专利名称：：人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因的克隆、新型真核表达载体的构建及其在血液系统疾病及肿瘤研究方面的应用。具体地，涉及从人肝脏组织中克隆"甲基鸟嘌呤甲基转移酶"基因，构建含荧光蛋白的真核表达质粒，并将其应用于细胞的耐药性研究。
背景技术：
：基因治疗已成为肿瘤生物治疗领域内最引人瞩目的研究热点，是继手术、放疗、化疗及免疫治疗之后的又一种极有前景的治疗模式。肿瘤的基因治疗包括多种技术与方法，如反义核酸阻断技术、自杀基因导入等等。一种较新的策略是将耐药基因(DrugResistanceGene)通过合适的载体导入正常组织细胞，从而增强正常细胞对化疗药物的抗药性，借以扩大化疗药物安全剂量范围并尽可能减少化疗带来的毒副作用。近年国内、外在肿瘤基因治疗相关领域的研究结果显示了基因治疗的诱人前景。甲基鸟嘌呤甲基转移酶(06-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT)是存在于生物体内的一种特异性DNA修复酶，它能在DNA交联形成前将烷化基团转移到自身半胱氨酸残基上，从而修复DNA分子上鸟嘌呤的损伤，同时MGMT在转甲基后即发生不可逆地失活。目前的研究还未发现有其它蛋白质参与此过程，因此MGMT是决定细胞对烷化剂类药物耐受的分子基础。人MGMT基因定位于10q26，cDNA全长769bp，含有一个621bp的氨基酸编码序列，表达含207个氨基酸的蛋白产物。MGMT的特点之一是在不需要任何辅助因子或蛋白质的条件下执行垸基转移功能，这就赋与了MGMT作为耐药基因用于基因治疗研究的先天优势。MGMT对烷化剂损伤的修复使它在肿瘤化疗中发挥双重作用一方面保护正常细胞免受烷化剂的损伤；另一方面引起肿瘤组织对烷化剂类化疗药物的耐药性。在MGMT与肿瘤发生相关性方面，国外近年的研究表明MGMT基因失活在诸多癌症发生过程中起着关键作用。正常情况下DNA修复酶对细胞具有抑制突变的保护作用。若各种原因造成MGMT表达降低或者出现基因沉默即不表达，则使细胞失去了DNA修复酶的保护作用，随之恶性突变的发生机率明显升高。若MGMT在肿瘤细胞中的高表达，会使肿瘤对垸化剂类化疗药物产生耐药性进而使化疗失败。另一方面，正常组织细胞中若MGMT高表达，则表现为有益的保护作用。因此目前如何调控MGMT的表达而达到最佳化疗效果己成为肿瘤治疗中倍受关注的问题。在基因治疗研究中表达载体的选择很重要。必须选择合适、有效而且对人体无危害的基因表达载体。目前常用的有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、质粒及共轭DNA分子等。逆转录病毒载体可以整合入宿主DNA，持久表达目的基因，但随机整合可能使宿主细胞产生插入突变和恶性变，且此种载体只能在细胞分裂期进行转染，大大限制了其应用。腺病毒载体能定位于细胞核DNA并高水平表达外源DNA，但具免疫原性的特点限制了其应用。腺相关病毒载体具有先天缺陷，其可插入片段较小并有插入性突变的危险，大剂量使用时亦可引起宿主免疫反应。与之相比质粒载体具有稳妥可靠和操作简便的优点，是目前基因转染研究中较为常用的方法，且随着细胞转染技术的进步其应用将会更加广泛。目前已有含MGMT基因的腺病毒载体及逆转录病载体构建成功并应于相关领域的研究。但如上所述，两种载体都存在自身载体所具有的先天缺陷，且构建过程要求实验条件较高，程序复杂，构建及转染细胞成功率不高。两种含有MGMT基因的载体亦不适于细胞瞬时转染相关的实验。本发明中采用了真核表达质粒pIRES2-EGFP作为载体。其本质是双顺反子真核表达质粒，进入多克隆位点内的外源基因与EGFP基因共同转录和翻译，而翻译出的EGFP与目的蛋白各具有独自的空间结构和生理活性而不会形成融合蛋白。因为目的基因与标记基因(EGFP)共用一个启动子，故所有表达标记蛋白EGFP的转染细胞必然也同时表达目的蛋白MGMT。EGFP所编码的增强荧光蛋白使得基因转染后的检测变得简便而高效。EGFP是从生物发光水母体内提取的一种特殊荧光蛋白，由于其能在活细胞中直观地观察到，对细胞无毒性且能维持较长时间的稳定性，因此可以把EGFP作为标记基因用于阳性转染克隆的筛选。