聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂及其制备方法和应用的制作方法

聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂及其制备方法和应用，其中，聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂具有层状结构，其由内至外依次包括：硫化亚铁层、三辛基氧化磷层、辛胺-聚丙烯酸层、聚烯丙基胺盐酸盐层、聚丙烯酸层，聚丙烯酸层表面修饰有六氨基支链聚乙二醇。本发明的诊疗剂通过肿瘤的滞留和渗透作用能够在肿瘤部位具有很高的富集量，然后再进行光热治疗，效果显著，不会对其他的部位造成损伤，治愈后不复发，与现有技术相比效果显著。此外，其通过磁共振成像可以对癌症进行早期诊断，同时可在治愈后的磁共振造影中进行实时监测，结合实时监测结果可以给出合理的治疗计划，可广泛应用在临床诊断治疗技术中。
【专利说明】聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域，尤其涉及一种聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂及其制备方法，以及其在制备医学成像试剂和成像指导下的肿瘤光热治疗药物中的应用。
【背景技术】
[0002]癌症已经成为二十一世纪影响人类身体健康及生命的最大杀手。具美国最新的调查报告显示，2011年新诊断出的癌症病例大约为1，529，960例，大约有569，490美国人死于癌症，死亡人数平均每天1，500多人。恶性肿瘤已成为威胁人类健康和生命的头号“杀手”。
[0003]当今，癌症的治疗手段主要包括手术、化疗和放疗，但是每一种治疗方式都有其局限性:手术往往难以将体内所有的癌细胞完全清除，尤其在癌细胞发生转移的情况下愈发困难；化疗和放疗都是对癌细胞和正常细胞无区别或区别不大地毒杀，具有很大的毒副作用，并可能诱导癌细胞的抗药性。
[0004]同时，在传统临床应用中，癌症的诊断和治疗是两个相对独立的过程，在这种情况下，在等待诊断结果的时间会耽误癌症诊疗的最佳时期。况且诊断用药和治疗用药也是两种独立的药物都对患者有一定的副作用。在最近几年，治疗诊断学(Theranostics)作为一种新的理念，逐渐发展起来。
[0005]治疗诊断学将诊断和治疗两个过程合二为一，在得到诊断结果的同时，已经开始对癌症进行了治疗，这样对于一些早期的癌症能够起到很好的治疗效果。这种用于治疗诊断学的试剂通常被称为治疗诊断制剂(Theranostic Agent)。近年,纳米技术的飞速发展为治疗诊断剂的开发提供了全新的条件。利用纳米材料的可控合成以及表面修饰，可以得到具有诊断和治疗双重功能的纳米材料。
[0006]目前，在临床上所用的成像模式中，磁共振成像作为一种无创伤的成像模式被广泛的运用于临床诊断，其优点包括能够提供高清晰度和灵敏度的全身影响，另一方面，磁共振成像相对于CT和核素成像是一种相对比较安全的成像模式，不会对病人造成任何的离子辐射影响。在最近几年，很多研究组将各种光吸收纳米材料与磁性纳米颗粒复合构建多功能复合材料，实现磁共振成像指导下的肿瘤治疗。
[0007]例如，通过制备Fe304@Cu2_xS纳米复合物，将其用于肿瘤磁共振成像指导下的光热治疗；通过制备Fe5C2OC纳米复合物，从而同样实现了磁共振成像指导下的肿瘤治疗。然而，这些功能复合物的合成包括多个步骤且需要小心控制纳米材料的合成，另一方面，不同组分在体内的代谢以及降解途径也是不同的。因此，现有的开发具有成像和治疗多种功能于一体的纳米诊疗剂的技术仍存在许多不足。
[0008]目前，四氧化三铁纳米颗粒经过适当的表面修饰已经成为非常安全的临床T2磁共振造影剂，其可用于疾病的诊断。但是这些临床批准的造影剂仅仅是作为磁共振造影剂用于疾病诊断，并没有疾病治疗效果。这样就造成疾病诊断和治疗是两个相对独立的过程，诊断用药和治疗用药都会对病人造成一定的毒副作用。
【发明内容】

