专利名称：肿瘤坏死因子α基因的报告质粒与构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，尤其是涉及一种基于荧光素酶(luciferase)报告基因的肿瘤坏死 因子a基因的报告质粒的构建及其应用。
技术背景肿瘤坏死因子a (TNF-a)是一种具有重要生理功能的细胞因子。肿瘤坏死因子a主要由 巨噬细胞产生，产生细胞还包括淋巴细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞、成纤维细胞、星形胶 质细胞、表皮细胞和平滑肌细胞等。肿瘤坏死因子a具有广泛的生物学活性，例如参与炎 症反应和免疫应答；抗肿瘤；参与内毒素性休克、动脉硬化、静脉血栓形成和脉管炎等病理 过程；引起恶液质。在医学临床诊断、科学研究等领域，常常需要测定肿瘤坏死因子a基因的表达水平。肿 瘤坏死因子a的传统检测方法基于酶联免疫反应法(Enzyme linked immunosorbent assays, ELISA)，其缺点在于过程繁琐、检测操作耗时长、试剂价格昂贵"Bioscience TNFa ELISA 检测试齐U盒；Mouse TNFa (Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-alpha, TNF-a) ELISA Ready-SET-Go! CAT#: 88-7324-88)。肿瘤坏死因子a基因的报告质粒可有效反映肿瘤坏死因 子a基因的表达水平(Beutler B， Brown T. A CAT Reporter Construct Allows Ultrasensitive Estimation of TNF Synthesis, and Suggests that the TNF Gene has been Silenced in Non-macrophage Cell Lines. J. Clin. Invest, 1991, 87: 1336-1344)，目前常用的肿瘤坏死因子a 基因的报告基因为氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)基因，氯霉 素乙酰基转移酶的传统检测方法需要使用放射性标记的化合物(J.萨姆布鲁克，DW拉塞尔 著.黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版).北京科学出版社，2002， 1354-1355)， 而使用ELISA的新方法的缺点上面己有叙述(叶平，方红，周新，等.非诺贝特和吡格列酮 对心肌细胞肿瘤坏死因子-a表达的影响及机制.中国药学杂志，2004， 39 (4) : 258-261)。发明内容本发明旨在提供一种基于荧光素酶(lucifemse)报告基因的肿瘤坏死因子a基因的报告 质粒。本发明的另一目的在于提供一种肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的构建方法。本发明的另一目的是应用带有肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的细胞株(即肿瘤坏死因 子a基因报告细胞株)检测化合物对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响。本发明所述的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒构建自商品化质粒pGL3，即将肿瘤坏死 因子a基因的两个调控元件肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)和肿瘤坏死因子a基因 3，端非翻译序列(3'-UTR)插入质粒pGL3所含的荧光素酶(luciferase)报告基因两侧。构 建完成的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒所含的荧光素酶报告基因的表达由肿瘤坏死因子a 基因的两个调控元件调控，将肿瘤坏死因子a基因的报告质粒稳定转染入细胞后，化合物对 荧光素酶报告基因表达的影响即代表该化合物对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响。可有效反映肿瘤坏死因子a基因表达水平的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的核心序列 为荧光素酶(luciferase)报告基因、肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)及3，端非翻译 序列(3'-UTR)组成的重组DNA序列，或者通过上述核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的 缺失、取代或增加而得到的核苷酸序列；可有效反映肿瘤坏死因子a基因表达水平的肿瘤坏 死因子a基因的报告质粒的核心序列的连接顺序为肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter) -荧光素酶报告基因-肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列(3'-UTR)。