pIRES2-EGFP另一特点是含新霉素抗性基因(Neo，)，其编码产物是一种新毒素磷酸转移酶(Neomycinphosphotransferase)，可以使G418失活。转染pIRES2-EGFP阳性的细胞由于neo基因的存在故对G418具有抗性，可在含G418的培养基中存活，据此原理即可利用G418加压筛选阳性转染的细胞克隆。这也是利用MGMT基因真核表达质粒转染构建K562/MGMT细胞株的理论基础。目前化疗仍是临床治疗肿瘤最主要手段之一。在杀灭肿瘤细胞的同时化疗药物对体内正常细胞亦产生不同程度的毒性作用，这在很大程度上限制了化疗药物在临床上的应用。随着现代分子生物学技术的不断发展和完善，基因治疗在肿瘤研究领域内的应用愈来愈广泛。目前主要的研究方法是在基因水平改变各种与肿瘤发生相关的细胞因子或蛋白的表达，从而达到治疗或协助治疗肿瘤的目的，这也是本发明产生的初衷和所要达到的目的。本发明构建了含人肝脏组织MGMT基因的pIRES-MGMT-EGFP真核表达载体，并在此基础上构建了K562/MGMT细胞株。通过白血病K562细胞和人外周血单个核细胞的耐药实验，阐述了该质粒载体在血液系统恶性疾病及肿瘤的基因治疗方面的应用，为相关领域的研究提供了新的技术资源和手段。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒及其构建方法与应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒，转染细胞后能表达出人甲基鸟嘌呤甲基转移酶，它具有SEQIDNO.1的核苷酸序列。一种上述人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒的构建方法，包括以下步骤(1)MGMT基因的克隆自行设计上游引物I:5，-GMTTCATGGACAAGGATTGT-3，及下游引物II:5，-GGTACCCATCCGATGCAGTGT-3，。利用RT-PCR，从人肝脏组织中获得MGMT的cDNA并扩增。PCR优化条件如下预变性94""C5min，变性94°C30s，退火58。C90s，延伸72。C50s，共30个循环，终未延伸72。C5min。(2)克隆载体pGEM-T-MGMT的构建RT-PCR电泳结果出现的MGMT目的条带用凝胶回收试剂盒回收，与pGEM-T载体按说明书连接，常规蓝白斑实验筛选阳性克隆，大肠杆菌扩增后利用质粒提取试剂盒提取pGEM-T-MGMT克隆载体。利用EcoRI和SalI双酶切鉴定后进行序列测定，确定克隆的正确性。(3)真核表达载体pIRES-MGMT-EGFP的构建利用EcoRI和SalI分别酶切克隆载体pGEM-T-MGMT和表达载体pIRES2-EGFP，回收含MGMT片段和pIRES2-EGFP大分子线性片段，前者与后者按2:1的质量比利用T4DNA连接酶4-C过夜连接。连接产物转化JM109细菌，含卡那霉素的LB培养基琼脂平板培养。挑取阳性克隆扩增、提取质粒。EcoRI和NotI双酶切鉴定并利用引物I及II进行PCR鉴定，证明构建成功。应用上述人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒构建出K562/MGMT细胞系K562是人红白细胞白血病细胞株，具有很强的增殖功能。利用脂质体转染法，将脂质体与质粒按l:l质量比对细胞进行转染。转染12小时后荧光显微镜下可见荧光蛋白表达。瞬时转染48h后换用含G418浓度为400ug/ml的1640培养基筛选，以lxl06/ml密度接种6孔板。每三天更换含G418的培养基，筛选约三周，至抗性克隆形成，即为K562/MGMT细胞系。K562/MGMT的特征是K562细胞转染了权力要求1中所述人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒，并处于加压筛选后的稳定转染状态，高丰度表达MGMT，适用于MGMT及肿瘤相关的研究。一种上述人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒在耐药基因研究中的应用。一种上述K562/MGMT细胞系在恶性血液病及肿瘤相关基因治疗研究中的应用。本发明的有益效果是(1)本发明采用自行设计的引物，通优化的RT-PCR条件，克隆了人肝脏MGMT基因，为进一步有关MGMT基因的研究奠定了良好的实验基础。