一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因导入材料【技术领域】，具体涉及一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料及其制备方法和应用。一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，包括：步骤一，针状羟基磷灰石的制备；步骤二，吸附顺铂，得到纳米羟基磷灰石的基因导入材料。本发明制得的纳米羟基磷灰石的基因导入材料为一种平均直径为100nm左右的纳米针状材料，该纳米羟基磷灰石的基因导入材料与绿色荧光蛋白质粒基因pGFP结合，用于转染，具有转染效率高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该针状纳米羟基磷灰石的基因导入材料和pEGFP-C1的联合体的转染效率达到40%左右。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因导入材料【技术领域】，具体涉及一种功能化纳米羟基磷灰石的基因 导入材料及其制备方法和应用。 一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料及其制备方法 和应用
【背景技术】
[0002] 基因导入方法可以分为两类：第一类是病毒型基因导入方法，是以逆转录病毒、腺 病毒、腺相关病毒为载体；第二类是非病毒型基因导入方法，如显微注射、基因枪、磷酸钙共 沉淀、阳离子脂质体法、以及利用新兴的纳米基因导入材料进行基因转染。
[0003] 病毒型基因导入方法存在许多严重的不足，例如病毒转染时有可能激活原癌基 因。因此，非病毒型基因导入方法是目前的研究热点，但是，上述所述的非病毒型基因导入 方法均存在不足：显微注射一次只能处理一个细胞，其转染效率非常低；基因枪的穿透力 十分有限；磷酸钙共沉淀法的转染效率受温度、浓度、操作环境等众多因素影响，转染结果 很不稳定；阳离子脂质体法虽然表现出良好的转染效率，但是阳离子脂质体因毒性高，使得 阳离子脂质体法的应用受到了限制；现有技术中的纳米基因导入材料存在生产成本高、制 备用原料不易得、难以普及推广应用的缺点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种功能化纳米羟基磷灰石的 基因导入材料的制备方法。
[0005] 本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供一种利用功能化纳米羟基磷灰 石的基因导入材料的制备方法制得的功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料。
[0006] 本发明的目的之三在于针对现有技术的不足，提供一种功能化纳米羟基磷灰石的 基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用。
[0007] 为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案： 一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，它包括以下步骤： 步骤一，针状羟基磷灰石的制备：将氢氧化钙的水溶液缓慢加入到稀磷酸的水溶液中， 并在一定温度下搅拌一定时间，然后静置一定时间后进行过滤，得到颗粒物，然后将颗粒物 进行水洗并真空干燥后，得到针状羟基磷灰石； 步骤二，吸附顺钼：将顺式二氨基二氯络钼溶解于超纯水中，然后超声振荡一定时间 后，加入步骤一制得的针状羟基磷灰石，并在一定温度下搅拌一定时间后，进行离心并水 洗，得到纳米羟基磷灰石的基因导入材料。
[0008] 上述技术方案中，步骤一中，所述氢氧化钙的水溶液中的氢氧化钙和所述稀磷酸 的水溶液中的磷酸的摩尔比为4~6 :2~4。
[0009] 上述技术方案中，步骤一中，所述氢氧化钙的水溶液中，所述氢氧化钙的摩尔浓度 为 0· lmol/L?0· 3 mol/L。
[0010] 上述技术方案中，步骤一中，所述稀磷酸的水溶液中，所述稀磷酸的摩尔浓度为 0· lmol/L?0· 3 mol/L。
[0011] 上述技术方案中，步骤一中，所述搅拌温度为33°C~40°C，所述搅拌时间为22小时 ?26小时；所述静置时间为1. 5小时~2. 5小时。
[0012] 上述技术方案中，步骤二中，所述针状羟基磷灰石与所述顺式二氨基二氯络钼的 质量比为4(Γ60 :1?5。
