水调零后，立即在460nm、lcm光径测各管吸光度值。 r -, ? Mfio活力_ 测定Ο?值-对照O O值 L 」 （单位/升）-1取样量（0.45/lx 0.2>
[0222] (3)S0D活性测定
[0223] ①样本前处理:准确称取脑和睾丸组织重量，按重量体积比加入9倍生理盐水，冰 水浴条件下制作组织匀浆，2500转/分、离心10分钟后，取上清用生理盐水稀释15倍后取 50ul测定。
[0224] ②对照管：采用南京建成生物工程研究所的货号为AO01-3 (WST-1法）的SOD测试 盒，加入0.05ml蒸馏水于试管中，再分别加入1ml试剂一、0 . Iml试剂二、0 . Iml试剂三和 0.1 ml试剂四。
[0225] ③测定管：加入0.05ml样本溶液于试管中，再分别加入1ml试剂一、0.1ml试剂二、 0.1 ml试剂三和0.1 ml试剂四。
[0226] ④充分混匀后，置于37 °C水浴锅中水浴40min。
[0227] ⑤每管加入2ml显色剂，充分混匀后室温下静置lOmin。
[0228] ⑥取上清，蒸馏水调零后，立即在550nm、lcm光径测各管吸光度值。
[0229] ⑦ 组织中,SQD活力_对照〇￡>值一测定(9￡>值_ ^反应液总体积(》;/).待测样本蛋白浓度 (U/ mgprot) 对照OD值 ' 〇>< -取样量(m/) - . (mgprot/ml)
[0230] (4)CAT活性测定
[0231] ①样本前处理:准确称取脑和睾丸组织重量，按照重量体积比加入9倍体积的生理 盐水，冰水浴条件下制作组织匀浆，2500转/分、离心10分钟后，取上清50ul测定。
[0232] ②对照管：采用南京建成生物工程研究所的货号为A007-l(可见光法）的CAT测试 盒，将试剂一和试剂二预温致37°C，分别向其中加入1ml试剂一、0.1 ml试剂二。
[0233] ③测定管:加入0.05ml样本于试管中，再分别向各测定管加入1ml试剂一、0.1 ml试 剂二。
[0234] ④充分混匀后，37 °C准确反应1分钟。
[0235] ⑤对照管中分别加入1ml试剂三、0.1 ml试剂四，再加入0.05ml样本溶液;测定管中 分别加入1ml试剂三、0.1ml试剂四。
[0236] ⑥充分混匀，蒸馏水调零后，立即在405nm、0.5cm光径测各管吸光度值。
[0237] ⑦C仍舌力=(对照管OZX直-测定管QD值）X 271 +反应=间+ [待测蛋白白量X取样量】 ^-(U- /mgprat) (60秒） imgprot ! mV)
[0238] (5)GSH_px 活性测定
[0239] ①样本前处理:准确称取脑和睾丸组织重量，按重量体积比加入9倍体积的生理盐 水制成组织匀浆，2500转/分、离心10分钟，取上清200ul测定。
[0240] @对照管加入1111111〇1/163!10.21111，测试管加入1111111〇1/163!1和待测样本溶液各 0.2ml，37 °C水浴预温5分钟。
[0241] ③采用南京建成生物工程研究所的货号为A005的GSH-PX测试盒，将试剂一预温至 37°C，分别向对照管和测试管各加入0.1 ml试剂一，37°C准确反应5分钟。
[0242] ④向对照管加入2ml试剂二和0.2ml待测样本溶液，测试管只加入2ml试剂二，充分 混匀后，3500转/分、离心10分钟，取上清进行后续实验。
[0243] ⑤分别向空白管加入1ml GSH标准溶剂应用液、Iml试剂三、0.25ml试剂四、0.25ml 试剂五，标准管加入1ml 20ymol/L GSH、Iml试剂三、0.25ml试剂四、0.25ml试剂五，对照管 加入1ml对照管上清液、Iml试剂三、0.25ml试剂四、0.25ml试剂五，测定管加入1ml测定管上 清液、Iml试剂三、0.25ml试剂四、0.25ml试剂五。
[0244] ⑥充分混匀后，室温静置15分钟，蒸馏水调零后，412nm处、Icm光径测定各管吸光 度值。
[0245] ? 组织GS/y-对照管(9Z)值一测定管QD值标准管浓度稀释倍数待测匀浆 酶活力=标准管OD值一空白管OZ)值X(20芦》〇//l)X (5*) 了 "" 蛋白浓度Χ 里）
[0246] (6)MDA含量测定
[0247] ①样本前处理:准确称取脑和睾丸组织重量，按重量体积比加入9倍体积生理盐水 制成组织匀衆，2500转/分、离心10分钟，取适量上清液进行测量。
[0248] ②采用南京建成生物工程研究所的货号为A003-1的MDA测试盒，标准管加入 lOnmol/ml标准品0.2ml和试剂一0.2ml，轻微混勾后加入3ml试剂二和Iml试剂三;空白管加 入0.2ml无水乙醇和0.2ml试剂一，轻微混勾后加入3ml试剂二和Iml试剂三；测定管加入 0.2ml待测样本和0.2ml试剂一，轻微混匀后加入3ml试剂二和Iml试剂三。
[0249] ③充分混匀后，试管口用保鲜膜扎紧并在膜上扎一小孔，沸水浴40分钟。