(2)本发明在基因克隆中所用的克隆载体pGEM-T和构建真核表达载体中所用的质粒载体pIRES2-EGFP，具有其他载体所不具备的优势。尤其是pIRES2-EGFP载体，除了具有普通质粒载体的优点外，能在转染后表达"增强荧光蛋白"，使得转染后的检测变得简单快捷，高效准确。(3)本发明中采用的细胞转染技术经过优化，达到了高效转染。所用技术和转染试剂为基础医学研究所广泛采用，故使本发明具有易于推广应用的优点。(4)本发明应用所构建的pIRES-MGMT-EGFP真核表达质粒转染白血病细胞株K562后，检测到MGMT蛋白大量表达，应用加压筛选后形成了K562/MGMT细胞株，为相关的血液系统恶性疾病的研究提供了新的实验资源。(5)本发明应用pIRES-MGMT-EGFP载体对人外周血单个核细胞进行了正常细胞的抗药性实验。在MGMT表达水平提高以后，相应地细胞对烷化剂的抗药性有所提高，预示了该载体在人类疾病基因治疗领域中良好的应用前景。(6)本发明各步所用方法使用常规分子物学实验室设备即可完成，所构建的含人肝脏MGMT基因的真核表达质粒具有稳定的理化性质，转染后具有高效表达的特点，适用于血液系统疾病、肿瘤治疗以及基因治疗等领域推广应用。图1是真核表达质粒pIRES2-EGFP的结构示意图2是真核表达质粒pIRES-MGMT-EGFP的酶切鉴定图，图中M为Marker,1为酶切，2为未酶切；图3是K562细胞转染质粒pIRES-MGMT-EGFP48h时荧光蛋白(呈现绿色荧光)表达情况状态图4是转染后三组K562细胞MGMT在mRNA水平的表达情况电泳图，图中M为Marker,1为未转染组，2为转染目的基因组，3为转染空载体组；图5是转染后三组K562细胞MGMT蛋白的表达情况电泳图；图中1为转染MGMT基因组，2为转空载体组，3为对照组具体实施例方式本发明提供含人MGMT基因及增强荧光蛋白真核表达质粒的构建方法，同时提供了该质粒在生物医学中应用的具体实验方法。质粒pIRES-MGMT-EGFP的构建可在常规分子生物学实验室完成，具有构建便捷、易于转染细胞、易于检测蛋白表达的特点。故具有可推广性。具体构建及应用主要过程如下1.MGMT基因的克隆(1)总RNA的提取及RT-PCR:根据GeneBank公布的MGMTcDNA序列，自行设计上游引物I:5，-GAATTCATGGACMGGATTGT-3，下游引物II:5，-GGTACCCATCCGATGCAGTGT-3，其中引物I的5'端含有EcoRI酶切位点，引物II的5'端含有KpnI酶切位点。产物长度693bp。取新鲜肝脏组织利用Trizol提取总RNA，利用逆转录试剂盒按条件20°CxlOmin—37°Cx45min—95°Cx5min—4°Cx5min逆转录为cDNA后，用引物进行PCR扩增反应。PCR优化条件如下预变性94'C5min，变性94。C30s，退火58。C90s，延伸72。C50s，共30个循环，终未延伸72°C5min。琼脂糖凝胶电泳检测MGMT目的片段，MGMT片段具有序列表SEQIDNo.1所示的基因序列。(2)克隆载体pGEM-T-MGMT的构建电泳结果出现MGMT目的条带，凝胶回收试剂盒回收后与pGEM-T载体按说明书连接，利用常规蓝白斑实验筛选阳性克隆，JM109大肠杆菌扩增后利用质粒提取试剂盒提取pGEM-T-MGMT。利用EcoRI和SalI双酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序。测序结果与GeneBank公布的序列(NM002412)完全一致，证明克隆成功。2.真核表达载体pIRES-MGMT-EGFP的构建利用EcoRI和SalI分别酶切克隆载体pGEM-T-MGMT和表达载体pIRES2-EGFP，回收含MGMT片段和pIRES2-EGFP大分子线性片段，前者与后者按2:1的质量比利用T4DNA连接酶4'C过夜连接。连接产物转化JM109细菌，含卡那霉素的LB培养基琼脂平板培养。挑取阳性克隆扩增、提取质粒。EcoRI和NotI双酶切鉴定并利用引物I及II进行PCR鉴定，证明构建成功。3.真核表达载体pIRES-MGMT-EGFP在真核细胞的表达(1)在K562细胞中瞬时转染与表达K562是人红白细胞白血病细胞株，具有很强的增殖功能。利用脂质体转染试剂盒，脂质体与质粒按l:l(经实验优化的方案)质量比进行转染。