本发明所述的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的构建方法包括下列步骤1) 从小鼠基因组DNA中采用PCR方法扩增肿瘤坏死因子a基因启动子和肿瘤坏死因 子a基因3'端非翻译序列；2) 将肿瘤坏死因子a基因的两个调控元件肿瘤坏死因子a基因启动子和肿瘤坏死因子a 基因3'端非翻译序列克隆至质粒pGL3的荧光素酶报告基因两侧的克隆位点，即构建了肿瘤 坏死因子a基因的报告质粒。上述构建好的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的荧光素酶报告基因由肿瘤坏死因子a基 因启动子和肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列驱动，因此，荧光素酶基因的表达水平即反 映了肿瘤坏死因子a基因的表达水平。在步骤l)中，PCR方法扩增肿瘤坏死因子a基因启动子和肿瘤坏死因子a基因3'端非 翻译序列的引物对包括肿瘤坏死因子a基因启动子的PCR扩增引物对和肿瘤坏死因子a基因 3'端非翻译序列的PCR扩增引物对。肿瘤坏死因子a基因启动子的PCR扩增引物对为正向引物5' AAAGGTACCATTCTGTCTGCTTGTGTCTGTCTTG 3，(下划线标注的序列 为限制性内切酶《/wI的酶切位点)；反向引物5' GGGAAGCTTGGTGTCTTTTCTGGAGGGAGATGTG 3，(下划线标注的序列为限制性内切酶///wd III的酶切位点)。肿瘤坏死因子ot基因3'端非翻译序列(3'-UTR)的PCR扩增引物对为正向引物5，GGGTCTAGAAGGGAATGGGTGTTCATCCATTCTC 3，(下划线标注的序列 为限制性内切酶BawH I的酶切位点)；反向引物5,AAAGGATCCATGGATGCAGACTTCATCCCAAGAC 3，(下划线标注的序 列为限制性内切酶jaal的酶切位点)。以下给出稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株的 建立方法，其具体步骤为1 )将肿瘤坏死因子a基因的报告质粒和带新霉素抗性的筛选标记质粒用Fugene6转染试 剂共转染小鼠巨噬细胞株RAW 264.7;2) 共转染后，将小鼠巨噬细胞株RAW 264.7消化后转接到细胞培养皿中，培养液可为 Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(含8% 10%的胎牛血清，即FBS);3) 在培养液中加入G418 (新霉素类似物)(终浓度为300 400吗/mL)进行筛选；筛 选期间换培养液的间隔时间为3 4 d;4) 待克隆大小为肉眼可见时，挑取克隆至多孔板中培养，每个克隆转接l个孔，待细胞 长起后转接至另一多孔板，每个克隆转接2个孔，用于阳性克隆的筛选；5) 培养24h后，在转接克隆的一个孔加入细菌脂多糖(LPS)至终浓度为100 200ng/mL， 5 6h后用裂解液裂解细胞，测定裂解液的荧光素酶活性细菌脂多糖刺激下的荧光素酶表 达量比细菌脂多糖未刺激的荧光素酶表达量至少有50倍增大，则表明该克隆为阳性克隆，此 克隆即为稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株。上述所得的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株需进行可行性验证，即在细菌脂多糖(LPS) 刺激的不同时间点测定肿瘤坏死因子a基因报告细胞株的裂解液的荧光素酶活性，同时用酶 联免疫反应法(ELISA)测定上清液中的肿瘤坏死因子a的含量，根据比较两种方法的结果 来判断此报告细胞株的可行性，其步骤为1) 细菌脂多糖刺激时间设定为0、 2、 4、 6、 8、 12h，每个时间点设定3个平行样；2) 将报告细胞株转接至96孔板培养24 h，培养液可为Dulbecco改良的Eagle培养基(含 8 10%胎牛血清)；3) 加入细菌脂多糖至终浓度为100 200ng/mL，根据步骤l)的刺激时间进行处理；4) 在设定的时间点收集培养上清液及细胞裂解液，测定细胞裂解液的荧光素酶活性，同 时用酶联免疫反应法测定培养上清液中的肿瘤坏死因子a的含量，比较两种方法所得到的结果来验证所构建的稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因报告细胞 株的可行性。可应用肿瘤坏死因子a基因报告细胞株检测化合物对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影 响。例如，应用肿瘤坏死因子a基因报告细胞株检测地塞米松(DEX)和大黄素(emodin) 对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响。检测地塞米松(DEX)对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响的具体步骤为1) 地塞米松浓度设定为O、 10、 25、 50、 100、 500nmol/L，每个浓度设定3个平行样。2) 将肿瘤坏死因子a基因报告细胞株转接至96孔板培养24 h，培养液可为Dulbecco改 良的Eagle培养基(含8 10%胎牛血清)。3) 吸掉培养液，加入含不同地塞米松(DEX)浓度的Dulbecco改良的Eagle培养基(含 8 10%胎牛血清)，同时加入细菌脂多糖(LPS)至终浓度为100 200ng/mL。