专利名称：石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列，更具体涉及一种从石斑鱼垂体的SMART cDNA文库中筛选出的一个原肠期开始特异表达的胚胎发育调控因子1(Gastrula specific embryonic regulator 1，gerl)的序列、氨基酸序列、时空表达图谱，本发明还涉及一种用途。
背景技术：
石斑鱼(E.coioides)为海洋珊瑚礁鱼类，属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，是一种名贵的海水鱼类，销售市场稳定、价格昂贵，同时石斑鱼也是人工繁殖与育苗技术难度最大的海产鱼类之一，至今养殖种苗的供应仍依赖捕捞野生天然苗。近年来，日本、东南亚各国、我国台湾、华南沿海都进行了大规模的人工养殖。随着海洋鱼类人工规模化养殖不断发展，天然苗种已不能满足养殖生产的需要，人工育苗成为其持续发展的关键技术。尽管已进行了一些初步的繁殖生物学研究，但对人工育苗的理论基础---生殖调控的研究才刚刚起步、基础十分薄弱。据张其永等2000年统计，我国已成功繁殖培育出幼苗鱼苗的石斑鱼种类有赤点石斑鱼、鲑点石斑鱼、点带石斑鱼、石斑鱼等。但实际上它们离能够较稳定地进行种苗批量生产的目标尚有相当的差距。
石斑鱼人工繁殖与育苗的难度主要来自以下几个方面(1)石斑鱼雌雄同体，雌性先熟，然后性转化；(2)受精卵质量差，孵化率低；(3)仔鱼个体纤细，对开口饵料的要求严格；以及稚、幼鱼的自相残杀习性、病害等问题。胚胎发育不仅仅是一个复杂而有趣的生命现象，而且是一个高度精确、程序化的过程。在早期胚胎发育调控过渡期间出现了诸多的变化，其中最关键的无疑是合子型基因的表达。目前尚未克隆分离到调控石斑鱼胚胎发育的基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列，氨基酸序列和时空表达图谱，筛选方法简便。该基因为一具有跨膜区的分泌蛋白，在原肠期开始转录。
本发明还涉及一种石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列在石斑鱼人工育苗中的应用。
本发明还涉及一种石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列在饲料添加剂中的应用。
为了实现上述任务，本发明采用了以下技术措施本发明所述的gerl是从石斑鱼垂体的SMART cDNA质粒文库中筛选到的一个新基因，在随机筛选并测序的90个克隆中，共检测到该基因的2个克隆。其特征是基因gerl cDNA序列和基因gerl编码蛋白的氨基酸序列(如下)。该基因的cDNA长514bp，有一个252bp(54-305)的开放阅读框，编码83个氨基酸，5′非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元；3′非编码区长209bp，有多聚腺苷酸加尾信号(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中进行同源搜索，发现与其它基因无任何同源性，为一新基因。
通过Signal P程序对其蛋白存在信号肽的可能性进行了分析，发现其N-端的22个氨基酸肽段极可能为信号肽，其信号肽酶的可能切割位点位于第22位和23位氨基酸之间，提示该蛋白为分泌型蛋白(图1)；采用DAS软件分析其跨膜结构，显示该蛋白在对应信号肽位置存在跨膜区(图2)。
运用RT-PCR技术考察了其在石斑鱼肝脏、肾脏、脾脏、胰脏、心、肌、垂体、下丘脑、端脑、小脑、中脑、延脑的mRNA水平，考察了其在处于卵子发生期、卵母细胞成熟期、变性期不同阶段石斑鱼个体的脑垂体、下丘脑及成熟卵巢和处于变性期的性腺的表达图谱，考察了其在未受精卵、桑椹期、高囊胚期、原肠中期、胚体期、视泡期、心跳期、出膜前期、出膜后、鱼苗1天的表达图谱，结果表明该基因在肝、肾、垂体和下丘脑中大量转录，在脾和胰中有微量转录，在心、肌、端脑、小脑、中脑和延脑中没有检测到其mRNA的存在(图3)；该基因仅在处于卵子发生期的垂体和下丘脑中有大量转录，而在卵母细胞成熟期和变性期的2种垂体和下丘脑，及其成熟卵巢和处于变性期间的性腺都未检测到其mRNA的存在(图4)。该基因从原肠中期开始转录，在视泡期表达达到饱和，直至鱼苗1天都无差异(图5)。
胚胎发育不仅仅是一个复杂而有趣的生命现象，而且是一个高度精确、程序化的过程。在早期胚胎发育调控过渡期间出现了诸多的变化，其中最关键的无疑是合子型基因的表达。gerl基因在原肠中期开始检测到其转录本，一直持续到在卵子发生期的肝、肾、垂体和下丘脑中有大量转录，但在在卵母细胞成熟期和变性期的2种垂体和下丘脑，及其成熟卵巢和处于变性期间的性腺都未检测到其mRNA的存在，这说明该基因在早期发育阶段具有重要功能。通过制备该基因的原核表达蛋白和真核酵母表达蛋白，用于研究该基因在石斑鱼的人工育苗中的作用。通过制备该基因的真核酵母表达蛋白，在饲料添加剂中的应用。