[0009]有鉴于此，本发明基于治疗诊断学，提供一种聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂，该诊疗剂同时具有诊断和治疗的双重作用，本发明还提供一种上述聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法，以及其在制备医学成像试剂和成像指导下的肿瘤光热治疗药物中的应用。
[0010]为实现上述目的，本发明的一种聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂，其具有层状结构，其由内至外依次包括:硫化亚铁层、三辛基氧化磷层、辛胺-聚丙烯酸层、聚烯丙基胺盐酸盐层、聚丙烯酸层，所述聚丙烯酸层表面修饰有六氨基支链聚乙二醇。
[0011]优选地，所述硫化亚铁层的厚度范围为:30-50nm。
[0012]优选地，所述硫化亚铁层具有类三角结构。
[0013]优选地，所述聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的厚度为110_130nm。
[0014]为实现上述目的，本发明的提供一种如上所述聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法，该方法包括如下步骤:
[0015]S1.以硫化亚铁纳米片为基底层，在基底层表面包覆三辛基氧化磷层，得到表面形成有三辛基氧化磷层的硫化亚铁纳米片；
[0016]S2.在所述三辛基氧化磷层上修饰辛胺-聚丙烯酸层，得到带负电荷的功能材料A ；
[0017]S3.在所述辛胺-聚丙烯酸层上连接聚烯丙基胺盐酸盐，形成聚烯丙基胺盐酸盐层，得到带正电荷的功能材料B ；
[0018]S4.在所述形成的聚烯丙基胺盐酸盐层上连接聚丙烯酸，形成聚丙烯酸层，得到带负电荷的功能材料C ;
[0019]S5.在所述功能材料C的表面修饰六氨基支链聚乙二醇，得到目标产物。
[0020]优选地,所述步骤SI具体包括:
[0021]Sll.提供乙酰丙酮亚铁，将乙酰丙酮亚铁和三辛基氧化磷加入溶剂中，在惰性气体氛围中，于140°C反应Ih除杂；
[0022]S12.将反应温度提高至220°C反应lh，加入溶有硫粉的油胺溶液，反应Ih ；
[0023]S13.反应结束后冷却，加入沉淀剂乙醇，得到沉淀并洗涤，即得表面形成有三辛基氧化磷层的硫化亚铁纳米片溶液，将其溶于环己烷溶液中备用。
[0024]优选地,所述步骤S2具体包括:
[0025]将硫化亚铁纳米片溶液吹干，并将吹干后的硫化亚铁纳米片转移到四氢呋喃溶液中，加入辛胺-聚丙烯酸于所述四氢呋喃溶液中，超声30min，搅拌过夜，利用氮气吹干，再使用弱碱溶液溶解并离心洗涤，得到带负电荷的功能材料A。
[0026]优选地，所述步骤S3中，所述聚烯丙基胺盐酸盐通过静电吸附和相互交联作用连接于所述辛胺-聚丙烯酸层上。
[0027]优选地，所述步骤S4中，所述聚丙烯酸通过静电吸附和相互交联作用连接于所述聚烯丙基胺盐酸盐层上。
[0028]为实现上述目的，本发明还提供一种根据如上所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂在制备肿瘤磁共振成像试剂中的应用。[0029]为实现上述目的，本发明还提供一种根据如上所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂在成像指导下的癌细胞的光热治疗药物中的应用。
[0030]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0031]1.本发明合成聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法简单，通过电荷之间的层层自组装技术即可完成，合成的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂在磁共振成像中肿瘤光热治疗效果显著，且水溶性良好。
[0032]2.应用本发明所合成的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂，通过肿瘤的滞留和渗透作用能够在肿瘤部位具有很高的富集量，然后再进行光热治疗，效果显著，不会对其他的部位造成损伤，治愈后不复发，与现有技术相比效果显著。