[0250] ④流水冷却后，3500转/分、离心10分钟。
[0251] ⑤取上清，蒸馏水调零后，立即在532nm、lcm光径测各管吸光度值。 .(g\ -
[0252] 组织中MZM含量-测定管吸光度-空白管吸光度X标准品浓度.10%蛋白含量 (nmol / mgprot) 标准管吸光度-空白管吸光度（10?mo//m/) (mgpm/7m/)
[0253] (7)PC0含量测定
[0254] ①组织匀浆的制备:准确称取脑和睾丸组织重量，按重量体积比加入9倍体积的生 理盐水，冰水浴条件下制作组织匀浆，3000转/分、离心10分钟，取上清备用。
[0255] ②采用南京建成生物工程研究所的货号为A087的蛋白质羧基含量测试盒，取上清 0.225ml，加入0.025ml蛋白质羰基试剂二，充分混匀室温静置IOmin，11000转/分、离心 IOmin，留上清待测。
[0256] ③测定管加入0.1 ml待测样本和0.4ml试剂三，对照管加入0.1 ml待测样本和试剂 四，充分混合1分钟，37 °C准确避光反应30分钟。
[0257] ④各管分别加入0.5ml试剂五，充分混合1分钟，将其置于4°C低温离心机中12000 转/分、离心I Omin，弃上清液，留沉淀。
[0258]⑤各管分别加入1ml无水乙醇乙酸乙酯混合应用液，充分混合1分钟，将其置于4°C 低温离心机中12000转/分、离心I Omin，弃上清液，留沉淀。
[0259] ⑥重复步骤⑤三次。
[0260] ⑦各管分别加入1.25ml试剂六，混匀后，37°C准确水浴15分钟。
[0261] ⑧漩涡混匀，将全部沉淀溶解后，12000转/分、离心15min。
[0262] ⑨试剂六调零后，取上清液在370nm、Icm光径测定各管吸光度值。 厂^ # 蛋白质羰基含量 测定管OD-对照管OD .... (nmol/mgprot) 22χ比色光径（cm)x样本蛋白浓度（mgprot/L)
[0264] 七、大鼠海马和睾丸组织形态学观察
[0265] (一）主要仪器设备
[0266] (1)全自动脱水机，ASP200，Leica公司，德国
[0267] (2)石蜡包埋机，EG1150，Leica公司，德国
[0268] (3)全自动石蜡切片机，RM2255，Leica公司，德国
[0269] (4)冷台，EG1130，Leica公司，德国
[0270] (5)摊片机，HI1220，Leica公司，德国
[0271] (6)烤片机，HI1220，Leica公司，德国
[0272] (7)电热鼓风干燥箱，DHG-9145A，上海一恒科学仪器有限公司，中国
[0273] (8)封片机，CV5030，Leica公司，德国
[0274] (9)光学显微镜，DM6000，Leica公司，德国
[0275] (10)透射电子显微镜，H7650，HITACHI公司，日本 [0276](二)实验试剂
[0277] (1)苏木素染液，北京中杉金桥生物技术有限公司，中国
[0278] (2)伊红染液，北京中杉金桥生物技术有限公司，中国
[0279] (3)中性树胶，北京国药基团化学试剂有限公司，中国
[0280] (4)其它试剂均为国产分析纯
[0281](三)实验步骤
[0282] 1.光镜标本
[0283] (1)分别于停药后IcU停药后3d、停药后7d随机从各组大鼠中挑选10只，经1%戊巴 比妥钠腹腔注射麻醉后，取脑和睾丸组织，将部分组织放入10%福尔马林溶液中固定。
[0284] (2)使用梯度酒精作为脱水剂，脱去组织块中的水分，再将其放入二甲苯中透明。
[0285] (3)将组织投入液体石蜡中除去多余的二甲苯，将组织块置于包埋模具中包埋，注 意切面方向，加入石蜡使其凝固。
[0286] (4)将蜡块取出，将其制成厚度约为3μπι的切片。将切片放入捞片机，待其平整后， 将切片贴附于载玻片上，放在烤片机上晾干，制成石蜡切片。
[0287] (5)使用二甲苯和梯度酒精进行脱蜡，苏木素染色5-10min后，流水冲洗3minX3 次。
[0288] (6)盐酸乙醇分化片刻，流水冲洗3min X 3次。
[0289] (7)乙醇伊红溶液复染，乙醇脱水，二甲苯透明，最后采用中性树胶封片。
[0290] (8)将切片置于阴凉通风处晾干，采用光学显微镜观察并拍照。
[0291] 2.电镜标本
[0292] 分别于停药后IcU停药后3d、停药后7d随机从各组大鼠中挑选3只，经1 %戊巴比妥 钠腹腔注射麻醉后，取lmm3左右的脑和睾丸组织，2.5%戊二醛和1 %锇酸固定，乙醇、丙酮 脱水，环氧树脂包埋，制作半薄切片定位。然后制作超薄切片，经3%醋酸铀和柠檬酸铅双重 染色后，透射电镜下观察。
[0293] 八、统计分析
[0294] 数据分析采用IBM SPSS19.0软件处理，文中数据以均数土标准差(mean土sd)表 示。各组比较采用重复测量的方差分析，组间多重比较采用Tukey B法;其余数据采用单因 素方差检验，多重比较采用LSD法或Dunnett法。与正常对照组相比，*p<0.05，#p<0.01; 与HPM辐射组比较， Λρ<0 · 05，ΛΛρ<0 · 01。与阳性药相比较，*p<0 · 05，#p<0 · 01。
