大熊猫白介素18基因以及真核表达质粒构建与免疫效应的制作方法
【专利摘要】本发明是一种大熊猫白介素18(IL-18)基因及其真核表达质粒构建与免疫效应。本发明采集大熊猫血液，提取RNA，RT-PCR扩增大熊猫的白介素18基因，将扩增的大熊猫IL-18编码区克隆到pMD18-T载体，挑选阳性重组子送公司测序，测序正确的重组子命名为pMD-AmIL-18。根据大熊猫白介素18基因序列重新设计引物，以pMD-AmIL-18为模板，用PCR扩增大熊猫白介素18基因，定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，成功构建了大熊猫白介素18成熟蛋白真核表达质粒，研制出分子佐剂pAmIL-18。该佐剂可以作为疫苗的免疫增强剂。通过检测小鼠血清中CDV特异性抗体，IFN-γ和IL-2含量、脾细胞增殖指数(SI)、脾细胞中的CD3+CD4+％、CD3+CD8+％T淋巴的含量，结果发现pAmIL-18对犬瘟热弱毒疫苗有一定的免疫增强作用。
【专利说明】大熊猫白介素18基因以及真核表达质粒构建与免疫效应
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物医药生物工程领域，是一种大熊猫白介素18基因真核表达质粒 构建及免疫效应。
【背景技术】
[0002] 细胞因子是一组由多种细胞所分泌的可溶性蛋白与多肽的总称，在nmo 1 /L或 pmol/L水平即显示生物学作用，可广泛调控机体免疫应答和造血功能，并参与炎症损伤等 病理过程。白细胞介素是由淋巴细胞、单核巨噬细胞及其它细胞产生的细胞因子，在免疫调 节、造血及炎症过程中起重要作用，细胞因子作为疫苗增强剂有其他佐剂无法比拟的优点。
[0003] 1995年Dkamura从中毒性休克小鼠的肝脏中纯化得到一种新的蛋白质，由于其对 IFN-γ的产生具有诱导作用，故称之为IFN-γ诱导因子（IGIF)。1996年将IGIF命名为白 细胞介素-18(IL-18)。1995年Okamura等从中毒性休克小鼠的肝中纯化得到一种可诱导 产生IFN-γ的新型细胞因子，称之为IFN-γ诱导因子（IGIF)。1996年将IGIF命名为白 细胞介素-18 (IL-18)。随后的研究发现，IL-18在非⑶14+外周血单核细胞、休眠 T细胞和 NK细胞中IL-18的调节活性类似于TNF-a UL-Ιβ和IL-8。其可以诱导T细胞增殖、增强 NK细胞活性、刺激Thl型细胞分泌M-CSF、增强FasL介导的Thl细胞和NK细胞的细胞毒活 性，在细胞介导的免疫应答方面具有重要作用。IFN-γ是一种抗病毒因子，能干扰病毒的复 制，在治疗病毒性疾病中有着十分重要的作用。但它的使用剂量大，半衰期短，在实际应用 中受到很大的限制。而IL-18正是IFN-γ的一种良好的诱导物，可以通过IL-18不断刺激 机体产生IFN-γ，达到预防治疗病毒性疾病的目的。所以，在临床上IL-18可能作为一种重 要的抗微生物感染和抗肿瘤的重要制剂。
[0004] 自从成功扩增小鼠 IL-18基因以来，人、犬、鼠和猪等哺乳动物的IL-18基因相继 被克隆并在分子水平上开展了深入研究。早期的研究表明，对小鼠皮内注射IL-18引起淋 巴结的树突状细胞数量显著增加。共同注射IL-18的质粒作为佐剂可以显著提高免疫小鼠 的⑶4+和⑶8+的T细胞反应。IL-18作为疫苗的佐剂已经应用与很多种动物，包括小鼠、 猫、恒河猴、鸡、猪。IL-18已经用于多种疫苗的免疫增强剂，比如经典的猪瘟病毒、伪狂犬病 毒、猪繁殖和呼吸道综合症病毒以及手足口病毒疫苗等。这些结果都表明，IL-18不仅可以 缩短细胞毒性诱导的时间，同时也可以增加抗原引起的特异性淋巴增殖反应和IFN-γ释 放，因此，IL-18是一种有效的、能够增强抗原引起特异性反应的分子佐剂。
【发明内容】
[0005] 本发明主要解决的技术问题包括大熊猫白介素18基因的克隆、大熊猫白介素18 基因真核表达质粒的构建及其增强动物免疫反应的作用。主要包括以下步骤：
[0006] 1.大熊猫白介素18基因的克隆
[0007] 根据大熊猫基因组测序中预测的大熊猫白介素18基因序列以及Genebank中注册 的其他动物的大熊猫白介素18基因保守序列为参考设计引物，采集大熊猫血液，提取RNA， RT-PCR扩增大熊猫的白介素18基因，将扩增的大熊猫IL-18编码区克隆到pMD18-T载体，， 转化到E. coli JM109,并对重组子进行EcoR I和Pst I双酶切鉴定，并送公司测序，测序正 确的重组子命名为pMD-AmIL-18。
