专利名称：狗肿瘤坏死因子14基因和蛋白质制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及肿瘤坏死因子14 (TNFSF14或LIGHT)cDNA的克隆、表达及蛋白纯化技术。
背景技术：
鉴于肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员具有促进细胞生长、分化或死亡的功能，在淋巴器官的形成，免疫细胞的激活及维持机体的稳态等方面都发挥重要的生物学作用，所以近年来，越来越多的TNFSF家族成员被发现。LIGHT是1997年发现的肿瘤坏死因子超家族第14号成员，又名TNFSF-14或HVEM-L，240aa的分子量约为29kD的II型跨膜蛋白，拥有典型的TNF同源结构域。它的受体主要有三个TR2 / HVEM、LTBR、及TR6，通过不同的受体来介导不同的生物学效应，参与免疫系统的发育、通过CD28非依赖的途径刺激T细胞的活化并促进其生长分化和细胞因子的分泌以及肿瘤细胞的凋亡诱导过程，在肿瘤免疫、 自身免疫病、移植物抗宿主病(GVHD)和抗病毒感染中都发挥重要的作用。另外，LIGHT还具有活化和诱导DC细胞成熟的功能。LIGHT作为在人体免疫系统中起重要调控作用的一种特异的细胞因子，其与受体的相互作用涉及很多疾病，如类风湿性关节炎、炎症性肠炎、胰岛素依赖性糖尿病、脂质代谢等等，因此对LIGHT的研究将有助于对免疫缺陷疾病进行治疗，具有重要的理论意义和临床医学应用价值。犬，通常指家犬，也称狗，一种常见的犬科哺乳动物。通常被称为“人类最忠实的朋友”，保护国家、人民的财产安全，是饲养率最高的宠物，在刑侦方面也具有重要应用价值。随着人们生活水平的提高，宠物狗也逐渐与人们的生活息息相关。因此，狗相关疾病的预防及控制已成为大家关心的问题。另外，早在1950年,美国就推荐小猎兔犬(beagle dog)为实验用犬，适合于生物医学各个学科的研究，并为世界各国所公认，在实验外科学研究、基础医学研究、慢性实验研究、药理学毒理学及药物代谢的研究等方面都具有重要作用。因此，对于狗LIGHT基因的研究不论对于犬类还是人类都具有重大意义。根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前人、鼠LIGHT cDNA已被克隆，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，而至今狗LIGHT的cDNA还未被克隆出来，关于狗LIGHT基因(dog LIGHT，简称dLIGHT)的研究在整个国内外还处于完全空白状态。因此，我们对于狗基因的研究有重要意义。
发明内容
本发明提供一种从狗中获得肿瘤坏死因子14 (LIGHT)基因和蛋白质制备技术。本发明所述狗肿瘤坏死因子14 (LIGHT) cDNA，序列如SEQ ID NO. I所示。本发明的狗LIGHT cDNA的克隆方法如下
(1)提取狗脾脏细胞的总RNA，TransgencDNA逆转录试剂盒转录为第一链cDNA ;
(2)根据狗的基因组设计嵌套引物
正义寡核苷酸引物dLIGHT-Fl :5’ - ATCTGCTCAGGCATGGAGGA-3’ (SEQ ID NO. 5)反义寡核苷酸引物dLIGHT-Rl :5，- TCTGTCAGACCCCCATTCAGT-3，(SEQ ID NO. 6) 正义寡核苷酸引物dLIGHT-F2 :5’ - CAGCATCATCGATGGAGGA-3’ (SEQ ID NO. 7)
反义寡核苷酸引物dLIGHT-R2 :5’ - TCACACCATGAAAGCCCCAAAG-3’ (SEQ ID NO. 8)
(3)应用RT-PCR方法，以上述dLIGHT-Fl及dLIGHT-Rl为引物，进行第一轮PCR。然后以第一轮扩增出的产物为模板，再以上述dLIGHT-F2及dLIGHT-R2为引物，扩增出一段序列；
(4)将上述所得到序列克隆入PMD19-T载体，并进行碱基序列测定，得到编码区全长cDNA序列。本发明还公开了狗肿瘤坏死因子14，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。狗肿瘤坏死因子LIGHT的cDNA可通过现有基因工程的方法，将该基因的胞外功能 区克隆连到PET43. Ia质粒中并转到大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达，本发明通过多次预表达摸索出了合适的表达条件(主要通过控制IPTG的浓度、培养温度、转速等)，超声破碎后收集上清，通过Ni+亲和纯化，梯度洗脱之后我们得到狗pET43. la-dsLIGHT融合蛋白，并进行 Western-blot 鉴定。
图I dLIGHT的全长cDNA碱基序列及对应编码氨基酸序列。图2狗与不同物种的LIGHT全长氨基酸序列同源性比较图。其中框起来的代表保守的两个半胱氨酸残基，阴影部分代表的是金属酶切位点，下划线的部分为跨膜区。图3 pET43. la-dsLIGHT表达载体的构建。图4 SDS-PAGE分析pET43. la-dsLIGHT在大肠杆菌中的表达
I Marker; 2重组蛋白非诱导；3重组蛋白诱导20h ;4纯化后蛋白pET43. la-dsLIGHT ；5 western blotting 鉴定结果。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例I