4) 5 6h后，测定细胞裂解液的荧光素酶活性，该活性即代表肿瘤坏死因子a基因的表 达水平，同时用酶联免疫反应法测定培养上清液中的肿瘤坏死因子a的含量，比较两种方法 的测定结果。检测大黄素(emodin)对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响的具体步骤为1) 大黄素浓度设定为O、 25、 50、 100pmol/L，每个浓度设定3个平行样。2) 将肿瘤坏死因子a基因报告细胞株转接至96孔板培养24 h，培养液可为Dulbecco 改良的Eagle培养基(含8 10%胎牛血清)。3) 吸掉培养液，加入含不同大黄素浓度的Dulbecco改良的Eagle培养基(含8 10%胎 牛血清)，同时加入细菌脂多糖至终浓度为100 200ng/mL。4) 5 6h后，测定细胞裂解液的荧光素酶活性，该活性即代表肿瘤坏死因子a基因的 表达水平，同时用酶联免疫反应法测定培养上清液中的肿瘤坏死因子a的含量，比较两种方 法的测定结果。肿瘤坏死因子a的传统测量方法采用酶联免疫反应法(ELISA)，另外，至于采用报告 基因的方法已见报道的为氯霉素乙酰基转移酶报告基因，这两种方法都存在如说明书背景技 术中阐明的多种缺点，本发明采用荧光素酶报告基因的突出优点为检测方便、灵敏度高、 不使用放射性标记的化合物；经过本发明列举的可行性验证及关于检测化合物对肿瘤坏死因 子a基因表达水平的影响的具体应用表明本发明公开的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒及肿 瘤坏死因子a基因报告细胞株都具有优良的应用效果。
图1为肿瘤坏死因子a基因的报告质粒结构图。图2为用肿瘤坏死因子a基因报告细胞株检测细菌脂多糖(LPS)刺激时间对肿瘤坏死 因子a基因表达水平的影响的结果。在图2中，横坐标为时间(h)，纵坐标为荧光素酶活性。图3为利用肿瘤坏死因子a ELISA检测试剂盒检测细菌脂多糖(LPS)刺激时间对肿瘤 坏死因子a基因表达水平的影响的结果。在图3中，横坐标为时间(h)，纵坐标为肿瘤坏死 因子a (pg/mL)。图4为用肿瘤坏死因子a基因报告细胞株检测地塞米松对肿瘤坏死因子a基因表达水平 的影响的结果。在图4中，横坐标为地塞米松(nmol/L)，纵坐标为荧光素酶活性(％)。图5为用肿瘤坏死因子a ELISA检测试剂盒检测地塞米松对肿瘤坏死因子a基因表达水 平的影响的结果。在图5中，横坐标为地塞米松(nmol/L)，纵坐标为肿瘤坏死因子a (%)。图6为利用肿瘤坏死因子a基因报告细胞株检测大黄素(emodin)对肿瘤坏死因子a基 因表达水平的影响的结果。在图6中，横坐标为大黄素(pmol/L)，纵坐标为荧光素酶活性(。/。)。图7为用肿瘤坏死因子a ELISA检测试剂盒检测大黄素对肿瘤坏死因子a基因表达水平 的影响的结果。在图7中，横坐标为大黄素(pmol/L)，纵坐标为肿瘤坏死因子a (%)。
具体实施方式
实施例1构建肿瘤坏死因子a基因的报告质粒，具体步骤为-1) 从小鼠基因组DNA中采用PCR方法扩增肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)及 3'端非翻译序列G，-UTR);2) 将肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)及3'端非翻译序列(3'-UTR)克隆至质粒 pGL3的荧光素酶基因两侧的克隆位点。上述构建好的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的荧光素酶基因由肿瘤坏死因子a基因启 动子(promoter)及3'端非翻译序列(3'-UTR)驱动，因此，荧光素酶基因的表达水平即反 映了肿瘤坏死因子a基因的表达水平。在步骤l)中，利用PCR方法扩增肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)及3'端非翻 译序列(3'-UTR)，它们的碱基序列全长分别为1323 bp及807 bp，其中所用引物对的碱基 序列如下所示。肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)的PCR扩增引物对正向引物5， AAAGGTACCATTCTGTCTGCTTGTGTCTGTCTTG 3，(下划线标注的序列 为限制性内切酶《jw I的酶切位点)；反向引物5' GGGAAGCTTGGTGTCTTTTCTGGAGGGAGATGTG 3，(下划线标注的序 列为限制性内切酶if/ d III的酶切位点)。肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列(3'-UTR)的PCR扩增引物对正向引物5'GGGTCTAGAAGGGAATGGGTGTTCATCCATTCTC3，(下划线标注的序列 为限制性内切酶BamH I的酶切位点)；反向引物5'AAAGGATCCATGGATGCAGACTTCATCCCAAGAC 3，(下划线标注的序 列为限制性内切酶J^"的酶切位点)。PCR反应体系(20jtL)如下10x反应缓冲液2pL， TH向引物100ng，反向引物100ng， 10mmol/LdNTP 1.5nL，模板DNA 1 ng， T叫DNA聚合酶1 ^L，灭菌超纯水补至20 nL。上 述各组份混匀后，将PCR管置于PCR仪中，启动反应程序。扩增肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)的PCR反应程序如下① 预变性，95°C、 5min。② 变性，94°C、 lmin;复性，61°C、 1 min;延伸，72°C、 2 min;步骤②共进行35个循环。③ 反应延续，72°C、 7min。