[0295] 实验结果
[0296] -、大鼠体重变化
[0297] 各组大鼠体重在灌胃期间随时间均呈现增长趋势，给药或辐射对大鼠体重的增长 没有明显影响。第8天各组大鼠体重较前一天体重基本不变，可能与第7天进行微波辐射有 关，见图1。提示30mW/cm 2HPM辐射和灌胃给予海藻硫酸多糖对大鼠体重均没有明显影响。
[0298] 二、大鼠免疫学指标的变化
[0299] 1.大鼠白细胞和淋巴细胞数变化 [0300] 结果见表1。
[0301] (1)停药后Id，辐射组白细胞数和淋巴细胞数较正常对照组明显减少(P<0.05或卩< 〇. 01)。与辐射组相比，中剂量药物组、阳性药物组和中剂量药物对照组白细胞数明显升高 (P<0.05)，中剂量药物组淋巴细胞数明显升高(P<0.05)。低剂量、高剂量药物组和阳性药物 组白细胞数明显低于正常对照组(P<〇.05)，阳性药物组淋巴细胞数明显低于正常对照组(P <0.05)〇
[0302] (2)停药后3d，辐射组白细胞数和淋巴细胞数较正常对照组仍减少，其中辐射组白 细胞数与对照组相比明显减少(P<〇. 05)。中剂量药物组和中剂量药物对照组白细胞数与辐 射组相比均明显升高(P<〇.05)，低剂量、高剂量药物组和阳性药物组白细胞数明显低于正 常对照组(P<〇.05)，各药物组淋巴细胞数与正常对照组相比无明显差异。（3)停药后7d，各 辐射组、药物组及正常对照组之间比较，白细胞数和淋巴细胞数均无明显差异。提示，30mW/ cm 2 HPM间断辐射60min可致大鼠白细胞和淋巴细胞数明显下降，给予海藻硫酸多糖对HPM 辐射所致的大鼠血白细胞和淋巴细胞数下降有防治作用。
[0303]表1海藻硫酸多糖对HPM辐射后大鼠血白细胞和淋巴细胞数的影响
[0305] 2.大鼠红细胞数和血红蛋白浓度变化
[0306] 结果见表2。停药后ld、3d和7d，各辐射组、药物组及正常对照组之间比较，红细胞 数和血红蛋白浓度均无明显差异。提示，30mW/cm2 HPM间断辐射60min和灌胃给予海藻硫酸 多糖或普罗布考对大鼠血红细胞数和血红蛋白含量无明显影响。
[0307]表2海藻硫酸多糖对HPM辐射后大鼠红细胞数和血红蛋白浓度的影响
[0310] 3.大鼠血⑶3+、⑶4+、⑶8+淋巴细胞亚群变化
[0311] 实验结果见表3、表4。与对照组相比较，各辐射组⑶3+和⑶4+淋巴细胞在停药后Id 和3d时明显升高(P<0.05)，7d时虽仍有所升高，均未出现明显变化。各辐射组⑶8+淋巴细胞 和⑶4+/CD8+淋巴细胞比值在停药后IcU3d及7d无明显差异。与辐射组相比，低剂量、中剂量 和高剂量药物组的CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞仅在停药后7d明显升高(P<0.05或P<0.01)。 与正常对照组相比，各药物组CD3+和⑶4+淋巴细胞在停药后ld、3d和7d时明显升高（P< 0.05);阳性药物组⑶8+淋巴细胞在停药后Id时明显升高(P<0.05)，低剂量、中剂量药物组 ⑶8+淋巴细胞在停药后7d时明显升高(P<0.05);各药物组⑶4+/CD8+淋巴细胞比值在停药 后3d时明显升高(P<0.05)。本次实验的实验结果与预实验结果不同，从数据中看出，CD3+和 ⑶4+淋巴细胞的辐射组和药物组与对照组相比均出现了不同程度的升高，可能是由于微波 辐射导致的应激性反应所引起。
[0312] 表3海藻硫酸多糖对HPM辐射后大鼠血淋巴细胞CD3+、CD4+的影响
[0317]三、大鼠不同脏器氧化应激指标的变化 [0318] 1.X0D 活性
[0319] 实验结果见表5。（1)停药后ld，辐射组脑组织的XOD活性与对照组比较显著升高(P <0.Ol)，除低剂量药物组外其它药物组与辐射组相比明显升高(P<〇.05)，低剂量药物组 的XOD活性与对照组比较明显升高(P<0.05)。辐射组睾丸组织的XOD活性与对照组比较明 显升高(P<〇.05)，阳性药物组的XOD活性与对照组比较明显升高(P<0.05)，中剂量药物组 和中剂量药物对照组与辐射组相比明显减低(P<〇. 05 )，中剂量药物组和中剂量药物对照 组与阳性药物组相比均明显降低(P<〇. 05)，表明其降低HPM引起的XOD活性升高效果比阳 性药物更好。（2)停药后3d，辐射组、药物组及正常对照组之间比较，脑、肝、脾、睾丸的XOD活 性均无明显差异。（3)停药后7d，辐射组与正常对照组比较，脑和睾丸的XOD活性无明显差 异；中剂量药物组、高剂量药物组、阳性药物组和中剂量药物对照组脑组织的XOD活性与辐 射组及正常对照组相比均明显降低(P<〇.05)，中剂量、高剂量药物组睾丸组织的XOD活性 较辐射组明显降低(P<〇.05)。