狗肿瘤坏死因子14 (LIGHT) cDNA的获得，实验材料购自江苏红太阳农场。(I)提取总RNA :应用RNA抽提试剂(TIANGEN)按照其操作手册提取狗脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。Transgen cDNA逆转录试剂盒转录为第一链cDNA。(2)RT-PCR:以上述dLIGHT-Fl和dLIGHT-Rl为第一轮引物进行PCR扩增，然后以第一次PCR的产物作为第二次PCR的模板，以dLIGHT-F2和dLIGHT_R2为第二轮引物得到723bp的全长cDNA序列。
①逆转录
在DEPC处理的I. 5ml Eppendorf管中依次加入总RNA抽提物3 μ 1，Oligo d(T) 18(O. 5 μ g/ μ I) I μ 1, 2 X TS Reaction Mix 10 μ 1，DEPC 水 5 μ 1，TransScript RT/RIEnzyme Mix I μ I ；42。C 孵育 30min，85。C 加热 5min 失活 TransScript RT。将得到的cDNA分装后-20° C保存。② PCR
利用逆转录所得模板进行PCR,体系为25μ Ι,ΙΟμπιοΙ/L上、下游引物各1μ 1，2. 5mmol/L dNTP 4 μ I, 2XGC buffer II 12. 5 μ 1，cDNA 模板 I. 5 μ 1，酶 0· 3 μ 1，加ddH20 4. 7 μ I0 两次 PCR 的反应程序均为95。C 5min，(95。C 30s, 56° C 30s, 72° Clmin), 30个循环，最后72 ° C延伸lOmin。反应完成后将产物于1%琼脂糖凝胶中电泳分离，用胶回收试剂盒回收得到约723bp的DNA条带，克隆入pMD19-T载体(TaKaRa，Japan)，经含Amp抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转化子，挑出阳性克隆送往上海英骏测序公司进行喊基序列测定，其全长cDNA序列如SEQ ID NO. I所不,编码的蛋白的氣基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。(3)同源检索将所得序列向http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/提交克隆得到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库进行相似性搜索及同源性分析。经ClustalW软件做同源比对发现它具有一般物种LIGHT基因所具有的两个保守半胱氨酸(cys)以及TNF家族同源结构域，所以可以确定该序列是狗LIGHT的全长cDNA。同源比对结果如图2所示。实施例2
狗LIGHT重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达
根据实施例I中获得的狗LIGHT的全长cDNA序列设计引物dsLIGHTl和dsLIGHT2。其中dsLIGHTl的5’端具有酶切位点，dsLIGHT2的5’端具有Viz7i////酶切位点。以狗脾脏组织提取的RNA逆转录到得的第一链cDNA为模板进行PCR扩增，以dsLIGHTl和dsLIGHT2为引物进行PCR，扩增该基因可溶区，如SEQ ID NO. 3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDN0.4 所示。反应体系为2 X GC Buffer II 12. 5 μ I, dNTP (2. 5 mM)4 μ I, dsLIGHTl (10μ mol/L) I μ l，dsLIGHT2(10 μ mol/L) I μ 1,Η20 4. 7 μ l,cDNA I. 5 μ l,pfu Taq O. 3μ I。反应条件如下95 ° C 5 min, (95 ° C 30 S，56 ° C 30 S，72 ° Cl min)，30 个循环，最后72 ° C延伸7 min，之后将PCR产物割胶回收，回收产物用切，pET43. Ia载体(Novagen，USA)也进行相同双酶切，T4 DNA Ligase连接，得到图3所示的重组质粒PET43. la-dsLIGHT (d代表dog ；s代表该基因胞外可溶功能区soluble)，连接产物转化疋coli DH5a中，获得含pET43. la-dsLIGHT重组菌株。挑选阳性重组菌株，扩大培养提取PET43. la-dsLIGHT重组质粒，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，挑选阳性菌株诱导表达。引物序列如下
dsLIGHTl: CGCGGATCC CTGACTCAAGAGCGGAGGTC (SEQ ID NO. 9)dsLIGHT2: CCCAAGCTT TCACACCATGAAAGCCCCAAA (SEQ ID NO. 10)