[0033]3.应用本发明所合成的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂，通过磁共振成像可以对癌症进行早期诊断，同时可在治愈后的磁共振造影中进行实时监测，结合实时监测结果可以给出合理的治疗计划，可广泛应用在临床诊断治疗技术中。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1为本发明的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法的流程示意图；
[0035]图2为实施例中包覆有三辛基氧化磷的硫化亚铁的透射电镜图片；
[0036]图3为实施例中包覆有三辛基氧化磷的硫化亚铁的粉末衍射数据；
[0037]图4为实施例中包覆有三辛基氧化磷的硫化亚铁的磁学性质表征数据；
[0038]图5为实施例中的合成的目标产物分散于不同生理溶液中的稳定性照片；
[0039]图6为实施例中合成的目标产物的水溶液和同样浓度的四氧化三铁的紫外吸收光谱图；
[0040]图7(a)为实施例中合成的目标产物的磁共振造影成像性能测试中各浓度下目标产物的磁共振造影成像；
[0041]图7(b)为实施例中合成的目标产物的磁共振造影成像性能测试中不同浓度下T2值的曲线图；
[0042]图8为实施例中合成的目标产物的光学吸收性质测试中不同浓度的目标产物溶液在激光照射下的升温曲线；
[0043]图9为实施例中合成的目标产物的光学吸收性质测试中不同浓度的目标产物溶液在激光照射下的升温照片；
[0044]图10为实施例中合成的目标产物的近红外热成像测试中对小鼠进行光热治疗时的近红外热成像照片；
[0045]图11为实施例中合成的目标产物的近红外热成像测试中对照组的肿瘤组织切片的微观照片；
[0046]图12为实施例中合成的目标产物的近红外热成像测试中注射目标产物组的肿瘤组织切片的微观照片；
[0047]图13为实施例中合成的目标产物的磁共振造影成像测试中对照组以及注射目标产物溶液的小鼠体内的磁共振成像照片，其中，照片上方为小鼠肿瘤造影，下方为小鼠肝造影。[0048]图14(a)为实施例中合成的目标产物的磁共振造影成像测试中对照组小鼠的肿瘤切片经过普鲁士兰染色后的微观照片；
[0049]图14(b)为实施例中合成的目标产物的磁共振造影成像测试注射目标产物组小鼠的肿瘤切片经过普鲁士兰染色后的微观照片；
[0050]图15为实施例中合成的目标产物的活体光热治疗测试中处理组和各对照组小鼠的肿瘤体积随时间变化曲线图；
[0051]图16为实施例中合成的目标产物的活体光热治疗测试中处理组和各对照组小鼠的存活曲线；
[0052]图17为实施例中合成的目标产物的活体光热治疗测试中处理组和各对照组中小鼠背部肿瘤形态照片，图17中从左至右分别为:对照组(I)、对照组(3)、对照组(2)、处理组；
[0053]图18为实施例中合成的目标产物的在小鼠体内长期的生物分布测试中不同时间下小鼠主要器官内铁含量的柱状图；
[0054]图19为实施例中合成的目标产物的在小鼠体内长期的生物分布测试中对照组及注射目标产物组的小鼠的肝和脾制成组织切片后进行普鲁士蓝染色的微观照片；
[0055]图20(a)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内谷丙转氨酶含量、碱性磷酸酶含量、谷草转氨酶含量随时间变化的柱状图；
[0056]图20(b)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内尿素氮含量随时间变化的柱状图；
[0057]图20(c)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内白蛋白与球蛋白比例随时间变化的柱状图；
[0058]图20(d)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内白蛋白含量随时间变化的柱状图；
[0059]图20(e)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内白细胞含量随时间变化的柱状图；