转染12小时后荧光显微镜下可见荧光蛋白表达，24-48小时达到明亮状态。利用RT-PCR及常规WesternBlot检测48h时MGMT基因的mRNA和蛋白表达水平。(2)K562/MGMT细胞系的构建瞬时转染48h后换用含G418(筛选浓度400ug/ml)的1640培养基，以lxl0Vml密度接种6孔板。每三天更换含G418(筛选浓度400yg/ml)的培养基，筛选约三周至抗性克隆形成，即为K562/MGMT细胞系。经筛选的K562/MGMT可直接用于相关医学实验或保存于液氮中备用。4.pIRES-MGMT-EGFP相关的耐药基因研究(l)转染K562细胞后的耐药性改变以硝卡芥作为实验用药。取K562/MGMT细胞、转空载体(细胞株的构建步骤同K562/MGMT)细胞及未转染细胞分为三组，分别加入不同浓度硝卡芥(1000ug/ml、100Pg/ml、10ixg/ml、lug/ml、0.1ug/ml、0.01ug/ml、0.001ug/ml)，培养72小时利用MTT法测定细胞的IC50值及耐药指数(RF值)。(2)转染人外周血单个核细胞(PBMC)后的保护作用以硝卡芥作为实验用药。原代培养PBMC并常规激活，进行瞬时转染，分为转目的基因组(pIRES-MGMT-EGFP)、转空载体组(pIRES2-EGFP)及未转染细胞组，分别加入不同浓度硝卡芥(秦0pg/ml、細ug/ml、10iig/ml、lug/ml、0.liig/ml、0.01ug/ml、0.001yg/ml),培养72小时利用MTT法测定细胞的IG。值及耐药指数(RF值)。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>K562细胞及PBMC细胞耐药实验结果如上表所示。两者RF显示其对烷化剂的耐药性均有不同程度的增高，且以K562细胞明增。K562细胞体现了转染后对化疗药物耐药性的增强。PBMC体现了MGMT基因对正常细胞免受烷化剂损伤的保护作用。本发明从人肝脏中克隆了耐药基因MGMT的cDNA并重组构建了真核表达质粒pIRES-MGMT-EGFP。含人MGMT基因的病毒载体国外有个别报道，同时含有增强荧光蛋白的质粒真核表达载体的构建国内、外均无先例。在质粒构建成功后又利用该质粒构建了K563/MGMT细胞株，并检测了真核细胞在转染该质粒后的耐药性改变，为血液病及肿瘤领域的研究提供了新的研究手段。上面的陈述己将本发明中主要内容和关键点阐明，相信能使从事生命科学研究和实验医学研究的科研人员最大限度的认识和了解本发明。序列表<110>浙江大学〈120〉人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒及其构建方法与应用〈160〉1〈170>Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉693<212〉丽<213〉人体肝脏〈400>1gaattcatggacaaggattgtgaaatgaei3cgceicc3C3ctggacagccctttggggaag60ctggagctgtctggttgtgagcagggtctgC3cgaaataaagctcctgggca鄉ggacg120tctgcagctgatgccgtggaggtcccagcccccgctgcggttctcggaggtccggagccc180ctgatgcagtgC3C3gCCtggctgaatgcctatttccaccagcccgaggctatcgaagag240ttccccgtgccggctcttcaccatcccgttttccagcaag3gtcgttcaccagacaggtg300ttatggaagctgctgaaggttgtgaaattcgg6lg犯gtg3tttcttaccagcaattagca360gccctggcaggc肪cccca3agccgcgcgagC3gtggg3ggagcaatgagaggcaatcct420gtccccatcctcatcccgtgccacagagtggtctgcagcagcggagccgtgggcaactac480tccggaggactggccgtgaaggaatggcttctggcccatgaaggccaccggttggggaag540ccaggcttgggagggagctcaggtctggcaggggcctggctcaagggagcgggagctacc600tcgggctccccgcctgctggccgaaactgagtatgtgcagt鄉eitggatgtttgagcga660cacacacgtgtaacactgcatcggatgggt3CC69权利要求1.