[0320] 2 ·ΜΡ0 活性
[0321] 实验结果见表5。（1)停药后ld，辐射组脑和睾丸组织的MPO活性与正常对照组比较 均明显升高(P<〇. 05);中、高剂量药物组、阳性药物组和中剂量药物对照组脑组织的MPO活 性与辐射组相比明显降低(P<〇.05)，低、中剂量药物组睾丸组织的MPO活性与对照组相比 显著降低(P<〇.05)，各药物组脑和睾丸组织的MPO活性与正常对照组比较均无明显变化。 (2)停药后3d，辐射组脑的MPO活性与正常对照组相比明显升高(P<0.05)，各药物组的MPO 活性与辐射组相比均明显降低(P<〇.05或P<0.01)，与正常对照组比较无明显变化;辐射 组睾丸组织的MPO活性与正常对照组比较没有明显变化，高剂量药物组和阳性药物组与辐 射组相比明显降低(P<〇.05)，与正常对照组相比无明显变化。（3)停药后7d，辐射组、药物组 及正常对照组之间比较，脑和睾丸的MPO活性均无明显差异。
[0322] 表5海藻硫酸多糖对HPM辐射后大鼠不同脏器X0D、MP0活性的影响
L 0325」3 .SOD 活性
[0326] 实验结果见表6。（1)停药后ld，辐射组脑和睾丸组织的SOD活性与对照组相比明显 降低（P<〇.〇5)。各药物组脑组织的SOD活性与辐射组相比均明显升高（P<0.05SP< 0.01)，除低剂量药物组外各药物组睾丸组织的SOD活性与辐射组相比均显著升高（P< 0.01)。各药物组脑组织的SOD活性与正常对照组相比无明显变化，但睾丸组织的SOD活性与 正常对照组相比均明显升高（P<〇.05或P<0.01)。（2)停药后3d，辐射组脑和睾丸组织的 SOD活性与正常对照组相比仍明显降低(P<0.05)，中剂量药物组脑和睾丸组织的SOD活性 与辐射组相比明显升高（P<〇.05)，各药物组脑和睾丸的SOD活性较正常对照组无明显差 异。（3)停药后7d，辐射组脑组织的SOD活性与对照组比较仍明显降低(P<0.05)，中剂量药 物组与辐射组相比明显升高(P<〇.05);睾丸组织的SOD活性在辐射后与正常对照组相比未 发生明显变化，各药物组脑和睾丸的SOD活性较正常对照组均无明显差异。
[0327] 4 .GSH-px 活性
[0328] 实验结果见表6。（1)停药后ld，辐射组脑组织的GSH-px活性较正常对照组未发现 明显变化，低、高剂量药物组与正常对照组、辐射组、阳性药物组相比均明显升高（P< 0.05)。各辐射组、药物组及正常对照组之间比较，睾丸组织GSH-px活性均无明显差异。（2) 停药后3d，辐射组脑组织的GSH-px活性较正常对照组仍未发现明显变化，中剂量药物组和 中剂量药物对照组与正常对照组、辐射组、阳性药物组相比均明显升高(P<〇.05)。各辐射 组、药物组及正常对照组之间比较，睾丸组织GSH-px活性均无明显差异。（3)停药后7d，辐射 组脑组织的GSH-px活性较正常对照组仍未发现明显变化，高剂量药物组与辐射组和阳性药 物组相比均明显升高(P<〇.05)。各辐射组、药物组及正常对照组之间比较，睾丸组织GSH-px 活性均无明显差异。
[0329] 表6海藻硫酸多糖对HPM辐射后大鼠不同脏器S0D、GSH-px活性的影响
[0331] 5 .CAT 活性
[0332] 实验结果见表7。（1)停药后ld，辐射组睾丸组织CAT活性与正常对照组相比明显降 低(P<0.05)，中、高剂量药物组和阳性药物组的CAT活性较辐射组均明显升高(P<0.05)， 但各药物组与正常对照组和阳性药物组相比均未发生明显变化。各辐射组、药物组及正常 对照组之间比较，脑组织CAT活性均无明显差异。（2)停药后3d，辐射组脑组织的CAT活性与 正常对照组比较没有明显变化，中、高剂量药物组和阳性药物组的CAT活性较正常对照组、 辐射组均明显升高(P<〇.05)。辐射组睾丸组织的CAT活性与正常对照组相比仍明显降低(P < 0.05 )，高剂量药物组、阳性药物组和中剂量药物对照组CAT活性与辐射组相比均明显升 高(P<0.05或P<0.01 )，中剂量药物对照组CAT活性与正常对照组、阳性药物组相比均明显 升高斤<0.05)。（3)停药后7d，各辐射组、药物组及正常对照组之间比较，脑和睾丸组织CAT 活性均无明显差异。
[0333] 表7海藻硫酸多糖对HPM辐射后大鼠不同脏器CAT活性的影响(单位:U/ml)
[0335] 6 .MDA 含量
