专利名称：H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET－NS1的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的蛋白表达质粒，特别是一种H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1。
背景技术：
禽流感是世界动物卫生组织规定的的一种A类传染病。它致病力强，传播迅速，给畜禽生产带来极大的损失。禽流感病毒属于正粘病毒科，甲型流感病毒属。甲型流感病毒的基因组为单股负链RNA，含有8个节段。其中第8节段为非结构蛋白基因，编码非结构蛋白NS1和NS2。NS1控制mRNA的剪切和翻译，在病毒感染过程中对干扰素的应答起重要作用。NS1蛋白还可以用于禽流感病毒感染的检测。甲型流感病毒又根据血凝素(H)及神经氨酸酶(N)分为15个H型和9个N型。
对现有技术文献的分析中，已有对禽流感NS1蛋白表达的报道(孙明、赵铁柱、王传彬等。禽流感病毒H5N1亚型NS1基因在大肠杆菌中的表达[J]。中国实验动物学报.2004.12(4)208-211)是通过将H5N1型禽流感病毒NS1基因与pGEX-4T-1表达载体重组获得表达质粒来表达NS1蛋白的。该融合蛋白带一个GST标签，在纯化时只能用商品化的树脂亲和层析进行纯化，而且经实验表明，极易降解。用表达质粒pET-NS1表达的融合蛋白带有组氨酸标签，用商品化的MagExtractor-His-tag-kit(TOYOBO公司)可以在四十分钟之内得到纯化蛋白，且这种纯化的蛋白可以在-40℃冰箱中保存三个月以上。pET-NS1表达质粒表达的融合蛋白还在25-30℃温度范围内均可诱导，且不产生包涵体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种H9N2型禽流感病毒NS1蛋白表达质粒pET-NS1。使其诱导表达的适用温度范围广，25-30℃均可表达；在表达过程中不会产生包涵体；融合蛋白带有组氨酸标签，方便了样品的鉴定和纯化，更避免了样品的变性和复性，使蛋白结构不受破坏；表达出的NS1蛋白克服了原核表达中纯化蛋白容易降解的缺点，可以在-40℃长时间保存；所表达的NS1蛋白还可用于禽流感病毒野毒感染的检测。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明提供的pET-NS1表达质粒是通过将pET-32a(+)和经PCR扩增后含有限制性酶切位点的禽流感NS1基因酶切，连接，获得的表达质粒；pET-NS1表达质粒转化大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导，即可表达出H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区核苷酸序列，在这一段序列中包含H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的核苷酸序列；还可表达出禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区氨基酸序列，这一段序列含有H9N2型禽流感NS1蛋白的氨基酸序列。
所述的禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区核苷酸序列，是指编码H9N2型禽流感病毒NS1融合蛋白的核苷酸序列，即包含pET-32a(+)载体序列上的Trx Tag、His Tag、S Tag及一系列酶切位点在内的504bp核苷酸加上H9N2型禽流感NS1蛋白693bp核苷酸，共计1197bp。
所述的禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区核苷酸序列，是SEQ IDNO.1中的核苷酸序列，共计1197bp。它包含编码H9N2型禽流感NS1基因的核苷酸序列，即SEQ ID NO.1第505-1197位核苷酸，共计693bp。它是SEQ ID NO.1中的氨基酸序列，分子量44.2KD左右。它包含H9N2型禽流感NS 1蛋白的氨基酸序列，即SEQ ID NO.1中的第169-398位的氨基酸序列，分子量26.0KD。
所述的编码H9N2型禽流感NS1基因的核苷酸序列，是指编码H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的含有693bp的开放阅读框架。
所述的禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区氨基酸序列，是指编码H9N2型禽流感病毒NS1融合蛋白的氨基酸序列，即包含pET-32a(+)载体序列上的Trx Tag、His Tag、S Tag及一系列酶切位点在内的168个氨基酸加上H9N2型禽流感NS1蛋白230个氨基酸，分子量为44.2KD。
所述的编码H9N2型禽流感病毒NS1融合蛋白的氨基酸序列，是指H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的230个氨基酸序列。
本发明还提供一种用上述载体转化的宿主细胞，大肠杆菌BL21细胞。
所述的宿主细胞，是DNA分子转化的宿主细胞，是大肠杆菌BL21细胞。
本发明从浓缩的H9N2型禽流感病毒中提取基因组，然后进行套式PCR扩增，即第一轮RT-PCR扩增和第二轮PCR扩增，第一轮RT-PCR扩增产物连接到pMD-18T载体中测序鉴定。用EcoRI和XhoI酶切第二轮PCR产物和pET-32a(+)载体，用T4 DNA连接酶连接。鉴定的阳性重组质粒，即为pET-NS1表达质粒。
pET-NS1表达质粒转化大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导，即可表达出H9N2型禽流感病毒NS1蛋白。此蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot进一步鉴定是正确的H9N2型禽流感病毒NS1蛋白。
这种表达的蛋白带有组氨酸标签，可以用MagExtractor-His-tag-kit(TOYOBO公司)进行纯化，四十分钟之内即可完成。
禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1蛋白翻译区的核苷酸序列及氨基酸序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上的blast同源性最高序列比较结果见表一和表二。
表一为H9N2型禽流感NS1基因的核苷酸序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上的blast同源性最高序列比较结果。