[0008] 2.大熊猫白介素18基因真核表达质粒的构建
[0009] 根据大熊猫白介素18基因序列重新设计引物，以pMD-AmIL-18为模板，用PCR扩 增大熊猫白介素18基因，并将PCR产物经Hindlll和EcoR I双酶切定向插入以Hindlll 和EcoR I双酶切处理的真核表达载体pcDNA3. 1 (+)中，成功构建了大熊猫白介素18成熟 蛋白真核表达质粒，研制出分子佐剂pAmIL-18。
[0010] 3.分子佐剂pAmIL-18的免疫增强作用
[0011] BALB/c小鼠95只，随机实验分为3个组，每组30只，5只为阴性对照组。其中第 一组为空白对照组（⑶V)，即只注射犬瘟热病毒（⑶V)弱毒苗（英特威），每只小鼠接种疫 苗0· lmL ;第二组为犬瘟热病毒（CDV)弱毒苗+PCDNA3. 1质粒组（CDV+pcDNA3. 1)，每只小 鼠接种疫苗〇. lmL+100ug pcDNA3. 1质粒；第三组为犬瘟热病毒（⑶V)弱毒苗+pAmIL18组 (⑶V+pAmIL18)，每只小鼠接种疫苗0. lmL+100ug pAmIL18质粒。阴性对照组，只注射生理 盐水。其中疫苗皮下注射，质粒多点肌肉注射。免疫后3周加强免疫一次。加强免疫后1 周、2周、3周、4周、5周和6周摘眼球取血，制备脾细胞悬液。通过检测小鼠血清中⑶V特 异性抗体，脾细胞增殖、IFN-γ、IL-2、⑶4+、⑶8+含量，研究了该分子佐剂对犬瘟热（⑶V) 疫苗的免疫增强作用。结果发现PAmIL-18对犬瘟热疫苗有一定的免疫增强作用。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常 规条件如Sambrook等人所著的分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的方法。
[0013] 实施例1
[0014] 本实施例描述了本发明提供的大熊猫白介素18(IL_18)基因的获得方法，包括以 下步骤：
[0015] (1)大熊猫IL-18基因的体外扩增
[0016] 经脂多糖（LPS)刺激后，利用TRIzol法，获得大熊猫外周血淋巴细胞RNA。
[0017] 根据大熊猫基因组和猫、狗、牛等哺乳动物的IL-18基因进行同源对比，在序 列保守区设计引物，从大熊猫的外周血淋巴细胞RNA中扩增IL-18基因的编码区片 段。PCR 反应体系：10XPCR 1311打6。.5 4 1^，（1阶13(2.5臟〇1/1)1.(^1^，六11111^18上游引 物（10 μ mol/L) 0· 5 μ L，AmIL18 下游引物（10 μ mol/L) 0· 5 μ L，cDNA 模板 1. 0 μ L，rTaq DNApolymerase(5U/y L)0. 2μ L，补水至 25μ L。PCR 的反应条件为：94°C 预变性，5min ;30 次循环（94°C变性30s;55°C退火45s;72°C延伸50s)，最后72°C延伸10min。PCR产物经 1. 2%琼脂糖凝胶电泳后，在580bp处有一条特异的DNA带，大小与预测的IL-18基因相符， 推断为大熊猫IL-18基因。
[0018] (2)重组子的鉴定
[0019] 将扩增的大熊猫IL-18编码区克隆到pMD18-T载体，转化到E. coli JM109,利用 载体的氨苄青霉素抗性和蓝白斑筛选克隆。挑取具有氨苄青霉素抗性的白色单菌落接种培 养，提取质粒DNA并进行琼脂糖凝胶电泳检测，并与pMDIS-T载体进行大小比较，比pMDIS-T 载体大的可能为重组子。将其中一些质粒分别用PstI单酶切、EcoR I和Pst I双酶切后， 进行琼脂糖凝胶电泳分析，依次得到约3300bp和2700bp、580bp的片段，同预期的结果相一 致。
[0020] 以重组子菌液为模板，用PCR方法可扩增得约580bp的核酸片段，与预期的一 致。从而初步证实克隆的DNA插入片段为IL-18基因，命名为AmIL-18,重组质粒命名为 pMD-AmIL-18。
[0021] (3)大熊猫IL-18基因序列