[0336] 实验结果见表8。（1)停药后ld，与正常对照组比较，辐射组脑组织的MDA含量明显 增加(P<〇. 05)，低、中剂量药物组脑组织的MDA含量与辐射组相比均明显降低(P<0.05或P <〇.〇1)，中剂量药物组脑组织的MDA含量较正常对照组、阳性药物组均明显降低（P< 0.05)。辐射组睾丸组织的MDA含量与正常对照组相比明显增加(P<0.05)，除低剂量药物组 外各药物组睾丸的MDA含量与辐射组比较均明显降低(P<0.05)，且与正常对照组无明显差 异。（2)停药后3d，辐射组脑组织的MDA含量与正常对照组相比显著增加(P<0.01)，除低剂 量药物组外各药物组脑的MDA含量与辐射组相比均明显降低(P<0.05)。辐射组睾丸组织的 MDA含量与正常对照组相比明显增加(P<0.05)，各药物组睾丸的MDA含量与辐射组相比均 明显降低(P<〇.05)，且与正常对照组无明显差异。（3)停药后7d，辐射组脑组织的MDA含量 与对照组比较仍明显升高(P<〇.05)，中剂量药物组、阳性药物组和中剂量药物对照组与辐 射组相比明显降低(P<〇.05或P<0.01)，且与正常对照组无明显差异。各辐射组、药物组及 正常对照组之间比较，睾丸组织MDA含量均无明显差异。
[0337] 7 .PCO 含量
[0338] 实验结果见表8。（1)停药后ld，辐射组脑组织的PCO含量与正常对照组比较明显增 加（P<0.05 )，除低剂量药物组外各药物组脑的PCO含量与辐射组相比均明显降低（P< 0.05)，且与正常对照组无明显差异。辐射组睾丸组织的PCO含量与正常对照组比较显著增 加(P<0.01)，除高剂量药物组外各药物组睾丸的PCO含量与辐射组相比均明显降低（P< 0.05或P<0.01)，且与正常对照组无明显差异。（2)停药后3d和7d，各辐射组、药物组及正常 对照组之间比较，脑和睾丸组织PCO含量均无明显差异。
[0339] 表8海藻硫酸多糖对HPM辐射后大鼠不同脏器MDA、PCO含量的影响
[0342] 四、大鼠海马和睾丸形态学变化
[0343] 1.组织学变化
[0344] (1)海马组织学变化
[0345] 正常对照组停药后ld_7d，大鼠大脑海马组织绝大多数神经元形态结构正常，偶见 单个神经元固缩、深染，血管周间隙轻度增宽（图2-3)。3〇1^/(^ 2 HPM间断辐射Ih后7d-14d， 海马组织变化病变基本相似，辐射后7d(停药后Id)，固缩、深染的神经元较正常对照组增 多，细胞和血管周围间隙亦较对照组增宽，细胞水肿（图4);辐射后IOd(停药后3d)，上述损 伤程度进一步加重，核固缩深染的神经元数量明显增加，细胞水肿加重，细胞和血管周间隙 明显增宽（图5);辐射后14d(停药后7d)，神经元固缩深染有所恢复，但仍见部分神经元核固 缩深染，而细胞和血管周间隙增宽未见明显减轻(图6)。
[0346] 低剂量药物组停药后Id海马组织病变与辐射组相似，但3d_7d有所减轻（图7-9); 中剂量药物组病变较辐射组明显减轻，停药后Id和3d，见散在单个神经元固缩、深染，细胞 和血管周围间隙增宽亦较辐射组减轻，细胞水肿（图10-11)，停药后7d，基本恢复正常（图 12)。高剂量药物组病变与中剂量药物组相似，但较中剂量药物组稍重（图13-14 )，停药后7d 亦基本恢复正常（图15)。
[0347] 阳性药物组海马组织病变与高剂量药物组相似（图16-17)，但停药后7d尚未完全 恢复正常（图18)。中剂量药物对照组，停药后l-7d，海马组织未见明显病变(图19-20)。
[0348] (2)睾丸组织学变化
[0349]正常对照组大鼠睾丸各级生精细胞有层次排列，生精小管界膜完整，腔内精子数 量丰富（图21)。3〇1^/〇112 HPM间断辐射Ih后7d(停药后ld)、10d(停药后3d)和14d(停药后 7d)，睾丸组织变化基本相似，但逐渐减轻，表现为睾丸周边部生精小管内生精上皮层明显 水肿，生精细胞不紧密排列，精子细胞和精子数量不同程度降低（图22)，部分生精小管腔内 及间质可见蛋白水肿液积聚（图23-24)，少数生精小管可见生精细胞变性、坏死和脱落。
[0350] 低剂量药物组与辐射组病变特点、规律和程度基本相似（图25~27);中剂量药物 组病变较辐射组明显减轻，停药后Id和3d，可见散在生精小管生精上皮层轻中度水肿，生精 细胞排列稍疏松，未见明显精子细胞和精子减少（图28-29)，偶见单个生精小管腔内及局灶 性间质可见蛋白水肿液积聚，未见生精细胞变性、坏死和脱落;停药后7d，基本恢复正常（图 30)。高剂量药物组病变与中剂量药物组相似，但较中剂量药物组稍重（图31-32 )，停药后7d 尚未完全恢复正常（图33)。
[0351] 阳性药物组睾丸组织病变与高剂量药物组相似（图34-35)，但较之稍重，停药后7d 尚未完全恢复正常（图36)。中剂量药物对照组，停药后1~7d，睾丸组织未见明显变化（图 37-38) 〇
[0352] 3.超微结构变化
[0353] (1)海马超微结构变化
[0354] 正常对照组大鼠海马颗粒细胞和锥体细胞神经元及胶质细胞可见线粒体轻度肿 胀，内质网轻度扩张，突触间隙稍模糊，血管周围间隙正常或稍增宽（图39-43)，除个别胶质 细胞轻度水肿外（图44)，其余未见明显异常。
[0355] 30mW/cm2 HPM间断辐照后7d(停药后Id)和14d(停药后7d)，海马神经元核染色质 疏松，线粒体明显肿胀、空化，溶酶体数量增多（图45);胶质细胞明显肿胀，胞浆细胞器稀疏 (图46)，突触间隙模糊（图47);血管周间隙明显增宽（图48)。