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Query169 MNSNTMSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDQLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRA 228M+SNT+SSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLD+LRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRASbjct1 MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRA 60Query229 GKQIVERILEEESDEALKMTIASVPASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIKMD 288GKQIVERILEEESDEALKMTIASVPASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCI+MDSbjct61 GKQIVERILEEESDEALKMTIASVPASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMD 120
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图1获得表达质粒pET-NS1技术路线示意框图具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列事实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1编码H9N2型禽流感NS1基因的克隆
1.病毒的浓缩取含有禽流感病毒的鸡胚尿囊液20ml 8000g离心50min，收集上清液110000g离心3h，沉淀用1ml STE溶解，这即是浓缩的鸡胚尿囊液。
2.基因组的提取将浓缩的鸡胚尿囊液150μl，加入850μl Trizol，室温下放置5min。
加入200μl氯仿，用力振荡，使之充分反应，室温下孵育2-3min。
12000g，4℃离心15min。
取上清转移到干净的离心管中，加入异丙醇500μl，震荡混匀，室温下孵育10min。
12900g，4℃离心15min。
弃上清，加入75％酒精1mL。
12000g，4℃离心2min。
再用酒精洗一次。
吸掉酒精干燥，注意不要将酒精全部蒸干。
加入13μl DEPC水溶解。
3.第一轮RT-PCR扩增根据禽流感NS1基因保守序列设计引物进行RT-PCR扩增。产物片段为800bp以上。扩增产物进行胶回收。
4.连接到pMD-18 T载体上测序扩增产物与pMD-18 T载体(Takara公司)按照1∶2-10连接。将连接产物2μl转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将转化好的DH5α细胞接种固体氨苄LB培养基，37℃过夜培养。次日挑取长出的白色的菌落接种液体氨苄LB培养基，37℃过夜培养。提取质粒，用限制性内切酶PstI和EcoRI 37℃ 2h，酶切鉴定。将含有NS1基因的重组质粒测序。测序结果到http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上用blast搜索，知其序列与其它禽流感NS1蛋白的序列同源性很高，故初步确认其为禽流感NS1蛋白编码序列。
5.第二轮PCR扩增根据测序结果设计上游包含EcoRI限制性酶切位点和下游包含XhoI限制性酶切位点的引物，进行PCR扩增。
实施例2H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的构建1.EcoRI和XhoI酶切PCR产物和pET-32a(+)载体用限制性内切酶EcoRI和XhoI分别酶切PCR产物和pET-32a(+)。37℃作用2h后，酶切产物用DNA Fragment Purification Kit(Takara公司)回收。
2.T4 DNA连接酶的连接PCR回收产物和载体回收产物按1∶3-10混合，T4 DNA连接酶(Takara公司)10-16℃过夜连接。连接产物转入大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，提取质粒。用EcoRI和XhoI酶切鉴定。鉴定的阳性重组质粒测序。测序结果到http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上用blast搜索，知其序列与其它禽流感NS1蛋白编码序列同源性很高，故初步确认其为禽流感NS1蛋白编码序列。
实施例3H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的表达1.转化大肠杆菌BL21种并挑取阳性克隆阳性克隆提质粒，转入大肠杆菌BL21中，挑取1个菌落接种2ml Amp LB培养基过夜培养。取200μl过夜培养菌液接种20ml Amp LB培养基，37℃150转/分摇菌2h，至OD600为0.4-1。
2.IPTG诱导表达所摇菌落加IPTG至终浓度为1mM，25℃-30℃摇菌4h后，收取菌液。
实施例4H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的鉴定1 SDS-PAGE电泳配制14％的分离胶和5％的浓缩胶。菌液用上样缓冲液沸水煮4min。浓缩胶电压80V，分离胶电压136V。电泳4-5h。
考马斯亮兰染色2h。
脱色液脱色。
观察，在44KD处有明显的条带出现。
2 Western Blot鉴定SDS-PAGE电泳结束时，用蒸馏水淋洗石墨板，然后用纸揩干。
切6张Whatman 3MM滤纸和一张硝酸纤维素膜。将硝酸纤维素膜浸没于去离子水的水面上，滤纸浸没于转移缓冲液中，平衡5min。
按纸、膜、胶、纸的顺序从阳极到阴极摆放正确，按照0.65mA/cm2通电转印5h。
硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和禽流感阳性血清。(禽流感阳性血清为1∶100稀释)。4℃过夜孵育，再转入37℃孵育2h。
取出硝酸纤维素膜用PBS漂洗三次，每次10min。
滤膜再用TBST漂洗10min。
硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和1∶1000稀释的兔抗鸡IgG二抗(Bethyl laboratories.Inc)。37℃孵育2h。
硝酸纤维素膜放TBST中漂洗3次，每次1h。
加入底物显色2-3min。观察结果，在44KD处有黑色条带出现。
实施例5利用MagExtractor-His-tag-kit(TOYOBO公司)纯化融合蛋白1、菌体破碎表达的菌体反复冻融，加入10mg/mL溶菌酶和10U/μl DNase I作用30min。12000rpm离心1min。
2、纯化操作菌体破碎液上清加入40μl磁珠在室温下用微型试管搅拌器搅拌10-30min。离心去掉上清。加入500μl吸附洗净液，用漩涡混合器搅拌10sec，离心去掉上清。再加入500μl吸附洗净液，用漩涡混合器搅拌10sec，离心去掉上清。加入100-200μl溶出液在室温下用微型试管搅拌器搅拌1-10min。瞬时高速离心，回收上清液即为纯化蛋白。