[0060]图20(f)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内血红蛋白含量随时间变化的柱状图；
[0061]图20(g)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内红细胞比容随时间变化的柱状图；
[0062]图20(h)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内血小板含量随时间变化的柱状图；
[0063]图20(i)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内红细胞含量随时间变化的柱状图；
[0064]图20(j)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内红细胞中血红蛋白平均含量随时间变化的柱状图；
[0065]图20(k)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内红细胞平均体积随时间变化的柱状图；
[0066]图20(1)为实施例中合成的目标产物的毒性测试中对照组及注射目标产物组小鼠体内红细胞平均浓度随时间变化的柱状图；[0067]图21为实施例中合成的目标产物的毒性测试中利用对照组及注射目标产物组的小鼠体内主要器官制作的组织切片随时间变化的微观照片。
【具体实施方式】
[0068]下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0069]本发明的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂(以下简称“诊疗剂”)具有层状结构，其由内至外依次包括:硫化亚铁层、三辛基氧化磷层、辛胺-聚丙烯酸层、聚烯丙基胺盐酸盐层、聚丙烯酸层，所述聚丙烯酸层表面修饰有六氨基支链聚乙二醇。上述各层之间通过电荷的作用力层层自组装形成。
[0070]具体地，诊疗剂以硫化亚铁层为基底，该基底上包覆有三辛基氧化磷层，辛胺-聚丙烯酸层通过疏水作用力修饰于三辛基氧化磷层上。进一步地，聚烯丙基胺盐酸盐层通过静电吸附和相互交联作用连接于所述辛胺-聚丙烯酸层上，聚丙烯酸层同样以静电吸附和相互交联作用连接于所述聚烯丙基胺盐酸盐层上。
[0071]所述诊疗剂具有超强的磁共振造影效果以及在近红外区的强吸收，可以用于肿瘤的光热治疗。从而，可利用同一纳米颗粒完成成像指导下的肿瘤光热治疗，避免成像和治疗两个过程的两种药物给病人带来的双重毒副作用。
[0072]所述硫化亚铁层的尺寸范围为:30-50nm，该硫化亚铁层具有类三角结构。所述聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的尺寸为110-130nm，该尺寸优选为120mm。本发明的诊疗剂的粒径为100~120nm。
[0073]所述聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂同时具有诊断和治疗的双重作用，基于本发明的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的性质。本发明还提出一种根据所述聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂在制备医学成像试剂中的应用。具体地，该医学成像试剂为肿瘤磁共振成像技术中的造影剂。
[0074]同时，本发明还提出一种根据所述聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂在成像指导下的癌细胞的光热治疗药物中的应用。
[0075]如图1所示，本发明的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法包括如下步骤:
[0076]S1.以硫化亚铁纳米片为基底层，在基底层表面包覆三辛基氧化磷层，得到表面形成有三辛基氧化磷层的硫化亚铁纳米片；
[0077]S2.在所述三辛基氧化磷层上修饰辛胺-聚丙烯酸层，得到带负电荷的功能材料A ；