经过多次预表达实验，细菌培养到0D_ O. 6时开始诱导，IPTG终浓度为O. 2 mM,诱导温度16°C,转速120 rpm诱导20 h,目的蛋白多以可溶形式表达。4 °C,8000 rpm离心收菌，冰上超声破碎(160 W，工作4 S，暂停8 S，共120次)表达菌体，4 °C，12，500 X g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，收集上清过Ni+-NTA柱。简要过程是Binding Buffer(20 mmol/L Imidazole, 0. 5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl, pH 8. 0)平衡 Ni+-NTA 柱后，将含有可溶性重组蛋白的上清缓慢上样，上样结束后先用Washing buffer (20 mmol/LImidazole, 0. 5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl, pH 8. 0)洗去杂蛋白，再用不同浓度的咪唑Tis HCl洗脱，目的蛋白主要在洗脱浓度为250 mmol/L Imidazole, 0. 5 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris HCl, pH 8. O洗脱下来。分管收集洗脱目的蛋白，20 mmol/L Tris HCl透析过夜除盐。SDS-PAGE检测各收集管蛋白纯度，紫外分光光度计测定蛋白浓度。如图4(条带4)所示，表达得到的目的蛋白经Ni+-NTA柱纯化得到纯度达95%的目的蛋白。Western 印记分析
Western-blot中所用一抗为鼠抗His6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG。其简要步骤是将样品先进行SGS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上,用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5%脱脂奶粉室温封闭Ih,与一抗孵育lh，与HRP标记的二抗IgG孵育lh，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。 结果如图3 (条带5)所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。实施例3
将实施例I获得的狗LIGHT cDNA通过现有基因工程方法，生产重组狗LIGHT蛋白，作为犬类免疫增强剂，从而提高这些物种抗微生物和病毒感染的能力。实施例4
将实施例I获得的狗LIGHT cDNA通过现有基因工程方法，转入动物体内，增加其免疫力，在饲养中应用。按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰狗肿瘤坏死因子14基因并用于所述研究和生产。
权利要求
1.狗肿瘤坏死因子14CDNA，其特征在于它的序列如SEQID NO. I所示。
2.—种权利要求I所述的狗肿瘤坏死因子14cDNA的克隆方法如下 (1)TRIzol法提取狗脾脏总RNA，逆转录为cDNA第一条链； (2)根据狗的基因组设计嵌套引物 正义寡核苷酸引物dLIGHT-Fl :5’ - ATCTGCTCAGGCATGGAGGA-3’ 反义寡核苷酸引物dLIGHT-Rl :5’ - TCTGTCAGACCCCCATTCAGT-3’ 正义寡核苷酸引物dLIGHT-F2 :5’ - CAGCATCATCGATGGAGGA-3’ 反义寡核苷酸引物dLIGHT-R2 :5’ - TCACACCATGAAAGCCCCAAAG-3’ (3)通过RT-PCR方法，以上述引物两对引物，扩增出723bp的片段； (4)将上述引物的PCR扩增产物，克隆入PMD19-T载体，并进行测序碱基序列测定；得到了狗LIGHT基因的全长cDNA序列。
3.狗肿瘤坏死因子14，其特征在于它的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.一种重组表达载体pET43. la-dsLIGHT的构建方法，其特征在于是根据权利要求I所述狗肿瘤坏死因子HcDNA序列设计引物dsLIGHTl和dsLIGHT2，进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO. 3所示的狗LIGHT基因胞外可溶区，将PCR产物割胶回收，回收产物和pET43. Ia豫体觅BamHI琳HindIII双酶切，T4 DNA Ligase连接酶切后的载体和PCR产物，得到pET43. la-dsLIGHT ;所述引物 dsLIGHTl 和 dsLIGHT2 序列分别如 SEQ ID NO. 9 和 SEQ IDNO. 10所示。
5.一种权利要求I所述的狗肿瘤坏死因子14cDNA的重组应用，是通过现有基因工程方法，生产重组狗肿瘤坏死因子14蛋白，作为犬类免疫增强剂。
全文摘要
狗肿瘤坏死因子14(TNFSF14/LIGHT)基因和蛋白质制备及应用,涉及生物基因工程领域。狗肿瘤坏死因子14具有SEQIDNO.1所示的序列。其克隆方法如下TRIzol法提取狗脾脏总RNA并进行逆转录；根据狗基因组序列设计嵌套引物进行两次PCR扩增，获得723bp的扩增片段，经测序为狗肿瘤坏死因子LIGHT的全长序列。将胞外可溶段连接到pET43.1a原核质粒中并转到大肠杆菌BL21(DE3)中表达，Ni+-NTA柱纯化后得到的重组蛋白His6-dsLIGHT。所述的狗肿瘤坏死因子14(LIGHT)的cDNA可通过现有基因工程的方法，生产重组dLIGHT，用于进一步的研究。
文档编号C07K14/525GK102864155SQ20121035876
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者张双全, 刘霞 申请人:南京师范大学