本发明的优点是鉴于gerl基因是全新基因，目前人类对此基因的认识和了解仅限于本发明人所作的科学工作研究。由于该基因为具有跨膜区的分泌型蛋白，在原肠中期开始检测到其转录本，一直持续到在卵子发生期的肝、肾、垂体和下丘脑中有大量转录，但在在卵母细胞成熟期和变性期的2种垂体和下丘脑，及其成熟卵巢和处于变性期间的性腺都未检测到其mRNA的存在，这说明该基因在早期发育阶段具有重要功能。因此该基因的研究可用于通过制备该基因的蛋白，用于研究该基因在石斑鱼的人工育苗中的作用。
图1为Signal P程序分析显示出的基因gerl的信号肽位置图1表明通过Signal P程序对其蛋白存在信号肽的可能性进行了分析，发现其N-端的22个氨基酸肽段极可能为信号肽，其信号肽酶的可能切割位点位于第22位和23位氨基酸之间，提示该蛋白为分泌型蛋白；图2为DAS推测基因gerl的跨膜区图2表明采用DAS软件分析其跨膜结构，显示该蛋白在对应信号肽位置存在跨膜区。
图3为RT-PCR检测基因gerl在石斑鱼组织中的表达图3表明该基因在肝、肾、垂体和下丘脑中大量转录，在脾和胰中有微量转录，在心、肌、端脑、小脑、中脑和延脑中没有检测到其mRNA的存在。
图4为RT-PCR检测基因gerl在处于卵子发生期(1)、卵母细胞成熟期(2)、变性期(3)不同阶段石斑鱼个体的脑垂体、下丘脑及成熟卵巢和处于变性期的性腺中的表达图4表明该基因仅在处于卵子发生期的垂体和下丘脑中有大量转录，而在卵母细胞成熟期和变性期的2种垂体和下丘脑，及其成熟卵巢和处于变性期间的性腺都未检测到其mRNA的存在。
图5为RT-PCR检测基因gerl在石斑鱼胚胎发育过程中的表达图5表明该基因从原肠中期开始转录，在视泡期表达达到饱和，直至鱼苗1天都无差异。
具体实施例方式
1、RNA的提取和SMART cDNA质粒文库的构建垂体总RNA用SV Total RNA Isolation System(Promega)提取，步骤具体如下取约500克石斑鱼1尾，麻醉放血，开颅取出下丘脑，加入175μl的抽提缓冲溶液，充分匀浆后，加入350μlRNA稀释缓冲液，混匀后70℃封阻3分钟，14000×g离心10min。转移上清，加入200μl95％乙醇，吹打混匀后转移至离心柱，14000×g离心1min，加入600μl RNA洗涤液，14000×g离心1min。加入50μl DNA酶I 20-25℃消化15min后加200μl DNA酶终止溶液，14000×g离心1min。加入600μlSV RNA洗涤液，14000×g离心1min后，再次加入250μl RNA洗涤液，高速离心2min。用250μl无RNA酶水洗脱总RNA两次。取0.5-5μl电泳检测总RNA浓度和质量。其余总RNA于-70℃冻结实，真空冻干机超低温冻干浓缩，溶解于20-30μll水中，取0.5μl电泳检测mRNA浓度和质量。
SMART cDNA的合成用SMART cDNA library construction Kit(Clontech)试剂盒，具体操作如下合成所用的3个引物序列为(1)CDS引物(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT(30)N-1N-3′；(2)SmartII寡核苷酸(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3′；(3)PCR引物(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3′。
取垂体总RNA50ng，按文库构建方法合成第一链cDNA加入CDS引物和SmartII寡核苷酸各1μl，72℃保温2min后，冰上速冷2min；然后在终体积为10μL的反应体系中，加入5×第一链反应缓冲液(250mmol/L Tris-HCl，pH8.3；375mmol/L KCl；30mmol/L MgCl2)2μl、DTT(20mmol/L)1μl、dNTP(10mmol/L)1μl和PowerScript逆转录酶1μl，42℃保温1h合成第一链cDNA。取2μl第一链cDNA加入dNTP 2μl、PCR引物4μl、和2μl 50×Advantage 2 cDNA Polymerase Mix，于100μl反应体系中进行如下PCR循环95℃预变性1min后，以95℃ 5s、65℃ 5s、68℃ 6min反应13个循环，72℃延伸10min。反应结束后，取5μL电泳检测。此PCR产物用于构建质粒文库。合成的SMART cDNA连接入pEGM-T载体中(Promega)，并转化入DH5α感受态细胞中。