[0022] 将鉴定为重组子的质粒进行测序，测序结果表明，与从基因组预测大熊猫IL-18 基因核苷酸序列基本一致。大熊猫IL-18基因的开放阅读框由579个核苷酸组成，编码产 物由192个氨基酸残基组成。
[0023] ATGGCTGCTAACACAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGAAATGAAACTTATTGACAACACACTTTAC TTTATAGCTGAAAATGATGACAGCCTGGAATCAGATTACTTTGGCAAGCTCGAACCTAAACTCTCAATCATACGAAA TTTGAACGACCAAGTTCTCTTCGTTAACCAGGGAAATCAACCCGTGTTTGAGGATATGCCCGATTCTGACTGTACAG ATAACGCACCCCATA CTGTATTTATCATATATATGTATAAAGACAGCCTCACTAGAGGTCTGGCGGTAACCATCTC TGTGAAGTGTAAGAAAATGTCTACTCTCTCCTGTAAGAACAAAACTATTTCCTTTAAGGAAATGTGTCCTCCCAATA GTATCAATGATGAAGGAAATGACATCATATTCTTTCAGAGAAGTGTTCCAGGACATGACGATAAGATACAATTTGAG TCTTCATTGTACCAAGGATACTTTCTAGCTTGTCAAAAAGAGAAAGATCTTTTCAAACTCATTTTGAAAAAAAAGGA TGAAAGTGGGGATAAGTCCATTATGTTCACTGTTCAAAACAAAAGCTAGG
[0024] 实施例2
[0025] 本实施例描述了大熊猫白介素18的真核表达质粒pAmIL18获得方法，其步骤包 括：
[0026] (1)表达引物的设计
[0027] 根据大熊猫IL-18蛋白基因序列及表达载体的多克隆位点序列特征设计以下引 物：
[0028] 上游引物：5，-CGCCCAAGCTTGCCATGGCTGCTAACACAG-3，
[0029] 下游引物：5，-CCGGAATTCCTAGCTTTTGTTTTGAACAG-3，
[0030] 其中斜体分别为Hindlll和EcoR I酶切位点。GCCATGG为pcDNA3. 1 (+)表达的必 须Kozak序列。
[0031] (2)表达质粒的构建策略
[0032] 以阳性pMD18T-AmIL18质粒DNA为模板，用PCR方法扩增大熊猫白细胞介素18基 因的完整的编码序列。PCR 反应体系：10XPCR buffer2.5yL，dNTP(2.5mmol/L)1.0yL， pAmIL18 上游引物（10ymol/L)0· 5μ L，pAmIL18 下游引物（10ymol/L)0· 5μ L，cDNA 模板 1· 0μ L，rTaqDNApolymerase(5U/y L)0. 2μ L，补水至 25μ L。PCR 的反应条件为：94。。预变 性，5min ;30 次循环（94°C 变性 30s ;55°C 退火 45s ;72°C 延伸 50s)，最后 72°C 延伸 lOmin。 用Hindlll和EcoR I双酶切处理，同时将pcDNA3. 1 (+)质粒载体用Hindlll和EcoR I双 酶切处理。分别取7 μ LAmIL18双酶切片段与2 μ LpcDNA3. 1 (+)质粒的双酶切片段连接，力口 入 10XT4 DNA Ligase buffer lyL，T4 DNA Ligase lyL，16°C连接过夜，将此连接产物 转化DH5 α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养。
[0033] (3)大熊猫IL-18真核表达质粒的鉴定
[0034] 利用Hindlll和EcoR I双酶切法对上述获得的重组表达质粒进行酶切鉴定以及 PCR鉴定，鉴定正确的质粒进行测序以确定具有正确阅读框、未发生突变的重组子。以上 重组子均与预期结果一致，即具有正确的阅读框、未发生突变。鉴定的重组子分别命名为 ： pAmIL18〇
[0035] 实施例3
[0036] 本发明提供了大熊猫真核表达质粒pAmIL18对犬瘟热疫苗免疫增强作用，具体包 括以下步骤：
[0037] (l)pAmIL18分子佐剂的获得