[0013] 上述技术方案中，步骤二中，所述顺式二氨基二氯络钼溶解于超纯水的质量-体 积浓度为 〇· 2mg/mL?0· 6 mg/mL。
[0014] 上述技术方案中，步骤二中，所述超声振荡的时间为20分钟~40分钟；所述搅拌温 度为33°C?40°C，所述搅拌时间为45小时?50小时。
[0015] 为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案： 利用上述所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法制得的功能 化纳米羟基磷灰石的基因导入材料，所述纳米羟基磷灰石的基因导入材料为一种平均直径 为80nnTl00nm的纳米针状材料。
[0016] 为了实现上述目的之三，本发明采用如下技术方案： 上述所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法所制得的功能化 纳米羟基磷灰石的基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用。
[0017] 本发明与现有技术相比较，有益效果在于： 本发明提供的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法所制得的纳米 羟基磷灰石的基因导入材料为一种平均直径为80nnTl00nm左右的纳米针状材料，且该纳 米针状材料的粒径能够通过反应时间的控制进而控制纳米颗粒的粒径，从而扩大了粒径的 选择范围。该纳米羟基磷灰石的基因导入材料能和绿色荧光蛋白质粒基因 PGFP以非共价 方式结合，形成无机纳米基因导入系统，用于基因转染。该纳米羟基磷灰石的基因导入材料 与绿色荧光蛋白质粒基因 pGFP结合后再与DNA中的氢氧化钙和磷酸离子的正电性根发生 作用，能够达到稳定的转染效率，并且能够降低高浓度钙离子可能导致的活性，从而使得本 发明所制得的纳米羟基磷灰石的基因导入材料能够在人体内得到进一步应用。与现有技术 相比，本发明所述制得的纳米羟基磷灰石的基因导入材料具有以下优点： (1) 具有较高的转染效率，在人乳腺癌细胞中可以达到40%左右； (2) 低毒性，因针状的纳米羟基磷灰石的基因导入材料具有良好的生物相容性，细胞生 存率很高； (3) 该纳米羟基磷灰石的基因导入材料的分散性良好，符合对转染的要求； (4) 制备成本极低，因该纳米羟基磷灰石的基因导入材料提取的主要活性成分--多 酚类化合物的价格低廉；且反应用试剂都是常见易得的化学药品，如氢氧化钙和磷酸都是 廉价试剂； (5) 材料制备反应简单，容易操作，可重复性好； (6) 应用前景良好，可以应用于制备抗肿瘤药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是本发明的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法的实施 例1所制得的纳米羟基磷灰石的基因导入材料的扫描电镜图。
[0019] 图2是本发明在转染实验中的纳米羟基磷灰石的基因导入材料和pEGFP-Cl的联 合体在转染后的倒置荧光显微镜下的荧光图。
[0020] 图3是本发明在转染实验中的纳米羟基磷灰石的基因导入材料和pEGFP-Cl的联 合体在转染后的细胞存活率图。
[0021] 图4是本发明在转染实验中的纳米羟基磷灰石的基因导入材料和pEGFP-Cl的联 合体的转染效率图。
[0022] 其中，在图3至图4中，cell viability (%)代表细胞存活率，transfection efficiency(%)代表转染效率。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0024] 实施例1。
[0025] 一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，它包括以下步骤： 步骤一，针状羟基磷灰石的制备：将氢氧化钙的水溶液缓慢加入到稀磷酸的水溶液中， 并在37°C的温度下搅拌24小时，然后静置2小时后进行过滤，得到颗粒物，然后将颗粒物进 行水洗并真空干燥后，得到针状羟基磷灰石。
[0026] 其中，步骤一中，氢氧化钙的水溶液中的氢氧化钙和稀磷酸的水溶液中的磷酸的 摩尔比为5 :3。其中，氢氧化钙的水溶液中，氢氧化钙的摩尔浓度为0. 17mol/L。稀磷酸的 水溶液中，稀磷酸的摩尔浓度为〇. 15mol/L。