在具体实施中，本发明提供的H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，诱导表达的适用温度范围广，25-30℃均可表达。本发明提供的pET-NS1质粒在表达过程中不会产生包涵体，融合蛋白带有组氨酸标签，可以用MagExtractor-His-tag-kit纯化。这样方便了样品的鉴定和纯化，更避免了样品的变性和复性，使蛋白结构不受破坏。表达出的NS1蛋白克服了原核表达中纯化蛋白容易降解的缺点，可以在-40℃长时间保存。
利用pET-NS1表达质粒可以大量表达H9N2型禽流感NS1蛋白，可以研究H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基本功能。表达出的NS1蛋白还可以引入化学突变，进一步研究氨基酸的改变对禽流感病毒感染作用的影响。除此之外，所表达的NS1蛋白及其抗体可以作为病毒感染鸡体的一个重要标记。利用禽流感NS1蛋白可以鉴别诊断自然感染鸡群和疫苗免疫鸡群。
本发明设计的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大学<120>禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区编码序列<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1197<212>DNA<213>人工序列<400>1atgagggata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480gctgatatcg gatccgaatt cataatgaat tccaacacta tgtcaagctt tcaggtagac 540tgctttcttt ggcatgtccg caaacgattt gcagaccaag aactgggtga tgccccattc 600cttgaccagc ttcgccgaga tcagaagtcc ctaagaggaa gaggcagcac tcttggtctg 660gacatcgaaa cagctactcg tgcgggaaag cagatagtgg agcggattct ggaggaagag 720
tctgatgagg cacttaaaat gactattgct tctgtgccgg cttcacgcta cctaactgac 780atgactcttg aagaaatgtc aagggactgg ttcatgctca tgcccaagca gaaagtggca 840ggttcccttt gcatcaaaat ggaccaggca ataatggata aaaacatcat attgaaagca 900aatttcagtg tgatttttgg ccggttagaa accctaatac tacttagagc cttcacagaa 960gaaggagcaa tcgtgggaga aatctcacca ttaccttccc ttccaggaca tactgatgag1020gatgtcaaaa atgcaattgg ggtcctcatc ggaggatttg aatggaatga taacacagtt1080cgagtctcta aaactctaca gagattcgct tggagaagca gtaatgagaa tgggagacct1140ccactccctc caaagcagaa acggaaaatg gcgagaacaa ttgagtcaga agtttga 1197<210>2<211>398<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Arg Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp15 10 15Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp20 25 30Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 55 60Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65 70 75 80Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser85 90 95Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly100 105 110Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro115 120 125Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln130 135 140His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met145 150 155 160Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Ile Met Asn Ser Asn Thr Met Ser Ser165 170 175
Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp180 185 190Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe Leu Asp Gln Leu Arg Arg Asp Gln195 200 205Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr210 215 220Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg 11e Leu Glu Glu Glu225 230 235 240Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr Ile Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg245 250 255Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Asp Trp Phe Met260 265 270Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Ser Leu Cys Ile Lys Met Asp275 280 285Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val290 295 300Ile Phe Gly Arg Leu Glu Thr Leu Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu305 310 315Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly320 325 330 335His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Gly Gly340 345 350Phe Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val Arg Val Ser Lys Thr Leu Gln Arg355 360 365Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asn Glu Asn Gly Arg Pro Pro Leu Pro Pro370 375 380Lys Gln Lys Arg Lys Met Ala Arg Thr Ile Glu Ser Glu Val385 390 395 398