[0356] 低剂量药物组停药后ld，海马组织超微结构变化与辐射组相似，但较之稍重。颗粒 细胞神经元线粒体肿胀、空化，溶酶体数量增加，内质网和高尔基体轻度扩张（图49)，或颗 粒细胞明显肿胀，褪变（图50)，或染色质凝集边移，呈细胞凋亡（图51);锥体细胞线粒体明 显肿胀，出现噬神经细胞现象(图52)。突触间隙模糊(图53);血管周间隙中度增宽（图54)。
[0357] 中剂量药物组停药后Id和7d，海马组织超微结构变化较辐射组明显减轻，与正常 对照组无明显差异。颗粒细胞神经元少数线粒体轻度肿胀（图55-56)，锥体细胞少数线粒体 较明显肿胀、灶性空化（图57)，胶质细胞形态结构正常（图58)，突触间隙稍模糊（图59)，血 管周间隙轻度增宽或正常（图58,60)。
[0358] 高剂量药物组停药后Id和7d，与中剂量药物组相似，但Id较中剂量药物组稍重，颗 粒细胞神经元线粒体较明显肿胀、空化（图61);锥体细胞线粒体较明显肿胀、空化，内质网 和高尔基体不同程度扩张，出现噬神经细胞现象（图62);突触间隙稍模糊（图63);血管周间 隙轻度增宽（图64)。停药后7d上述病变明显减轻，颗粒细胞和锥体细胞见少数或部分线粒 体肿胀、空化(图65-66)，胶质细胞和血管周围间隙基本恢复正常。
[0359] (2)睾丸超微结构变化
[0360]正常对照组停药后Id和7d，大鼠睾丸生精小管结构正常，少量生精细胞、Leydig细 胞和sertoli细胞可见线粒体轻微肿胀、内质网和高尔基体轻微扩张（图67-69)。
[0361] 30mW/cm2 HPM间断辐照后7d(停药后Id)和14d(停药后7d)，精原细胞周围水肿，细 胞间隙增宽，核染色质凝聚、边移（图70)，核膜模糊、褪变(图71)，线粒体中度肿胀、空化;精 子细胞和精母细胞线粒体肿胀、空化明显，内质网扩张，可见精母细胞和精子细胞褪变和坏 死(图72-75);成熟精子头部形态基本正常（图76)。
[0362] 低剂量药物组停药后ld，睾丸组织超微结构变化与辐射组相似，但程度稍轻。精原 细胞核染色质凝聚、边移（图77)，线粒体呈轻度肿胀、灶性空化;精母细胞和精子细胞线粒 体明显肿胀、空化（图78)，未见精母细胞和精子细胞褪变和坏死;成熟精子头部形态亦正常 (图79);但可见间质Ley dig细胞染色质凝集边移（图80)。
[0363] 中剂量药物组停药后Id和7d，大多数精原细胞结构基本恢复正常，仅少量细胞可 见线粒体轻微肿胀，精母细胞和精子细胞线粒体轻微肿胀、空化，但较辐射对照组减轻（图 81-82 )，偶见精原细胞核染色质凝聚（图83 )，未见精母细胞和精子细胞坏死;成熟精子头部 形态基本正常（图84) Aertoli细胞和间质Leydig细胞结构基本正常，偶见线粒体轻微肿 胀，内质网轻微扩张。
[0364] 高剂量药物组停药后Id和7d，与中剂量药物组病变相似，但较之稍重，大多数精原 细胞结构基本正常，可见线粒体轻度肿胀，内质网轻度扩张（图85)，少数精原细胞核染色质 凝聚、边移（图86-87)，部分精母细胞和精子细胞线粒体较明显肿胀、空化（图85,88)，未见 精母细胞和精子细胞坏死；成熟精子头部形态基本正常（图89-90) Aertoli细胞和间质 Leydig细胞结构基本正常，可见部分线粒体轻微肿胀，内质网轻微扩张。
[0365] 通过实验研究发现，脑和睾丸对高功率微波辐射致氧化应激损伤更为敏感。脑在 生命活动过程中需要较多的能量，能量消耗过程中会产生一定量的R0S，而相应的抗氧化酶 含量又较低，从而使其易受到ROS的攻击;脑组织神经元膜结构富含多不饱和脂肪酸，易受 到机体自由基的攻击;神经元内Ca 2+流通性较高，当受到外界损伤易造成细胞内钙超载，这 些因素都会造成中枢神经系统氧化应激。而睾丸血液供应相对比较贫乏，而生殖细胞增殖、 分化能力较强，DNA不断地进行解螺旋、复制等过程，使能量代谢相关酶、凋亡相关蛋白、DNA 等容易收到各种理化因素的影响。因此，睾丸组织易被微波辐射损伤。
[0366] -、海藻硫酸多糖对微波辐射致脑和睾丸组织学和超微结构损伤的防治作用
[0367] 病理形态学变化是研究机体组织、器官受外界刺激后损伤程度必不可缺的部分， 具有较高的准确性和客观性。马迪等采用30mW/cm 2微波辐射Wistar大鼠15min，14d后发现 大部分海马神经元核固缩、深染，血管周间隙明显增宽；超微结构上发现神经元线粒体肿 胀、空化，嵴断裂或溶解，突触囊泡堆积，突触间隙模糊不清。吕士杰等分别采用lOOmW/cm 2、 200mW/cm2微波福射Wi star大鼠5min，发现100mW/cm2组在福射后611组神经元损伤较轻，48h 后胞浆空泡化，线粒体肿胀、空化。200mW/cm2辐射后6h，核膜粗糙，线粒体肿胀、空化明显； 48h后核膜破裂，线粒体嵴缺失，染色质溶解。郭国祯等采用2450MHz微波辐射BALB/c小鼠睾 丸15min，发现生精细胞不同程度的浊肿，坏死和脱落，精原细胞水肿，精母细胞变性、脱落， 精子数量减少。