[0027] 步骤二，吸附顺钼：将顺式二氨基二氯络钼溶解于超纯水中，然后超声振荡30分 钟后，加入步骤一制得的针状羟基磷灰石，并在37°C的温度下搅拌48小时后，进行离心并 水洗，得到纳米羟基磷灰石的基因导入材料。
[0028] 其中，步骤二中的针状羟基磷灰石与顺式二氨基二氯络钼的质量比为50 :3。其 中，顺式二氨基二氯络钼溶解于超纯水的质量-体积浓度为〇. 4mg/mL。
[0029] 利用本实施例1 一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法制得的 功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料，该纳米羟基磷灰石的基因导入材料为一种平均直 径为100nm的纳米针状材料。
[0030] 本实施例1的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法所制得的 功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用，具有低毒性、良好的 分散性、以及具有较高的转染效率，在人乳腺癌细胞中可以达到40%左右。
[0031] 实施例2。
[0032] 一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，它包括以下步骤： 步骤一，针状羟基磷灰石的制备：将氢氧化钙的水溶液缓慢加入到稀磷酸的水溶液中， 并在33°C的温度下搅拌26小时，然后静置1. 5小时后进行过滤，得到颗粒物，然后将颗粒物 进行水洗并真空干燥后，得到针状羟基磷灰石。
[0033] 其中，步骤一中，氢氧化钙的水溶液中的氢氧化钙和稀磷酸的水溶液中的磷酸的 摩尔比为4 :2。其中，氢氧化钙的水溶液中，氢氧化钙的摩尔浓度为0. lmol/L。稀磷酸的水 溶液中，稀磷酸的摩尔浓度为〇. lmol/L。
[0034] 步骤二，吸附顺钼：将顺式二氨基二氯络钼溶解于超纯水中，然后超声振荡20分 钟后，加入步骤一制得的针状羟基磷灰石，并在33°C的温度下搅拌50小时后，进行离心并 水洗，得到纳米羟基磷灰石的基因导入材料。
[0035] 其中，步骤二中的针状羟基磷灰石与顺式二氨基二氯络钼的质量比为40 :1。其 中，顺式二氨基二氯络钼溶解于超纯水的质量-体积浓度为〇. 2mg/mL。
[0036] 利用本实施例2 -种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法制得的 功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料，该纳米羟基磷灰石的基因导入材料为一种平均直 径为80nm的纳米针状材料。
[0037] 本实施例2的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法所制得的 功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用，具有低毒性、良好的 分散性、以及具有较高的转染效率，在人乳腺癌细胞中可以达到40%左右。
[0038] 实施例3。
[0039] 一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，它包括以下步骤： 步骤一，针状羟基磷灰石的制备：将氢氧化钙的水溶液缓慢加入到稀磷酸的水溶液中， 并在40°C的温度下搅拌22小时，然后静置2. 5小时后进行过滤，得到颗粒物，然后将颗粒物 进行水洗并真空干燥后，得到针状羟基磷灰石。
[0040] 其中，步骤一中，氢氧化钙的水溶液中的氢氧化钙和稀磷酸的水溶液中的磷酸的 摩尔比为6 :4。其中，氢氧化钙的水溶液中，氢氧化钙的摩尔浓度为0.3mol/L。稀磷酸的水 溶液中，稀磷酸的摩尔浓度为〇. 3mol/L。
[0041] 步骤二，吸附顺钼：将顺式二氨基二氯络钼溶解于超纯水中，然后超声振荡40分 钟后，加入步骤一制得的针状羟基磷灰石，并在40°C的温度下搅拌45小时后，进行离心并 水洗，得到纳米羟基磷灰石的基因导入材料。
[0042] 其中，步骤二中的针状羟基磷灰石与顺式二氨基二氯络钼的质量比为60 :5。其 中，顺式二氨基二氯络钼溶解于超纯水的质量-体积浓度为〇. 6mg/mL。
[0043] 利用本实施例3 -种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法制得的 功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料，该纳米羟基磷灰石的基因导入材料为一种平均直 径为90nm的纳米针状材料。