[0078]S3.在所述辛胺-聚丙烯酸层上连接聚烯丙基胺盐酸盐，形成聚烯丙基胺盐酸盐层，得到带正电荷的功能材料B ；
[0079]S4.在所述形成的聚烯丙基胺盐酸盐层上连接聚丙烯酸，形成聚丙烯酸层，得到带负电荷的功能材料C ;
[0080]S5.在所述功能材料C的表面修饰六氨基支链聚乙二醇，得到目标产物。[0081]其中，所述步骤SI具体包括:
[0082]Sll.提供乙酰丙酮亚铁，将乙酰丙酮亚铁和三辛基氧化磷加入溶剂中，在惰性气体氛围中，于140°C反应Ih除杂；
[0083]S12.将反应温度提高至220°C反应lh，加入溶有硫粉的油胺溶液，反应Ih ；
[0084]S13.反应结束后冷却，加入沉淀剂乙醇，得到沉淀并洗涤，即得表面形成有三辛基氧化磷层的硫化亚铁纳米片溶液，将其溶于环己烷溶液中备用。
[0085]所述步骤S2具体包括:
[0086]将硫化亚铁纳米片溶液吹干，并将吹干后的硫化亚铁纳米片转移到四氢呋喃溶液中，加入辛胺-聚丙烯酸于所述四氢呋喃溶液中，超声30min，搅拌过夜，利用氮气吹干，再使用弱碱溶液溶解并离心洗涤，得到带负电荷的功能材料A。
[0087]所述步骤S3中，所述聚烯丙基胺盐酸盐通过静电吸附和相互交联作用连接于所述辛胺-聚丙烯酸层上。
[0088]所述步骤S4中，所述聚丙烯酸通过静电吸附和相互交联作用连接于所述聚烯丙基胺盐酸盐层上。
[0089]下面结合具 体的实施例对本发明的诊疗剂及其制备方法进行举例说明。
[0090]实施例
[0091]在50ml三颈烧瓶中，加入0.39mmol的乙酰丙酮亚铁和0.78mmol的三辛基氧化磷，再加入IOml油胺。在氮气的保护作用下，先加热到140°C维持30min，然后缓慢升温到220°C反应 lh。
[0092]然后将溶有3.125mmol硫粉的5ml油胺快速的注入反应液中，再在220°C反应lh。反应结束后，用环己烷和乙醇混合溶液洗涤四次，最后分散在5ml环己烷中，得到硫化亚铁纳米片的环己烷溶液。
[0093]下面对合成的硫化亚铁进行表征。
[0094]如图2所示，其为合成的硫化亚铁的透射电镜图片，从该图片中可以看出硫化亚铁表面包覆有大量的三辛基氧化磷层，且形成的包覆有三辛基氧化磷层的硫化亚铁的直径为 30_50nm。
[0095]如图3、4所示，图3为合成的硫化亚铁的粉末衍射数据，图4为合成的硫化亚铁的磁学性质表征数据。由图3可知，进行表征的物质为硫化亚铁。
[0096]将硫化亚铁纳米片分散在四氢呋喃中，然后加入自合成的辛胺-聚丙烯酸超声30min，然后搅拌过夜。用氮气吹干，加水溶解、离心去除多余的辛胺-聚丙烯酸。
[0097]然后再加入正电荷的聚烯丙基胺盐酸盐，与硫化亚铁纳米片表面的辛胺-聚丙烯酸进行静电吸附和交联，使硫化亚铁纳米片表面带有很强的正电荷。再加入聚丙烯酸与聚烯丙基胺盐酸盐交联，使硫化亚铁纳米片表面带有负电荷，此时将对六氨基支链聚乙二醇共价连接到硫化亚铁纳米片表面，使其具有很好的生物相容性，从而获得目标产物。
[0098]如图5所示，为实施例中的合成的目标产物分散于不同生理溶液中的稳定性照片。图5中，从左至右，使用到的生理溶液依次为水、生理盐水、细胞培养液、血清。由图5可知，目标产物在水溶液中具有很好的水溶性，在生理盐水中或者是血清中同样也具有很好的水溶性和稳定性。
[0099]如图6所示，为实施例中合成的目标产物的水溶液和同样浓度的四氧化三铁的紫外吸收光谱图。由图6可知，目标产物具有很强的光学吸收性质，可以将其应用在光热治疗中。
[0100]下面对实施例中的目标产物的磁共振造影成像性能进行测试。
[0101]将目标产物从高到低依次稀释成不同的浓度梯度，该浓度梯度依次为:0.008mM，
0.016mM,0.032mM,0.065mM和0.13mM。在磁共振成像系统上(Bruker)测试其磁共振造影成像性能。
[0102]如图7(a)、7(b)所述，图7(a)为上述梯度浓度下目标产物的磁共振造影成像，7(b)为磁共振造影成像中不同浓度下T2值的曲线图。
[0103]由图7 (a) ,7(b)可知，通过测定其T2值，该T2值呈线性关系变化，从而可以用作磁共振造影试剂。与现有的磁共振造影剂(例如:ferumoxsil, ferrixan和ferumoxide)相t匕，目标产物具有很强的磁共振造影效果且显著高于现有的磁共振造影剂，显著提高了癌症的诊断与治疗的灵敏度和分辨率。