一种人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒，转染细胞后能表达出人甲基鸟嘌呤甲基转移酶，其特征在于它具有SEQIDNO.1的核苷酸序列。2.—种权利要求1所述人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤(1)MGMT基因的克隆自行设计上游引物I:5，-GAATTCATGGACMGGATTGT-3，及下游引物II:5，-GGTACCCATCCGATGCAGTGT-3，。利用RT-PCR，从人肝脏组织中获得MGMT的cDNA并扩增。PCR优化条件如下预变性94。C5min，变性94°C30s，退火58。C90s,延伸72。C50s，共30个循环，终未延伸72°C5min。(2)克隆载体pGEM-T-MGMT的构建RT-PCR电泳结果出现的MGMT目的条带用凝胶回收试剂盒回收，与pGEM-T载体按说明书连接，常规蓝白斑实验筛选阳性克隆，大肠杆菌扩增后利用质粒提取试剂盒提取pGEM-T-MGMT克隆载体。利用EcoRI和SalI双酶切鉴定后进^1序列测定，确定克隆的正确性。(3)真核表达载体pIRES-MGMT-EGFP的构建利用EcoRI和SalI分别酶切克隆载体pGEM-T-MGMT和表达载体pIRES2-EGFP，回收含MGMT片段和pIRES2-EGFP大分子线性片段，前者与后者按2:1的质量比利用T4DNA连接酶4'C过夜连接。连接产物转化JM109细菌，含卡那霉素的LB培养基琼脂平板培养。挑取阳性克隆扩增、提取质粒。EcoRI和NotI双酶切鉴定并利用引物I及II进行PCR鉴定，证明构建成功。3.—种应用权利要求1所述人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒构建出的K562/MGMT细胞系，其特征在于，由以下方法实现K562是人红白细胞白血病细胞株，具有很强的增殖功能。利用脂质体转染法，将脂质体与质粒按1:1质量比对细胞进行转染。转染12小时后荧光显微镜下可见荧光蛋白表达。瞬时转染48h后换用含G418浓度为400ug/ml的1640培养基筛选，以lx106/ml密度接种6孔板。每三天更换含G418的培养基，筛选约三周，至抗性克隆形成，即为K562/MGMT细胞系。K562/MGMT的特征是K562细胞转染了权力要求1中所述人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒，并处于加压筛选后的稳定转染状态，高丰度表达MGMT，适用于MGMT及肿瘤相关的研究。4.一种权利要求1所述人甲基鸟嘌呤甲基转移酶基因真核表达质粒在耐药基因研究中的应用。5.—种权力要求3所述的K562/MGMT细胞系在恶性血液病及肿瘤相关基因治疗研究中的应用。全文摘要本发明公开了一种含人甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)基因真核表达质粒的构建方法及其在耐药基因研究中的应用。具本包含了利用RT-PCR从人肝脏组织中获得MGMT基因的cDNA，克隆入T载体。与含增强荧光蛋白的真核表达质粒酶切重组，构建含人MGMT基因的真核表达质粒。转染K562细胞加压筛选构建K562/MGMT稳定转染细胞系。本发明还包括了该质粒在改变肿瘤细胞和正常细胞耐药性方面的应用。本发明所提供的质粒构建方法基于常规的细胞与分子生物学实验条件，无需大型和复杂实验设施。操作简便，安全高效。所构建的质粒具有良好的理化稳定性，转染细胞后易于检测，高丰度表达。本发明为MGMT相关的耐药基因研究以及肿瘤的基因治疗研究提供了新的实验资源与手段，具有较好的推广与应用价值。文档编号A61K48/00GK101386869SQ200810063050公开日2009年3月18日申请日期2008年7月8日优先权日2008年7月8日发明者李栋博,王季石,胡申江申请人:浙江大学