样品保存，4'C。扩增肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列(3'-UTR)的PCR反应程序如下① 预变性，95°C、 5min。② 变性，94°C、 lmin;复性，61°C、 1 min;延伸，72°C、 1.5 min;步骤②共进行35个 循环。③ 反应延续，72°C、 7min。④ 样品保存，4°C。待反应结束，进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测后使用DNA片段纯化试剂盒(TaKaRa: DNA Fragment Purification Kit(Ver2.0)， Code No. DV807A)纯化上述PCR扩增产物，具体步骤参照 试剂盒说明书。PCR扩增出来的肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)的碱基序列全长为1323 bp,具 体如下所示sttctgtctg cttgtgtctg tcttgcgttg ggggsgsssc ttcctggtct ctttaaggsg 60 tggagcaggg gscsgsggcc tcsgttggtc cstgggstcc gggcagsgcs sagagacstg 120 sggagcsggc agctcccsga gacstggtgg attcscggga gtgaggc3gc ttasctgccg 180 g3ggsg3ccc assggstgsg ctsgggsgst ccstccssgg gtggsgsgsg stgeigggttc 240 tggggsgssg tgsctccsct ggsgggtggg 3g3gtgttt3 gg3gtggg3g ggtgggggsg 300gggsatccttgg33g3ccggggsgtc3tacgg3ttgggsgswtcctgg33gc3gggctg360tgggscct333tgtctg3gttgatgtsccgc3gtc33g3t3tggc3g3ggctccgtggs3420sactcscttgggsgcsgggscccs33gcsgcsgcctgsgctcstgstcsgsgtgsssggs480gsaiggcttgtg3ggtccgtg33ttcccsgggctgsgttC3ttccctctggggctgcccc3540t3ctcaitccc3tt3CCCCCCcc3cc3gccctcccaaagcccatgcscscttcccsactct600cssgctgctctgccttcsgccscttcctccscaigggggctttccctcctc660ctccccccttatgcaccc3gctttcsgssgC3CCCCCCC3tgctaagttc720tcccccstgg3tgtccc3tt3C3C3ggcstggtctttcts780g3c33tg3ttsgctctggsg333tgggtttcsgttctcag840ggtcct3t3ccaccctcctg9003ttggcccc3gsttgccacagastcctggtggggscgscgggg3gg3g3ttccttgstgc960ctgggtgtccccsactttccssaccctctgcccccgcgstccg3g3c3g31020ggtgtsgggccactaccgcttCCtCC3C3tg3g3tcstggttttctccsc1080ttccgagggtcttttccccgccctcttcccca3gggctat3ssggcggcc1140gtctgcscsgcc3gcc3gc3gssgctccctcagcgaggacsgcssggg3ctsgccsgg3g1200catcttggaa3tsgctcccaC3gCC33CC31260ggcsggttctgtccctttcactcsctggccC33ggcgccscstctccctc13203CC1323PCR扩增出来的肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列(3'-UTR)的碱基序列全长为807 