权利要求
1.一种H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，其特征在于，所提供的pET-NS1表达质粒是通过将pET-32a(+)和经PCR扩增后含有限制性酶切位点的禽流感NS1基因酶切，连接，获得的表达质粒；pET-NS1表达质粒转化大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导，即可表达出H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区核苷酸序列，在这一段序列中包含H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的核苷酸序列；还可表达出禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区氨基酸序列，这一段序列含有H9N2型禽流感NS1蛋白的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，其特征是，所述的禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区核苷酸序列，是指编码H9N2型禽流感病毒NS1融合蛋白的核苷酸序列，即包含pET-32a(+)载体序列上的Trx Tag、His Tag、S Tag及一系列酶切位点在内的504bp核苷酸加上H9N2型禽流感NS1蛋白693bp核苷酸，共计1197bp。
3.根据权利要求1或者2所述的H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，其特征是，所述的禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区核苷酸序列，是SEQ ID NO.1中的核苷酸序列，共计1197bp。
4.根据权利要求1或者2或者3所述的H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，其特征是，所述的禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区核苷酸序列，包含编码H9N2型禽流感NS1基因的核苷酸序列，即SEQ ID NO.1第505-1197位核苷酸，共计693bp。
5.根据权利要求4所述的H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，其特征是，所述的编码H9N2型禽流感NS1基因的核苷酸序列，是指编码H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的含有693bp的开放阅读框架。
6.根据权利要求1或者2或者3所述的H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，其特征是，所述的禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区核苷酸序列，是SEQ ID NO.1中的氨基酸序列，分子量44.2KD左右。
7.根据权利要求1或者2或者3所述的H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，其特征是，所述的禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区核苷酸序列，包含H9N2型禽流感NS1蛋白的氨基酸序列，即SEQ ID NO.1中的第169-398位的氨基酸序列，分子量26.0KD。
8.根据权利要求1所述的H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，其特征是，所述的禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1的蛋白翻译区氨基酸序列，是指编码H9N2型禽流感病毒NS1融合蛋白的氨基酸序列，即包含pET-32a(+)载体序列上的Trx Tag、His Tag、S Tag及一系列酶切位点在内的168个氨基酸加上H9N2型禽流感NS1蛋白230个氨基酸，分子量为44.2KD。
9.根据权利要求8所述的H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，其特征是，所述的编码H9N2型禽流感病毒NS1融合蛋白的氨基酸序列，是指H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的230个氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET-NS1，其特征是，从浓缩的H9N2型禽流感病毒中提取基因组，然后进行套式PCR扩增，即第一轮RT-PCR扩增和第二轮PCR扩增，第一轮RT-PCR扩增产物连接到pMD-18 T载体中测序鉴定，用EcoR I和Xho I酶切第二轮PCR产物和pET-32a(+)载体，用T4 DNA连接酶连接，鉴定的阳性重组质粒，为pET-NS1表达质粒，pET-NS1表达质粒转化大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导，可表达出H9N2型禽流感病毒NS1蛋白。
全文摘要
一种H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET－NS1。提供的pET－NS1表达质粒是通过将pET－32a(+)和经PCR扩增后含有限制性酶切位点的禽流感NS1基因酶切，连接，获得的表达质粒；pET－NS1表达质粒转化大肠杆菌BL21种，用IPTG诱导，即可表达出H9N2型禽流感NS1蛋白表达质粒pET－NS1的蛋白翻译区核苷酸序列，在这一段序列中包含H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的核苷酸序列；还可表达出禽流感NS1蛋白表达质粒pET－NS1的蛋白翻译区氨基酸序列，这一段序列含有H9N2型禽流感NS1蛋白的氨基酸序列。本发明诱导表达的适用温度范围广，方便了样品的鉴定和纯化，使蛋白结构不受破坏。克服了纯化蛋白容易降解的缺点，可以在－40℃长时间保存。所表达的NS1蛋白还可用于禽流感病毒野毒感染的检测。
文档编号C07K14/005GK1724670SQ20051002731
公开日2006年1月25日 申请日期2005年6月30日 优先权日2005年6月30日
发明者孙建和, 王琰, 陆承平, 严亚贤, 陆苹 申请人:上海交通大学