[0368] 本发明实验结果与上述结果类似，30mW/cm2HPM辐射引起海马神经元固缩、深染和 水肿，血管周围间隙明显增宽；睾丸周边部生精小管内生精上皮层明显水肿，精子细胞和精 子不同程度减少;超微结构见辐射组海马神经元和胶质细胞水肿，线粒体明显肿胀、空化， 突触间隙模糊，血管周间隙明显增宽；睾丸精原细胞核染色质凝聚、边移或褪变，精母细胞 和精子细胞线粒体明显肿胀、空化，可见精母细胞和精子细胞褪变和坏死。微波辐射后7d可 观察到上述变化，辐射后IOd损伤加重，Hd后有所缓解。
[0369] 本发明实验结果表明，各剂量药物组对微波辐射致海马和睾丸损伤均有一定的治 疗作用。其中，50mg/kg/d药物组防治作用效果最好。
[0370]二、海藻硫酸多糖对微波辐射致脑和睾丸氧化应激损伤的防治作用
[0371] 活性氧是机体代谢活动的中间产物，它可以攻击脂类、蛋白质和DNA等，导致丙二 醛、蛋白质羰基含量升高，DNA断裂，进而引起组织细胞受损;还可以与SODXAT等抗氧化酶 作用，降低抗氧化酶活性。因此，本发明通过检测脑、睾丸组织氧化应激中间产物含量和一 些抗氧化酶的活性，按照自由基生成相关酶-抗氧化酶-自由基代谢产物的顺序，系统地从 氧化应激的角度来评价微波辐射对脑、睾丸组织的损伤效应。
[0372] ( - )微波辐射致脑和睾丸自由基生成酶活性的影响
[0373] 黄嘌呤氧化酶(XOD)是机体核苷酸的代谢酶，它能够催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，进 一步生成尿酸;还能够直接催化黄嘌呤生成尿酸，并伴随着超氧阴离子自由基、氢自由基和 过氧化氢的产生。髓过氧化物酶(MPO)是血红素辅基的血红素蛋白酶，存在于髓系细胞的嗜 苯胺蓝颗粒中。MPO可以利用过氧化氢和氯离子产生次氯酸盐，并形成具有氧化能力的自由 基。由此可见，XOD和MPO在自由基的生成中起着重要作用。
[0374] 本发明的实验中，脑组织XOD(辐射后Id)、MP0(辐射后Id、3d)和睾丸组织XOD(辐射 后Id)、MP0(辐射后Id)均明显升高，表明HPM可以引起部分自由基生成相关酶活性升高，进 而引起机体自由基含量升尚。
[0375] (二)微波辐射致脑和睾丸抗生成酶活性的影响
[0376] 超氧化物歧化酶(SOD)是机体氧化损伤潜在的诱导物并且在多种生理和病理过程 中扮演着重要的角色，如细胞凋亡、细胞周期阻滞等，它可以清除超氧化物自由基，减少其 对机体造成的损伤。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)在生物体中主要起脱毒作用，主要功能 是将脂类过氧化物还原为无毒的羟基化合物，还原游离的过氧化氢，同时催化谷胱甘肽，从 而保护细胞膜结构和功能完整。过氧化氢酶(CAT)是一种广泛存在于各类生物体中的酶，是 一类抗氧化剂，其作用是催化过氧化氢转化为水和氧气，防止其对机体造成损害。活性氧 (ROS)在细胞代谢中的消除途径如图91所示。
[0377] 本发明的实验中，脑组织SOD(辐射后Id、3d、7d)和睾丸组织SOD(辐射后Id、3d)、 CAT (辐射后Id、3d)均明显降低，表明HPM可以降低部分抗氧化酶活性，导致机体ROS清除速 率降低。
[0378] (三)微波辐射对脑和睾丸自由基代谢产物含量的影响
[0379] 丙二醛(MDA)是机体脂质过氧化作用的终产物，会引起蛋白质、核酸等物质聚合， 加剧膜损伤并影响线粒体呼吸链及线粒体内关键酶活性，MDA含量的变化可间接反应机体 自由基含量的变化。蛋白质羰基(PCO)是蛋白质氧化损伤的产物，是评价蛋白质总氧化水平 的常用指标。因为机体蛋白质种类繁多，分布广泛，故极易受到活性氧攻击，导致蛋白质结 构和构象的改变，最终导致蛋白质失活。
[0380] 本发明的实验中，脑组织MDA(辐射后1(1、3(1、7(1)、？0)(辐射后1(1)和睾丸组织1?从 (辐射后Id、3d )、PC0(辐射后Id)均明显升高，表明HPM可以增加机体自由基产物的含量，增 加对机体的损伤。
[0381 ](四）海藻硫酸多糖对微波辐射对脑和睾丸氧化应激损伤的防治作用
[0382] 本发明的实验通过使用三种不同剂量海藻硫酸多糖进行实验，结果表明中剂量药 物组(50mg/kg/d)的防治作用最好，主要表现在脑组织XOD活性(停药后ld、7d)、MP0活性(停 药后ld、3d)、MDA含量(停药后ld、3d、7d)和PCO含量(停药后Id)较辐射组明显降低，SOD活性 (停药后ld、3d、7d)明显升高。睾丸组织XOD活性(停药后ld)、MP0活性(停药后ld)、MDA含量 (停药后ld、3d)和PCO含量(停药后Id)较辐射组明显降低，SOD活性(停药后ld、3d)、CAT活性 (停药后Id)明显升高。