[0038] 从LB固体培养基中挑取单菌落，接种于盛有100ml液体培养基的三角瓶中，37°C 震荡培养过夜。在l〇〇〇ml的三角瓶中加入100ml发酵培养基，接入5ml的菌种，37°C， 200rpm/min，培养20h。利用Omega公司的去内毒素质粒大量提取时间盒提取pAmIL18质 粒，操作方法按照试剂盒的说明书进行，即可以获得pAmIL18分子佐剂。
[0039] (2)动物实验设计
[0040] BALB/c小鼠95只，随机实验分为3个组，每组30只，5只为阴性对照组。其中 第一组为空白对照组，即只注射犬瘟热病毒（⑶V)弱毒苗（英特威），每只小鼠接种疫苗 0. lmL ;第二组为犬瘟热病毒（CDV)弱毒苗+PCDNA3. 1质粒组（CDV+pcDNA3. 1)，每只小鼠 接种疫苗〇. lmL+100ug pcDNA3. 1质粒；第三组为犬瘟热病毒（CDV)弱毒苗+pAmIL18组 (⑶V+pAmIL18)，每只小鼠接种疫苗0. lmL+100ug pAmIL18质粒。阴性对照组，只注射生理 盐水。其中疫苗皮下注射，质粒多点肌肉注射。免疫后3周加强免疫一次。加强免疫后7d、 14d、21d、28d、35d和42d摘眼球取血，制备脾细胞悬液。
[0041] (3)pAmIL18免疫小鼠的抗体特异性反应
[0042] 在加强免疫3周后，分别于7d、14d、21d、28d、35d和42d摘眼球取血，分离血清， 于-20°C保存。用间接ELISA法测定小鼠血清中的特异性⑶V抗体。
[0043] 结果表明，每组小鼠注射了犬瘟热（CDV)弱毒苗后，都能有效的刺激CDV特异性抗 体的产生。但是同时pAmIL18,能显著提高⑶V特异性抗体水平（P < 0. 05)。而同时注射 pcDNA3. 1对⑶V特异性抗体水平影响不大，其中⑶V+pAmIL18组的抗体水平在21d天时达 到最高值，然后逐渐降低。
[0044] ⑷小鼠脾细胞增殖
[0045] 在加强免疫3周后，分别于7d、14d、21d、28d、35d和42d无菌取小鼠脾细胞，具体 制备步骤如下：小鼠颈椎脱白处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧 朝上；在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；在脾脏下 侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取 出脾脏。放入盛有5ml RPMI-1640培养液培养基的培养皿中；在40目钢丝网上剪碎，用灭 菌玻璃注射芯轻磨、过滤，分别制成脾细胞悬液，红细胞裂解液（Sigma)破坏红细胞，冰浴 静置2min，2, 000r/min离心10min，用RPMI-1640培养液洗涤细胞2次，经台盼蓝染色测定 细胞存活率大于95 %。再以含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养液制成2 X 106/mL脾淋巴细 胞悬液。将制备好的免疫小鼠的脾细胞100 μ L接种到96孔板，加入Con A至终浓度5 μ g/ mL，同时做不加 ConA的阴性对照孔。.在培养箱中孵化48h后，每孔加入ΙΟμ L WST-8(10mg/ mL)，37°C孵化2h，测定450nm 0D值。脾细胞的增殖结果用刺激指数（SI)来表示，即实验组 的〇D45Q/对照组0D45Q。
[0046] 实验结果表明，同时注射pAmIL18能显著提高脾细胞增殖指数（P < 0. 05)，并在 35d时达到最高值。而同时pcDNA3. 1组的小鼠脾细胞增殖指数与注射单独注射CDV弱毒苗 差异不大。
[0047] (5) IFN- γ 和 IL-2 含量
[0048] 用ELISA法测定小鼠血清中的IFN-Y和IL-2含量。实验结果表明，同时注射 pAmIL18能显著增加小鼠血清中的IFN- γ和IL-2含量（P < 0. 05)，并在35d时达到最高 值。而同时pcDNA3. 1组的小鼠血清中的IFN- γ和IL-2含量与注射单独注射⑶V弱毒苗 差异不大。
[0049] (6)⑶3+⑶4+%和⑶3+⑶8+% T淋巴细胞亚群的动态变化