bp，具体如下所示sgggs3tgggtgttc3tcceittctctsccc3gccccc3Ctctgacccctttsctctgscc60cctttattgtCt3CtCCtC3gsgcccccsgtctgtstccttctsscttsg33sgggg3tt1203tggctcagggtccssctctgtgctcsgsgCtttC33C33ct3ctcag33180ctgggscsgtgscctggsctgtgggcctctC3tgcacc3cC3tc3sggsctcsaatgggc240tttccg33ttcsctggsgtctcgsstgtcc3ttcctg3gttctgc333gggsgsgtggtc3003ggttgcctctgtctcagsstgsggctggsts3gstctc3ggccttcct3ccttcsgscc360tttccagattcttccctgsggtgcsstgcc3sgccttcctc3c3g3gcc3gcccccctcs4203ttt3t3tttgcacttattatttsttsttt3ttt3tt3tttattt3tttgcttatgaatg480tstttscttggssggccggggtgtcctggsggscccsgtgtgggssgctgtcttcsg3C3540g3C3tgttttctgtgsasscggsgctgsgctgtccccscctggcctctct3ccttgttgc600ctcctcttttgctt33tgtttSttt3tCt3acccasttgtCtt33t33Cg660ctgstttggtgsccsggctgtcgct3C3tc3ctgsccctcttgccccscgggsgccgtga720ctgt33tcgcctscggtcsats33gstcgc3stgtg3ttt780ctgtcttgggatgasgtctgC3tCC3t807在步骤2)中，质粒pGL3、肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)及肿瘤坏死因子a基 因3'端非翻译序列(3'-UTR)的双酶切及连接，报告质粒的转化、小量提取及鉴定等步骤均 参照《分子克隆实验指南》(第三版)(J.萨姆布鲁克，DW拉塞尔著.黄培堂等译.分子克 隆实验指南(第三版).北京科学出版社，2002)进行。最后，双酶切鉴定及后续的提交 英骏生物技术有限公司进行的测序鉴定表明本发明成功获得了肿瘤坏死因子a基因的报告质 粒(参见图1， "pGL3-TNFPro-UTR"为根据质粒命名规则命名的肿瘤坏死因子a基因的报告 质粒的名称，"6630bp"表示肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的碱基序列全长为6630bp;"TOF-a promoter"表示肿瘤坏死因子a基因启动子；"luciferase"表示荧光素酶报告基因； "TNF-a 3'-UTR"表示肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列；"^w I、 /f/wd III、 Wa I、 5awH I、 万g/ n"表示限制性内切酶识别位点，其中，显示为黑体字的限制性内切酶识别位点为本发明 在构建肿瘤坏死因子a基因的报告质粒时使用的位点。)。构建稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株。具体 方法为1) 将肿瘤坏死因子a基因的报告质粒和筛选标记质粒pCR3.1(新霉素抗性)用Fugene6 转染试剂共转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7。2) 共转染后，将细胞消化后转接到细胞培养皿中，培养液可为Dulbecco改良的Eagle 培养基(DMEM)(含8 10%胎牛血清)。3) 在培养液中加入G418 (新霉素类似物)(终浓度为300 400 pg/mL)进行筛选；筛 选期间换培养液的间隔时间为3 4d;4) 待克隆大小为肉眼可见时，挑取克隆至多孔板中培养，每个克隆转接l个孔，待细胞 长起后转接至另一多孔板，每个克隆转接2个孔，用于阳性克隆的筛选；5) 培养24h后，在转接克隆的一个孔加入细菌脂多糖(LPS)至终浓度为100 200ng/mL， 5 6 h后用裂解液裂解细胞，测定裂解液的荧光素酶活性细菌脂多糖(LPS)刺激下的荧 光素酶表达量比细菌脂多糖(LPS)未刺激的荧光素酶表达量至少有50倍增大，则表明该克 隆为阳性克隆，此克隆即为稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因 报告细胞株。上述所得的稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株 需进行可行性验证，即在细菌脂多糖(LPS)刺激的不同时间点测定肿瘤坏死因子a基因报 告细胞株的裂解液的荧光素酶活性，同时用酶联免疫反应法(ELISA)测定上清液中的肿瘤 坏死因子a的含量，根据比较两种方法的结果来判断此报告细胞株的可行性，其步骤为1) 细菌脂多糖(LPS)刺激时间设定为O、 2、 4、 6、 8、 12 h，每个时间点设定3个平 行样；2) 将肿瘤坏死因子a基因报告细胞株转接至96孔板培养24 h，培养液可为Dulbecco改 良的Eagle培养基(DMEM)(含8 10%胎牛血清)；3) 加入细菌脂多糖(LPS)至终浓度为100 200ng/mL，根据步骤l)的刺激时间进行 处理；4) 在设定的时间点收集培养上清液及细胞裂解液，测定细胞裂解液的荧光素酶活性，同时用酶联免疫反应法(ELISA)测定培养上清液中的肿瘤坏死因子a的含量，比较两种方法 所得到的结果来验证所构建的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株的可行性。肿瘤坏死因子a基 因报告细胞株的可行性验证的结果见图2和图3。