[0383] 通过本部分实验研究，我们明确了海藻硫酸多糖对HPM辐射损伤防治作用的有效 剂量。同时，海藻硫酸多糖可降低X〇D、MPO等自由基生成相关酶活性，增加 S0D、CAT等抗氧化 酶活性，降低MDA、PC0等自由基代谢产物含量，为其防治HPM所致机体氧化损伤的机制之一。
[0384] 实验结论：
[0385] 一、30mW/cm2HPM辐射可导致大鼠免疫功能降低，主要表现为白细胞和淋巴细胞数 量下降，其它免疫指标无明显变化。
[0386] 二、30mW/cm2HPM辐射可以引起大鼠脑和睾丸不同程度的形态学损伤，主要表现在 神经元固缩深染、生精上皮细胞水肿。各药物组可以缓解上述损伤，其中，中剂量药物组效 果最好。
[0387] 三、30mW/cm2HPM辐射可以引起大鼠脑和睾丸不同程度的氧化应激损伤，主要表现 在MPO和XOD活性升高，SOD和CAT活性降低，MDA和PCO含量升高。
[0388] 四、各给药剂量的海藻硫酸多糖均可不同程度地防治30mW/cm2HPM辐射致大鼠免 疫功能降低和大鼠不同脏器的氧化损伤。其中，中、高剂量药物组防治作用接近，二者的防 治作用比低剂量药物组效果更好，证明中剂量(50mg/kg/d)药物组是其最佳给药浓度。
[0389] 五、海藻硫酸多糖中、高药物组某些检测指标优于普罗布考阳性药物组，表明其具 有良好的抗氧化作用。
【主权项】
1. 一种海藻硫酸多糖的应用，其特征在于，所述海藻硫酸多糖在防治微波辐射方面的 应用。2. 根据权利要求1所述的海藻硫酸多糖的应用，其特征在于，所述硫酸海藻多糖在制备 防治微波辐射的药物上的应用。3. 根据权利要求1或2所述的海藻硫酸多糖的应用，其特征在于，所述微波辐射中微波 为频率2-4GHz、波长为150-75.00mm的S波段微波。4. 根据权利要求3所述的海藻硫酸多糖的应用，其特征在于，所述微波为频率2.856GHz 的微波。5. 根据权利要求4所述的海藻硫酸多糖的应用，其特征在于，所述微波平均功率密度为 30mW/cm2，峰值功率密度为200mW/cm 2，脉冲频率为300pps，脉宽为500ns。6. 根据权利要求1所述的海藻硫酸多糖的应用，其特征在于，所述海藻多糖的提取方法 包括以下步骤： (1) 将海带置入于其自身质量38 - 42倍的水中浸泡35 - 45分钟后，用于其自身质量 38 - 42倍量的水冲洗干净； (2) 对海带进行预处理，剔除叶黄、叶碎和发霉的不合格海带，将合格海带切成面积7 - 10平方厘米的碎片； (3) 将海带加入到于其自身质量9 - 11倍的水中煎煮三次，分别为1.9 - 2.1小时、1.4 - 1.6小时、1.4 一 1.6小时； (4) 将三次煎煮液合并后减压浓缩至相对密度1.05 - 1.15得浓缩液I; (5) 向浓缩液I中加入乙醇至乙醇体积浓度29 - 31 %，静置过夜后离心得上清液和沉 渣； (6) 对沉渣进行检测，若沉渣中S〇42^的质量百分含量大于5 %，向沉渣中加入乙醇至乙 醇体积浓度29 - 31%，静置至分层后离心得上清液;若沉渣中S04i的质量百分含量小于等 于5%，弃沉渣； (7) 将步骤S50及步骤S60中的上清液合并，减压浓缩至相对密度1.1一 1.2得浓缩液II; (8) 向浓缩液II中加入乙醇至乙醇体积浓度83 - 86%，静置过夜后，弃上清液，沉淀用 体积百分数74 - 76%的乙醇洗涤后离心； (9) 将离心后的沉淀用7 - 9倍量的水溶解后进行喷雾干燥得海藻硫酸多糖。7. 根据权利要求6所述的海藻硫酸多糖的应用，其特征在于， 步骤（1)中将海带置入于其自身质量40倍的水中浸泡40分钟后，用于其自身质量40倍 量的水冲洗干净； 步骤(2)中，将合格海带切成面积9平方厘米的碎片； 步骤（3)中，将海带加入到于其自身质量10的水中煎煮三次，分别为2小时、1.5小时、 1.5小时； 步骤(4)中，将三次煎煮液合并后减压浓缩至相对密度1.1得浓缩液I; 步骤(5)中，向浓缩液I中加入乙醇至乙醇体积浓度30%，静置过夜后离心得上清液和 沉渣； 步骤(6)中，若沉渣中S04i的质量百分含量大于5%，向沉渣中加入乙醇至乙醇体积浓 度30%，静置至分层后离心得上清液。 步骤(7)中，将步骤S50及步骤S60中的上清液合并，减压浓缩至相对密度1.17得浓缩液 II。 步骤(8)中，向浓缩液II中加入乙醇至乙醇体积浓度85%，静置过夜后，弃上清液，沉淀 用体积百分数75%的乙醇洗涤后离心。 步骤(9)中，将离心后的沉淀用8倍量的水溶解后进行喷雾干燥得海藻硫酸多糖。
【文档编号】A61P39/00GK105963325SQ201610298717
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】王长振, 王水明, 郑文, 胡向军, 周红梅, 王丽峰, 李杨, 徐新萍, 邹勇, 苏慧婷, 智维佳, 张潇
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所