[0044] 本实施例3的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法所制得的 功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用，具有低毒性、良好的 分散性、以及具有较高的转染效率，在人乳腺癌细胞中可以达到40%左右。
[0045] 将上述实施例1制得的纳米羟基磷灰石的基因导入材料用于以下实验。
[0046] 结合性能的测定 1、主要材料 实施例1制得的纳米羟基磷灰石的基因导入材料(见图1);绿色荧光蛋白质粒 (pEGFP-Cl) ;HEPES平衡盐溶液（自配）；电泳缓冲液（0. 5XTBE，自配）；DNA上样缓冲液；溴 化乙啶（EB)。
[0047] 2、主要方法 1 μ L针状纳米羟基磷灰石的基因导入材料的溶液（5mg针状纳米羟基磷灰石的基因 导入材料溶解在500 μ L双蒸水中）与1 μ LpEGFP-Cl水溶液（0. 1 mg /mL)以及8 ml双蒸 水（pH=7. 4)在1. 5mL离心管中混合，置于室温下30分钟让其充分结合。针状纳米羟基磷 灰石的基因导入材料和pEGFP-Cl的质量比分别为100:l，50:l，30:l，10 :l，5:l，l:l。在 5000rpm的速度下离心5min，得到沉淀物。将沉淀物加载到1%的琼脂糖（ΕΒ0. 1 mg/mL)中， 并在TAE的缓冲下，在100V电压下跑40min，然后在320nm处观察条带。
[0048] 3、结果 结果观察，有多种条带出现，这是因为PEGFP-C1有多种构型所致。在质量比30:1， 10:1，5:1，1:1处条带清晰明显，说明在这些质量比之下，DNA和纳米羟基磷灰石的基因导 入材料颗粒结合不是很好，到了 1〇〇: 1，50:1条带消失，说明DNA和纳米羟基磷灰石的基因 导入材料颗粒结合完全了。
[0049] 上述结果表明：带正电荷的pEGFP-Cl和纳米羟基磷灰石的基因导入材料存在一 个最佳的结合比，当纳米羟基磷灰石的基因导入材料和PEGFP-C1的质量比大于50:1，继 续添加纳米羟基磷灰石的基因导入材料，绿色荧光蛋白质粒也不会再与多余的纳米羟基磷 灰石的基因导入材料结合，因此，本实验结果得出，以纳米羟基磷灰石的基因导入材料和 pEGFP-Cl的质量比为50:1的结合比进行转染。
[0050] 转染实验 1、主要材料 人乳腺癌细胞；针状纳米羟基磷灰石的基因导入材料和pEGFP-Cl联合体(上述制备）； DMEM培养基；胎牛血清FBS ;6孔培养板。
[0051] 2、主要方法 (1)细胞的培养：将人乳腺癌细胞用胰蛋白酶-EDTA消化下来，计数后加入到6孔板中 (5 X 106/孔)，用含FBS10%的DMEM溶液并加转染优化试剂培养至细胞密度为60%?70%的 融合度。
[0052] (2)细胞转染实验：将培养好的细胞上清除去，并换上新的培养液，然后分成三份， 分别为第一样品、第二样品和第三样品，第一样品中不添加任何其它物质，往第二样品中加 入质量比为50:1的针状纳米羟基磷灰石的基因导入材料和pEGFP-Cl的联合体，往第三样 品中加入脂质体2000和pEGFP-Cl的联合体，然后对第一样品、第二样品和第三样品分别 培养48小时，然后对第二样品进行荧光测定(见图2)，并对第一样品、第二样品和第三样品 分别进行细胞存活率测定(见图3)、转染效率测定(见图4)。其中，细胞存活率测定时，是用 碘化吡啶进行标识，并使用流式细胞仪进行检测。转染效率测定是使用流式细胞仪进行检 测。
[0053] 3、结果分析 从图2中的荧光图可以看出有明显的绿色荧光，并且绿色荧光的覆盖面较大，说明针 状纳米羟基磷灰石的基因导入材料和pEGFP-Cl的联合体在人乳腺癌细胞中转染成功。
[0054] 图3的细胞存活率图片中，由左到右分别代表第一样品（control)、第二样品 (nano)和第三样品（lipofectamine 2000)的存活率，其中，第一样品的存活率为98%，第二 样品的存活率约为87%，第三样品的存活率为75%。因此，从图3中可以看到，质量比为50:1 的针状纳米羟基磷灰石的基因导入材料和pEGFP-Cl的联合体对人乳腺癌细胞的存活率的 影响是很小的，相比之下，脂质体2000和pEGFP-Cl的联合体对人乳腺癌细胞的存活率的 影响较大。