[0050] 制备每只小鼠的脾细胞，取1X106个/mL浓度的小鼠脾细胞悬液100yL于BD专 用的流式细胞管中，离心，去上清，加 stain bufferlOO μ L，然后再分别加入抗体。1管分别 加入抗鼠⑶3-FTTC单克隆抗体1 μ L、⑶4-ΡΕ单克隆抗体1. 25 μ L，用于测定⑶3+⑶4+% ; 另1管分别加入抗鼠⑶3单克隆抗体1 μ L，ΡΕ标记的⑶8单克隆抗体1. 25 μ L，用于测定 CD3+CD8+%，相应对照管加入抗鼠 IgG-FITC、IgG-PE单克隆抗体各1 μ L。振荡混匀，4°C下 避光放置30min，用stain buffer洗涤2次。弃上清液，，加固定液（4%多聚甲醛）200 μ L。 BD流式细胞仪检测CD3+CD4+%、CD3+CD8+%含量。
[0051] 流式细胞结果表明，同时注射pAmIL18能显著增加小鼠脾淋巴细胞中的 ⑶3+⑶4+%、⑶3+⑶8+%含量（P < 0. 05)，并在35d时达到最高值。而同时pcDNA3. 1组的 小鼠脾淋巴细胞中的⑶3+⑶4+%、⑶3+⑶8+%含量与注射单独注射⑶V弱毒苗差异不大。
[0001] 序列表 (1) SEQ ID N0:1 的信息 (1) 序列特征： (A) 长度：579碱基 (B) 类型：核酸 (C) 链性：单链 (D) 拓补结构：线性 (E) PCR引物 (ii) 分子类型：寡核苷酸 (iii) 序列描述：SEQ ID N0:1 ATGGCTGCTAACACAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGAAATGAAACTTATTGACAA CACACTTTACTTTATAGCTGAAAATGATGACAGCCTGGAATCAGATTACTTTGGCAAGCT CGAACCTAAACTCTCAATCATACGAAATTTGAACGACCAAGTTCTCTTCGTTAACCAGG GAAATCAACCCGTGTTTGAGGATATGCCCGATTCTGACTGTACAGATAACGCACCCCATA CTGTATTTATCATATATATGTATAAAGACAGCCTCACTAGAGGTCTGGCGGTAACCATCTC TGTGAAGTGTAAGAAAATGTCTACTCTCTCCTGTAAGAACAAAACTATTTCCTTTAAGGA AATGTGTCCTCCCAATAGTATCAATGATGAAGGAAATGACATCATATTCTTTCAGAGAAG TGTTCCAGGACATGACGATAAGATACAATTTGAGTCTTCATTGTACCAAGGATACTTTCTA GCTTGTGAAAAAGAGAAAGATCTTTTCAAACTCATTTTGAAAAAAAAGGATGAAAGTG GGGATAAGTCCATTATGTTCACTGTTCAAAACAAAAGCTAGG (2) SEQ ID N0:2的信息 (i) 序列特征： (A) 长度：30碱基 (B) 类型：核酸 (C) 链性：单链 (D) 拓补结构：线性 (E) PCR引物 (ii) 分子类型：寡核苷酸 (iii) 序列描述：SEQ ID N0:2 CGCC€^GC7TGCCATGGCTGCTAACACAG (3) SEQ ID Ν0·.3的信息 (i)序列特征： (A)长度：28碱基
[0002]
【权利要求】
1. 大熊猫白介素18基因及其真核表达质粒与应用，利用淋巴细胞分离液分离大熊猫 血液淋巴细胞，然后用ConA刺激淋巴细胞，扩增出IL-18基因，该基因的开放阅读框由579 个核苷酸组成，编码192个氨基酸残基。
2. 权利要求1所述的大熊猫猫白介素18(IL-18)基因及其真核表达质粒，其特征在于 将大熊猫白介素18(IL-18)基因插入真核表达载体pcDNA3. 1 (+)，构建能表达大熊猫IL-18 基因的真核表达质粒，研制出分子佐剂pAmIL18。含有编码序列的白介素18基因的重组载 体。
3. 免疫效应，免疫增强作用。
【文档编号】A61K39/39GK104099341SQ201310127640
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月15日 优先权日:2013年4月15日
【发明者】王强, 谭雪梅, 邓家波, 牛李丽, 余建秋, 严悦, 张义正, 严慧娟 申请人:成都动物园