[0104]下面对实施例中的目标产物的光学吸收性质进行测试。
[0105]如图8、9所示，图8为不同浓度的目标产物溶液在激光照射下的升温曲线，图9为不同浓度的目标产物溶液在激光照射下的升温照片。
[0106]具体地，将不同浓度的目标产物溶液置于1.5ml离心管中，利用808nm的激光(功率为lW/cm2)对各个离心管进行照射，并利用近红外热成像相机来监测溶液的温度变化。上述不同浓度的浓度值分别为:0.125mg/ml,0.25mg/ml,0.5mg/ml。同时，在进行目标产物的光学吸收性质测试时，利用水为对照组进行对比。
[0107]由图8、9可知，在5分钟之内，0.5mg/ml的目标产物在激光的照射下温度从室温22度迅速升高到70度，而对照组水温度基本上没有发生变化。如此表明目标产物比较强的光学吸收性质可以作为光热治疗的材料。
[0108]下面对实施例中的目标产物进行近红外热成像测试。
[0109]具体地，将目标产物通过尾静脉注射到小鼠体内，注射剂量为20mg/kg，注射24h后，同样使用808纳米的近红外激光器照射小鼠肿瘤部位，激光功率为lW/cm2，照射时间为5分钟。同时，在进行目标产物的近红外热成像试验时，设置未注射目标产物的小鼠为对照组。
[0110]如图10所示，图10为目标产物的近红外热成像测试中对小鼠进行光热治疗时的近红外热成像照片，其中，上方为对照组，下方为注射目标产物溶液组。
[0111]由图10可知，注射有目标产物溶液的小鼠，在激光照射以后，肿瘤表面的温度显著增加到60度，如此高的温度足以杀死肿瘤。而对照组小鼠的肿瘤表面温度只有微弱的升温。
[0112]照射后，将对照组和注射目标产物的小鼠的肿瘤组织制成切片。
[0113]如图11、12所示，分别为近红外热成像测试中对照组和注射目标产物组的肿瘤组织切片的微观照片。由图可知，注射目标产物组的肿瘤组织在激光照射后显示出明显的损伤。
[0114]下面对实施例中的目标产物进行磁共振造影成像测试。
[0115]首先将长有4T1肿瘤的小鼠麻醉，使用磁共振成像系统上进行磁共振成像(MRI)作为空白对照，然后将目标产物溶液通过尾静脉注射到小鼠体内，不同时间点对小鼠的肿瘤和肝部位进行磁共振成像。同时，设置未注射目标产物溶液的小鼠为对照组，并制作对照组和目标产物组的肿瘤切片，并对制作的肿瘤切片进行普鲁士兰染色。
[0116]如图13所示，为在磁共振造影成像测试中对照组以及注射目标产物溶液的小鼠体内的磁共振成像照片，其中，照片上方为小鼠肿瘤造影，下方为小鼠肝脏造影。由图13可知，目标产物溶液注射小鼠体内48h以后，肿瘤部位显著的变黑，表明目标产物通过肿瘤的渗透和滞留效应(EPR)显著的聚集在肿瘤部位。
[0117]如图14(a)、(b)所示，分别为对照组和注射目标产物组小鼠的肿瘤切片经过普鲁士兰染色后的微观照片，由图14(a)、(b)可知注入到小鼠体内的目标产物同样主要聚集在肿瘤部位。
[0118]下面对实施例中的目标产物进行活体光热治疗测试。
[0119]选取7~10只长有4T1肿瘤模型的小鼠，从尾静脉注射目标产物溶液，注射剂量为20mg/kg，注射24h以后，将肿瘤部位暴露在808纳米激光下照射5min，激光功率为IW/cm2。注射有目标产物溶液且进行激光照射的小鼠为处理组。
[0120]另外三组同样长有4T1肿瘤模型的小鼠(每组7只)作为对照组试验，三组对照组分别为:(I)没有进过任何处理的；(2)只进行激光照射处理；(3)注射同样剂量的目标产物溶液，但是不进行激光照射处理。当处理完每组小鼠之后，小鼠背部的肿瘤体积使用游标卡尺每隔二天测量一次。
[0121]如图15~17所示，图15为处理组和各对照组小鼠的肿瘤体积随时间变化曲线图；图16为活体光热治疗 测试中处理组和各对照组小鼠的存活曲线，其中，纵轴代表小鼠存活的百分比，即每组存活小鼠数量/实验小鼠总数；图17为处理组和各对照组中小鼠背部肿瘤形态照片。图17中，从左至右分别为:对照组(I)、对照组(3)、对照组(2)、处理组。
[0122]由图15可知，随时间的变化，处理组中小鼠的肿瘤体积不再增加，而各对照组小鼠的肿瘤体积随时间变化逐渐增大。从而，注射的目标产物具有很好的光热治疗效果。