[0055] 图4的转染效率图片中，由左到右分别代表第一样品（control)、第二样品（nano) 和第三样品（lipofectamine 2000)的转染效率。由图4中可以看到，针状纳米轻基磷灰石 的基因导入材料和PEGFP-C1的联合体可以达到约40%的转染效率，这是在保证了人乳腺癌 细胞存活率约为87%的前提下达到的转染效率。虽然针状纳米羟基磷灰石的基因导入材料 和pEGFP-Cl的联合体的转染效率不及脂质体2000的转染效率高，但是，针状纳米羟基磷灰 石的基因导入材料和PEGFP-C1的联合体的高细胞相容性是脂质体2000所无法比拟的。
[0056] 终上所述，由上述实验结果和分析可知，针状纳米羟基磷灰石的基因导入材料作 为转染试剂具有巨大的潜力。
[〇〇57] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应 当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实 质和范围。
【权利要求】
1. 一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，其特征在于：它包括以下 步骤： 步骤一，针状羟基磷灰石的制备：将氢氧化钙的水溶液缓慢加入到稀磷酸的水溶液中， 并在一定温度下搅拌一定时间，然后静置一定时间后进行过滤，得到颗粒物，然后将颗粒物 进行水洗并真空干燥后，得到针状羟基磷灰石； 步骤二，吸附顺钼：将顺式二氨基二氯络钼溶解于超纯水中，然后超声振荡一定时间 后，加入步骤一制得的针状羟基磷灰石，并在一定温度下搅拌一定时间后，进行离心并水 洗，得到纳米羟基磷灰石的基因导入材料。
2. 根据权利要求1所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，其 特征在于：步骤一中，所述氢氧化钙的水溶液中的氢氧化钙和所述稀磷酸的水溶液中的磷 酸的摩尔比为4飞：2?4。
3. 根据权利要求1所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，其 特征在于：步骤一中，所述氢氧化钙的水溶液中，所述氢氧化钙的摩尔浓度为0. Imol/L~0. 3 mol/L〇
4. 根据权利要求1所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法， 其特征在于：步骤一中，所述稀磷酸的水溶液中，所述稀磷酸的摩尔浓度为0. Imol/L~0. 3 mol/L〇
5. 根据权利要求1所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，其 特征在于：步骤一中，所述搅拌温度为33°C ~40°C，所述搅拌时间为22小时~26小时；所述 静置时间为1. 5小时~2. 5小时。
6. 根据权利要求1所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，其 特征在于：步骤二中，所述针状羟基磷灰石与所述顺式二氨基二氯络钼的质量比为4(Γ60 : 1?5。
7. 根据权利要求1所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方法，其 特征在于：步骤二中，所述顺式二氨基二氯络钼溶解于超纯水的质量-体积浓度为0. 2mg/ πιΤΛΟ. 6 mg/mL〇
8. 根据权利要求1所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制备方 法，其特征在于：步骤二中，所述超声振荡的时间为20分钟~40分钟；所述搅拌温度为 33°C?40°C，所述搅拌时间为45小时?50小时。
9. 利用权利要求1一8任意一项所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的 制备方法制得的功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料，其特征在于：所述纳米羟基磷灰 石的基因导入材料为一种平均直径为SOnnTlOOnm的纳米针状材料。
10. 权利要求1至8任意一项所述的一种功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料的制 备方法所制得的功能化纳米羟基磷灰石的基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104109684SQ201410274374
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】王深明, 林颖, 张德元, 常光其, 周鸿雁, 李梓伦, 邵楠 申请人:中山大学附属第一医院