可应用肿瘤坏死因子a基因报告细胞株检测化合物对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影 响，例如检测地塞米松(DEX)对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响，其具体步骤为1) 地塞米松(DEX)浓度设定为O、 10、 25、 50、 100、 500nmol/L，每个浓度设定3个 平行样。2) 将肿瘤坏死因子a基因报告细胞株转接至96孔板培养24 h，培养液可为Dulbecco改 良的Eagle培养基(DMEM)(含8 10%胎牛血清)。3) 吸掉培养液，加入含不同地塞米松(DEX)浓度的Dulbecco改良的Eagle培养基 (DMEM)(含8 10。/。胎牛血清)，同时加入细菌脂多糖(LPS)至终浓度为100 200ng/mL。4) 5 6h后，测定细胞裂解液的荧光素酶活性，该活性即代表肿瘤坏死因子a基因的表 达水平，同时用酶联免疫反应法(ELISA)测定培养上清液中的肿瘤坏死因子a的含量，比 较两种方法的测定结果。地塞米松(DEX)对肿瘤坏死因子a基因的表达水平的影响见图4 和图5。实施例2实施例2与实施例1的不同之处在于实施例2应用肿瘤坏死因子a基因报告细胞株检测 大黄素(emodin)对肿瘤坏死因子a基因的表达水平的影响，其具体步骤为1) 大黄素(emodin)浓度设定为0、 25、 50、 100 pmol/L，每个浓度设定3个平行样。2) 将肿瘤坏死因子a基因报告细胞株转接至96孔板培养24 h，培养液可为Dulbecco 改良的Eagle培养基(DMEM)(含8 10%胎牛血清)。3) 吸掉培养液，加入含不同大黄素(emodin)浓度的Dulbecco改良的Eagle培养基 (DMEM)(含8 10。/()胎牛血清)，同时加入细菌脂多糖(LPS)至终浓度为100 200 ng/mL。4)5 6h后，测定细胞裂解液的荧光素酶活性，该活性即代表肿瘤坏死因子a基因的表 达水平，同时用酶联免疫反应法(ELISA)测定培养上清液中的肿瘤坏死因子a的含量，比 较两种方法的测定结果。大黄素(emodin)对肿瘤坏死因子a基因的表达水平的影响见图6 和图7。序列表PCR方法扩增肿瘤坏死因子a基因启动子和肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列的引物 对包括肿瘤坏死因子a基因启动子的PCR扩增引物对和肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列 的PCR扩增引物对。肿瘤坏死因子a基因启动子的PCR扩增引物对为正向引物5' AAAGGTACCATTCTGTCTGCTTGTGTCTGTCTTG 3,(下划线标注的序列 为限制性内切酶^wl的酶切位点)；反向引物5' GGGAAGCTTGGTGTCTTTTCTGGAGGGAGATGTG 3，(下划线标注的序列为限制性内切酶/z/wdin的酶切位点)。肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列(3'-UTR)的PCR扩增引物对为正向引物5，GGGTCTAGAAGGGAATGGGTGTTCATCCATTCTC 3，(下划线标注的序列为限制性内切酶^wjH I的酶切位点)；反向引物5，AAAGGATCCATGGATGCAGACTTCATCCCAAGAC 3，(下划线标注的序列为限制性内切酶WaI的酶切位点)。PCR扩增出来的肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)的碱基序列全长为1323 bp，具 体如下所示sttctgtctgcttgtgtctgtcttgcgttgttcctggtctctttasggag60tggsgcsggggscsgsggcctcsgttggtcC3tgggstccgggcsgsgcs120sggsgcsggc3gctccc3gsgacatggtgg3ttcscggg3gtgsggcsgctt3sctgccg180gaggsgsccc333gg3tg3gctagggsgatcc3tccssgggtggsgsgsgstgsgggttc240tggggsgssgtgsctcc3ctggsgggtggg3gsgtgttt3ggsgtgggsgggtgggggsg300gggsatccttggssgsccggggsgtcstscgg3ttggg3g3S3tcctggssgcsgggctg360tgggsccts3stgtctgsgttgstgtsccgcsgtC33g3t3tggcsgsggctccgtgg33420sactcacttggg3gcsgggscsgcctgsgctcstgatc3g480gsaggcttgtgsggtccgtgS3ttcccsgggctgsgttcsttccctctggggctgccccs540t3CtC3tCCC3tt3CCCCCCccsccsgccctcccs33gccC3tgC3C3Cttcccasctct600cssgctgctctgccttcagcC3CttCCtCC3csgggggctttccctcctc66033t3tC3tgtctcccccctt3tgc3cccsgctttcagssgC3CCCCCCC3tgctssgttc720tcccccatggstgtcccatt3C3csggcstggtctttcts780g3C33tgsttsgctctggsgg3c3g3g33g3S3tgggtttC3gttctcsg840ggtcctatscC3C3C3C3C3C3C3C3C3C3csccctcctg9003ttggccccsgsttgccsc3gastcctggtggggscgscggggsgg3gsttccttgstgc960ctgggtgtccCC33CtttCC333CCC七Ctgcccccgcgst1020ggtgtsgggccsctsccgcttCC七CC3C3tg3gstcstggttttCtCC3Cc33gg33gtt1080ttccgagggttg33tg3g3gcttttccccgccctcttccccsagggctat333ggcggcc1140gtctgcacsg 