[0123]由图16可知，处理组小鼠能过存活60天而不死亡，而其他对照组小鼠在18天左右相继死亡，从而同样表明由上述实施例获得的目标产物对于肿瘤具有很好的光热治疗效果，同时也没有引起小鼠的毒性或者死亡。
[0124]由图17可知，在处理组，所有的肿瘤在目标产物和激光光照处理后，两天后全部消除，留下一个黑色的疤点，一个星期后黑色疤点全部退去，肿瘤完全消失。此外，其他的对照组肿瘤在不断的生长。当肿瘤的体积超过Icm3时，认为死亡，在18天时对照组小鼠全部死亡，而治疗组在60天后仍然全部存活，且肿瘤部位没有重新再生。
[0125]下面对目标产物在小鼠体内长期的生物分布及其毒性进行测试。
[0126]将目标产物溶液通过尾静脉注射到小鼠体内(每只小鼠的剂量为100mg/kg，是治疗剂量的5倍)，每组5只。在不同的时间点将小鼠处死，取出主要的脏器，称重，用王水和高氯酸高温溶解，定容并用等离子体发射测定其中铁离子的含量，并计算每克组织中的铁含量。
[0127]收集不同时间点的小鼠的血液进行小鼠的血生化和血常规指标的测定。另外在不同的时间点取出主要的脏器(肝，脾，肾，心和肺)用4%甲醛固定，切片，并用苏木精和曙红染色。在徕卡光学显微镜下观察目标产物对主要的脏器有无损伤。
[0128]同时，设置未注射目标产物小鼠为对照组。[0129]如图18所示，其为不同时间下小鼠主要器官内铁含量的柱状图，设置的时间点分别为注射后I天、注射后7天、注射后50天。由图18可知，目标产物主要在肝和脾中进行富集。随着时间的延长，目标产物在各个脏器中逐渐减少，50天的后，铁在各个器官的富集的量降至与对照组相近的值。从而，表明目标产物在体内可以被慢慢代谢而出。
[0130]将对照组及注射目标产物组的小鼠的肝和脾制作组织切片，进行普鲁士蓝染色显
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[0131]如图19所示，其为对照组及注射目标产物组的小鼠的肝和脾制成组织切片后进行普鲁士蓝染色的微观照片。由图19可知，目标产物主要聚集在小鼠的肝和脾中，随着时间的延长，铁的含量逐渐降到背景值。
[0132]如图20(a)_(l)所示，分别测量随着时间的变化对照组及注射目标产物组的小鼠体内谷丙转氨酶含量、碱性磷酸酶含量、谷草转氨酶含量、尿素氮含量、白蛋白与球蛋白比例、白蛋白含量、白细胞含量、血红蛋白含量、红细胞比容、血小板含量、红细胞含量、红细胞中血红蛋白平均含量、红细胞平均体积、红细胞平均浓度。
[0133]由图20(a)_(l)可知，注射有目标产物溶液的小鼠，在50天的时间里，其各项指标基本维持在正常水平，从而目标产物并没有对小鼠的肝功能和肾功能以及血常规造成明显的毒性。
[0134]此外，为了研究目标产物对小鼠主要器官的影响，将目标产物形成的溶液注入到多个健康小鼠的体内，并在不同时间点，将小鼠的主要器官制作成组织切片，并用苏木精和曙红染色。上述不同时间点分别为:注射后I天、注射后7天、注射后50天。同时，设置未注入目标产物溶液的小鼠作为对照组。
[0135]如图21所示，其为利用对照组及注射目标产物组的小鼠体内主要器官制作的组织切片随时间变化的微观照片。其中，主要器官包括:肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺。
[0136]由图21可知，在50天的时间里目标产物对小鼠的主要器官没有明显的损伤影响。
[0137]综上所述，本发明的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的有益效果是:
[0138]1.本发明合成聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法简单，通过电荷之间的层层自组装技术即可完成，合成的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂在磁共振成像中肿瘤光热治疗效果显著，且水溶性良好。
[0139]2.应用本发明所合成的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂，通过肿瘤的滞留和渗透作用能够在肿瘤部位具有很高的富集量，然后再进行光热治疗，效果显著，不会对其他的部位造成损伤，治愈后不复发，与现有技术相比效果显著。