2、质粒文库的随机筛选及测序铺平板(内含100μg/mL氨苄青霉素以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，37℃培养过夜。挑取白色菌斑于预先分装有100μlAmp-LB的小管中，37℃培养2h以上。取1μl菌液作模板，以M13+和M13-为引物(M13+CAGGAAACAGCTATGAC；M13-GTAAACGACGGCCAGT)，PCR鉴定插入片段大小。将插入片段大于500bp的克隆进行测序(上海，生工)。在随机筛选并测序的90个克隆中，共检测到该基因的2个克隆(编号分别为3-25和3-102)。该基因的核苷酸序列及由此推断出的氨基酸序列结果见图1。该基因cDNA长514bp，有一个252bp(54-305)的开放阅读框，编码83个氨基酸。5’非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元；3’非编码区长209bp，有多聚腺苷酸加尾信号(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中进行同源搜索，发现与其它基因无任何同源性，为一新基因(图1)。
3、组织和胚胎总RNA的提取和RT-PCR反应提取了石斑鱼的各种组织(包括肝脏、肾脏、脾脏、胰脏、心、肌、垂体、下丘脑、端脑、小脑、中脑、延脑)的RNA，提取了处于卵子发生期、卵母细胞成熟期变性期不同阶段石斑鱼个体的脑垂体、下丘脑及成熟卵巢和处于变性期的性腺的RNA，以及提取了石斑鱼胚胎发育各个时期(包括未受精卵、桑椹期、高囊胚期、原肠中期、胚体期、视泡期、心跳期、出膜前期、出膜后、鱼苗1天)的总RNA。总RNA的提取用SV total RNA isolation system(Promega)提取。具体步骤见操作手册。各取0.2μg的总RNA，用M-MLV逆转录酶(Gibco BRL)和寡聚(dT)8-12反转录合成第一链cDNA。取第一链cDNA稀释10倍后1μl作模板用该基因的特异引物(3-25-FGAATTCATATGCTGGCTTTGGTCGCATACAC和3-46-RGCTCGAGTTAGTTGTTGAGGTCTTGAA)进行PCR。反应体系的总体积为20μl，内含1μl模板DNA，0.2μM引物，0.5单位Taq酶，0.1μM dNTP和1×Taq酶反应缓冲液。PCR反应在Perkin-Elmer DNA GeneAmp PCR System 9600扩增仪上进行，反应程序为在94℃预变性4分钟后，进行28个扩增循环，每个循环包括94℃变性40秒，62℃复性50秒，72℃延伸50秒。最后一次循环结束后72℃延伸7分钟。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离。用鲫鱼的α-tubulin基因(上游引物5’-GTGCACTGGTCTTCA GGGGTT-3’，下游引物5’-GGGAAGTGGATGCGTGGGTAT-3’)作为对照。
α-tubulin引物做PCR，确证各个组织和各个胚胎发育时期逆转录的效率都符合要求而且cDNA的量都相差不多。而该基因的表达图谱显示该基因在肝、肾、垂体和下丘脑中大量转录，在脾和胰中有微量转录，在心、肌、端脑、小脑、中脑和延脑中没有检测到其mRNA的存在(图4)；该基因仅在处于卵子发生期的垂体和下丘脑中有大量转录，而在卵母细胞成熟期和变性期的2种垂体和下丘脑，及其成熟卵巢和处于变性期间的性腺都未检测到其mRNA的存在(图5)。该基因从原肠中期开始转录，在视泡期表达达到饱和，直至鱼苗1天都无差异(图6)。
4、gerl基因融合蛋白的制备以基因开放阅读框的核苷酸序列与pET-15b载体制备成表达质粒，挑单克隆培养至对数期，加入终浓度为1mmoL的IPTG在37℃诱导表达3-6h。表达的蛋白N端融合了长20个氨基酸的组氨酸tag，可用金属离子亲和层析纯化。
5、gerl基因编码蛋白特异性多克隆抗体将3mL纯化蛋白(约100-300μg)与3mL弗氏完全佐剂充分混匀乳化，在家兔的背部皮下多点注射，每点注射约0.2mL。第一次注射2-3周后加强免疫3次，各次剂量为第一次注射的四分之一，每次间隔10天，后3次以弗氏不完全佐剂乳化样品。在第4次注射后10天自心脏抽取血液。将兔血于37℃放置1h后再在4℃放置过夜，4,000×g离心10min，吸取上层的多抗血清，分装后于-80℃冻存。
6、gerl基因在酵母中的表达以基因开放阅读框的核苷酸序列与pGAPZA和pGAPZαB表达载体制备成表达质粒，构建的表达载体转入克隆菌株DH5α中，将表达质粒用限制性内切酶BspHI消化，浓缩线性化的DNA片段后，电转化毕赤酵母，在Zeocin抗性平板上筛选重组子，3mlYPD(100μg/ml)Zeocin)培养，48h分别取菌体和上清于12.5％的聚丙烯按凝胶电泳。筛选出有特异蛋白表达的克隆。