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bp，具体如下所示sgggs3tgggtgttcstcc3ttCtC七3CCCsgcccccsctctgacccctttsctctgscc60cctttattgtctaictcctc3gsgcccccsgtctgtstccttct33cttsg33sggggstt120stggctc3gggtcc3sctctgtgctcsgsgCtttC33C33ct3Ctcsg333C3cssg3tg180ctgggscsgtgscctggsctgtgggcctctcstgc3cc3cC3tc33ggsctca33tgggc240tttccgssttcactggagtctcgsstgtcc3ttcctgsgttctgc333gggsgsgtggtc300sggttgcctctgtctc3g33tg3ggctgg3tssg3tctC3ggccttcctsccttcsg3cc360tttccagattcttccctgsggtgc33tgccaisgccttcctcacagagccagcccccctc34203ttt3t3tttgcsctt3tt3ttt3tt3ttt3ttt3ttsttt3ttt3tttgcttatgsstg480tsttt3cttgg33ggccggggtgtcctggaggsccc3gtgtgggssgctgtcttcagsca540gacatgttttctgtgss33Cggsgctgsgctgtccccscctggcctctctsccttgttgc600ctcctcttttgcttaLSitgtt七3ttt3tCt33ccc3attgtCtt33t33Cg660ctg3tttggtgaccaggctgtcgct3C3tcactgaccctcttgccccscgggsgccgtgs720ctgt33tcgcct3cggtc33t333gatcgcttgg3333g3satgtg3ttt780ctgtcttgggstgsagtctgC3tCC3t80权利要求
1.肿瘤坏死因子α基因的报告质粒，其特征在于其核心序列为荧光素酶报告基因、肿瘤坏死因子α基因启动子及3’端非翻译序列组成的重组DNA序列，或者通过上述核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的缺失、取代或增加而得到的核苷酸序列，上述核心序列的连接顺序为肿瘤坏死因子α基因启动子-荧光素酶报告基因-肿瘤坏死因子α基因3’端非翻译序列。
2. 如权利要求l所述的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的构建方法，包括下列步骤1) 从小鼠基因组DNA中采用PCR方法扩增肿瘤坏死因子a基因启动子和肿瘤坏死因 子a基因3'端非翻译序列；2) 将肿瘤坏死因子a基因的两个调控元件肿瘤坏死因子a基因启动子和肿瘤坏死因子a 基因3'端非翻译序列克隆至质粒pGL3的荧光素酶报告基因两侧的克隆位点，即构建了肿瘤 坏死因子a基因的报告质粒。
3. 如权利要求2所述的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的构建方法，其特征在于在步骤 1)中，PCR方法扩增肿瘤坏死因子a基因启动子和肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列的 引物对包括肿瘤坏死因子a基因启动子的PCR扩增引物对和肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译 序列的PCR扩增引物对；肿瘤坏死因子a基因启动子的PCR扩增引物对为正向引物5' AAAGGTACCATTCTGTCTGCTTGTGTCTGTCTTG 3，(下划线标注的序列 为限制性内切酶^wl的酶切位点)；反向引物5' GGGAAGCTTGGTGTCTTTTCTGGAGGGAGATGTG 3，(下划线标注的序 列为限制性内切酶ffi"d III的酶切位点)；肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列(3'-UTR)的PCR扩增引物对为正向引物5，GGGTCTAGAAGGGAATGGGTGTTCATCCATTCTC 3，(下划线标注的序列 为限制性内切酶^wjH I的酶切位点)；反向引物5，AAAGGATCCATGGATGCAGACTTCATCCCAAGAC 3，(下划线标注的序 列为限制性内切酶Z&"I的酶切位点)。