[0140]3.应用本发明所合成的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂，通过磁共振成像可以对癌症进行早期诊断，同时可在治愈后的磁共振造影中进行实时监测，结合实时监测结果可以给出合理的治疗计划，可广泛应用在临床诊断治疗技术中。
[0141]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0142]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的 其他实施方式。
【权利要求】
1.一种聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂具有层状结构，其由内至外依次包括:硫化亚铁层、三辛基氧化磷层、辛胺-聚丙烯酸层、聚烯丙基胺盐酸盐层、聚丙烯酸层，所述聚丙烯酸层表面修饰有六氨基支链聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂，其特征在于，所述硫化亚铁层具有类三角结构。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的尺寸为110-130nm。
4.一种如权利要求1~3任一项所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤: 51.以硫化亚铁纳米片为基底层，在基底层表面包覆三辛基氧化磷层，得到表面形成有三辛基氧化磷层的硫化亚铁纳米片； 52.在所述三辛基氧化磷层上修饰辛胺-聚丙烯酸层，得到带负电荷的功能材料A； 53.在所述辛胺-聚丙烯酸层上连接聚烯丙基胺盐酸盐，形成聚烯丙基胺盐酸盐层，得到带正电荷的功能材料B ; 54.在所述形成的聚烯丙基胺盐酸盐层上连接聚丙烯酸，形成聚丙烯酸层，得到带负电荷的功能材料C ； 55.在所述功能材料C 的表面修饰六氨基支链聚乙二醇，得到目标产物。
5.根据权利要求4所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，所述步骤SI具体包括: 511.提供乙酰丙酮亚铁，将乙酰丙酮亚铁和三辛基氧化磷加入溶剂中，在惰性气体氛围中，于140°C反应Ih除杂； 512.将反应温度提高至220°C反应lh，加入溶有硫粉的油胺溶液，反应Ih； 513.反应结束后冷却，加入沉淀剂乙醇，得到沉淀并洗涤，即得表面形成有三辛基氧化磷层的硫化亚铁纳米片溶液，将其溶于环己烷溶液中备用。
6.根据权利要求4所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括: 将硫化亚铁纳米片溶液吹干，并将吹干后的硫化亚铁纳米片转移到四氢呋喃溶液中，加入辛胺-聚丙烯酸于所述四氢呋喃溶液中，超声30min，搅拌过夜，利用氮气吹干，再使用弱碱溶液溶解并离心洗涤，得到带负电荷的功能材料A。
7.根据权利要求4所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述聚烯丙基胺盐酸盐通过静电吸附和相互交联作用连接于所述辛胺-聚丙烯酸层上。
8.根据权利要求4所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述聚丙烯酸通过静电吸附和相互交联作用连接于所述聚烯丙基胺盐酸盐层上。
9.一种根据权利要求1~3任一项所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂在制备肿瘤磁共振成像试剂中的应用。
10.一种根据权利要求1~3任一项所述的聚乙二醇修饰的硫化亚铁磁性纳米诊疗剂在成像指导下的癌 细胞的光热治疗药物中的应用。
【文档编号】A61K41/00GK104013978SQ201410274326
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】杨凯, 刘庄 申请人:苏州大学