序列表基因gerl cDNA序列如下GACACTCGATTGTTTTCCTCCTCTGAGACGGACAGCAGAGAGCCACAGCCAAGATGAGACTGTACCTTGCAATTGCCGTGCTGATGCTGGCTTTGGTCGCATACACAGAGGCCCAGGAGGAGACCTTCGAGCAGAAGTTCGCCAAGTTTACCGAGCAGGTGACTCAGGTGGGCCAGAACCTGGGTGAAAGGCTCAAGACCGGCTTTGATGATATCCAAACCAGCGACTTTGCAACCAATTCAAAGGCCCGTCTCAATGAGTTTTTTGAGTGGATGAAGACAAAAGTTCAAGACCTCAACAACTAAACAAGTCCCAGTCTCCAGCCTACAACCTGCCGTCTGACCGCCGACCTCTTCACACAAGTCATCGCTCTGCTCACCACGCAAAATGGTTGTGTTGCCTCTCTGTCAGTGTTTTTTGTAGATTAATTTAAGTGTAATCTTTTGGGGCGAAACAATGTGAAAAAGTGCAATAAAGACATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA基因gerl编码蛋白的氨基酸序列为MRLYLAIAVLMLALVAYTEAQEETFEQKFAKFTEQVTQVGQNLGERLKTGFDDIQTSDFATNSKARLNEFFEWMKTKVQDLNN
权利要求
1.一种石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列，其特征在于基因gerl cDNA序列和基因gerl编码蛋白的氨基酸序列，该基因cDNA长514bp的开放阅读框，编码83氨基酸，5’非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元，3’非编码区长209bp，有多聚腺苷酸加尾信号AAUAAA和多聚腺苷酸尾巴。
2.根据权利要求1所述的一种石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列，其特征在于基因gerl cDNA序列GACACTCGATTGTTTTCCTCCTCTGAGACGGACAGCAGAGAGCCACAGCCAAGATGAGACTGTACCTTGCAATTGCCGTGCTGATGCTGGCTTTGGTCGCATACACAGAGGCCCAGGAGGAGACCTTCGAGCAGAAGTTCGCCAAGTTTACCGAGCAGGTGACTCAGGTGGGCCAGAACCTGGGTGAAAGGCTCAAGACCGGCTTTGATGATATCCAAACCAGCGACTTTGCAACCAATTCAAAGGCCCGTCTCAATGAGTTTTTTGAGTGGATGAAGACAAAAGTTCAAGACCTCAACAACTAAACAAGTCCCAGTCTCCAGCCTACAACCTGCCGTCTGACCGCCGACCTCTTCACACAAGTCATCGCTCTGCTCACCACGCAAAATGGTTGTGTTGCCTCTCTGTCAGTGTTTTTTGTAGATTAATTTAAGTGTAATCTTTTGGGGCGAAACAATGTGAAAAAGTGCAATAAAGACATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
3.根据权利要求1所述的一种石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列，其特征在于基因gerl编码蛋白的氨基酸序列MRLYLAIAVLMLALVAYTEAQEETFEQKFAKFTEQVTQVGQNLGERLKTGFDDIQTSDFATNSKARLNEFFEWMKTKVQDLNN
4.根据权利要求1所述的一种石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列在石斑鱼人工育苗中的应用。
5.根据权利要求1所述的一种石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列在饲料添加剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种石斑鱼垂体中一个胚胎发育调控因子的基因序列及其用途，该基因cDNA长514bp，有一个252bp的开放阅读框，编码83个氨基酸，5’非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元，3’非编码区长209bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴。该基因在早期发育阶段具有重要功能，该基因在石斑鱼的人工育苗中的应用。
文档编号A61K31/7088GK1401655SQ02138829
公开日2003年3月12日 申请日期2002年7月26日 优先权日2002年7月26日
发明者周莉, 桂建芳 申请人:中国科学院水生生物研究所