4. 稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株的建立 方法，其具体步骤为1 )将肿瘤坏死因子a基因的报告质粒和带新霉素抗性的筛选标记质粒用Fugene6转染试 剂共转染小鼠巨噬细胞株RAW 264.7;2) 共转染后，将小鼠巨噬细胞株RAW 264.7消化后转接到细胞培养皿中，培养液可为 Dulbecco改良的Eagle培养基，含8% 10%的胎牛血清，gp FBS; 3) 在培养液中加入G418 (新霉素类似物)，终浓度为300 400 pg/mL进行筛选，筛选 期间换培养液的间隔时间为3 4d; 4) 待克隆大小为肉眼可见时，挑取克隆至多孔板中培养，每个克隆转接l个孔，待细胞 长起后转接至另一多孔板，每个克隆转接2个孔，用于阳性克隆的筛选； 5) 培养24h后，在转接克隆的一个孔加入细菌脂多糖至终浓度为100 200ng/mL， 5 6h后用裂解液裂解细胞，测定裂解液的荧光素酶活性细菌脂多糖剌激下的荧光素酶表达量 比细菌脂多糖未刺激的荧光素酶表达量至少有50倍增大，则表明该克隆为阳性克隆，此克隆 即为稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株。
5. 如权利要求4所述的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株的可行性验证方法，其步骤为 1) 细菌脂多糖刺激时间设定为0、 2、 4、 6、 8、 12h，每个时间点设定3个平行样； 2) 将报告细胞株转接至96孔板培养24h，培养液可为Dulbecco改良的Eagle培养基， 含8 10%胎牛血清； 3) 加入细菌脂多糖至终浓度为100 200ng/mL，根据步骤l)的刺激时间进行处理； 4) 在设定的时间点收集培养上清液及细胞裂解液，测定细胞裂解液的荧光素酶活性，同 时用酶联免疫反应法测定培养上清液中的肿瘤坏死因子a的含量，比较两种方法所得到的结 果来验证所构建的稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因报告细胞 株的可行性。
6. 带有肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的细胞株，即肿瘤坏死因子a基因报告细胞株在 检测化合物对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响中的应用。
7. 如权利要求6所述的在检测化合物对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响中的应用， 其特征在于检测地塞米松对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响的具体步骤为 1) 地塞米松浓度设定为O、 10、 25、 50、 100、 500nmol/L，每个浓度设定3个平行样； 2) 将肿瘤坏死因子a基因报告细胞株转接至96孔板培养24 h，培养液可为Dulbecco改 良的Eagle培养基，含8 10%胎牛血清； 3) 吸掉培养液，加入含不同地塞米松浓度的Dulbecco改良的Eagle培养基，含8 10% 胎牛血清，同时加入细菌脂多糖至终浓度为100 200ng/mL; 4) 5 6h后，测定细胞裂解液的荧光素酶活性，该活性即代表肿瘤坏死因子a基因的表 达水平，同时用酶联免疫反应法测定培养上清液中的肿瘤坏死因子a的含量，比较两种方法的测定结果。
8.如权利要求6所述的在检测化合物对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响中的应用， 其特征在于检测大黄素对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响的具体步骤为 1) 大黄素浓度设定为0、 25、 50、 100pmol/L，每个浓度设定3个平行样； 2) 将肿瘤坏死因子a基因报告细胞株转接至96孔板培养24 h，培养液可为Dulbecco 改良的Eagle培养基，含8 10%胎牛血清； 3) 吸掉培养液，加入含不同大黄素浓度的Dulbecco改良的Eagle培养基，含8 10%胎 牛血清，同时加入细菌脂多糖至终浓度为100 200ng/mL; 4) 5 6h后，测定细胞裂解液的荧光素酶活性，该活性即代表肿瘤坏死因子a基因的 表达水平，同时用酶联免疫反应法测定培养上清液中的肿瘤坏死因子a的含量，比较两种方 法的测定结果。
全文摘要
肿瘤坏死因子α基因的报告质粒与构建方法及其应用，涉及一种基因。提供一种基于荧光素酶报告基因的肿瘤坏死因子α基因的报告质粒与构建方法及其应用。从小鼠基因组DNA中采用PCR方法扩增肿瘤坏死因子α基因启动子及3’端非翻译序列，再克隆至质粒pGL3的荧光素酶报告基因两侧的克隆位点。肿瘤坏死因子α基因的报告质粒的荧光素酶基因由肿瘤坏死因子α基因启动子及3’端非翻译序列驱动，荧光素酶基因的表达水平即反映了肿瘤坏死因子α基因的表达水平。肿瘤坏死因子α基因的报告质粒用于检测化合物对肿瘤坏死因子α基因表达水平的影响。
文档编号C12N15/28GK101250552SQ200810070798
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月21日 优先权日2008年3月21日
发明者俞春东, 卓 成, 扬 赵, 强 陈 申请人:厦门大学