磷灰石预处理的制作方法
【专利说明】磯灰石预处理
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求于2014年6月23日提交的美国临时申请第62/015, 894号、2014年 11月19日提交的美国临时申请第62/082, 017号；W及2015年4月23日提交的美国临时 申请第62/151，882号的优先权，Ξ者的全部内容通过引用纳入本文。
[000引背景
[0004] 在其它憐灰石固体表面之中，将憐灰石固体支持面，包括径基憐灰石、陶瓷憐灰 石、氣憐灰石和氣强化憐灰石（fluorideenhancedapatite),用于各种目标分析物的纯 化。憐灰石最常用于生物分析物纯化，所述生物分析物包括蛋白质、碳水化合物、多核巧酸 和病毒颗粒。憐灰石具有作为纯化支持物的独特性质，因为其在单一支持物中提供亲和性、 离子交换和/或水合氨离子相互反应的形式。
[0005] 憐灰石恢复方法恢复了憐灰石纯化过程后的质量损失。不过，质量损失可W在憐 灰石纯化过程之前发生，即在干憐灰石树脂的水合作用、柱填充过程中和在样品加载前发 生。
【发明内容】
[0006] 本文公开了憐灰石预处理方法。还公开了憐灰石再生方法。
[0007] 在一个实施方式中，在使用前处理憐灰石固体表面的方法包括（a)将所述憐灰石 固体表面与抑至少为约6. 5的憐酸盐缓冲的溶液接触；W及化）将所述憐灰石固体表面与 含有氨氧化物的溶液接触。在一些实施方式中，步骤（a)在步骤化）之前进行。在一些实 施方式中，所述憐酸盐缓冲的溶液是含有约0. 1至约1. 0M憐酸盐、抑为约6. 5至约10的 溶液。在一些实施方式中，所述憐酸盐缓冲的溶液是400mM憐酸盐，pH为8.0。在某些实施 方式中，所述氨氧化物包括碱性氨氧化物。在一些实施方式中，所述碱性氨氧化物是氨氧化 钢或氨氧化钟。
[0008] 在一些实施方式中，所述方法还包括用憐灰石固体表面纯化目标分析物，所述纯 化包括：(a)用目标分析物接触憐灰石固体表面，从而从一种或多种污染物中分离目标分 析物；化）收集所述目标分析物；W及（C)再生所述憐灰石固体表面，所述再生包括：（i)用 缓冲巧溶液（包含浓度至少约为lOmM的巧离子和两性离子缓冲剂）接触所述憐灰石固体 表面，其中两性离子缓冲剂浓度与巧离子浓度的比例至少为约2,所述溶液的抑至少为约 6. 5 ;扣）用抑至少为约6. 5的憐酸盐缓冲的溶液与所述憐灰石固体表面接触拟及（iii) 用含有氨氧化物的溶液接触所述憐灰石固体表面。
[0009] 在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，所述方法（a)包括将所述目标分析 物与憐灰石固体表面结合，W及化）包括从所述憐灰石固体表面洗脱所述目标分析物。在 另一个实施方式中，所述方法（a)包括将所述憐灰石固体表面与所述目标分析物接触，从 而将所述目标分析物流动通过所述憐灰石固体表面，W及化）包括在流动通过物中收集所 述目标分析物。
[0010] 在一个实施方式中，所述两性离子缓冲剂是含横酸的缓冲剂。在一些情况中，所述 含横酸的缓冲剂是MES、PI阳S、ACES、MOPSO、MOPS、邸S、TES、肥阳S、DIPSO、TAPS、TAPSO、POPSO或肥PPSO、EPPS、CAPS、CAPSO或C肥S。在一些情况中，所述含横酸的缓冲剂是MES。 [00川 在一个实施方式中，所述巧离子至少为约ImM、2mM、3mM、4mM、5mM、lOmM(例如 10.ImM、10. 2mM、10. 3mM、10. 4mM或 10. 5mM)，20mM、25mM或至少为约 50mM。在另一个实施方 式中，两性离子缓冲剂浓度与巧离子浓度的比例至少为约2. 5、3或4。在另一个实施方式 中，所述缓冲的巧溶液包含氯化巧或硝酸巧。在另一个实施方式中，所述憐酸盐缓冲的溶液 包含含有从约0. 1M或0. 2M至约1. 0M憐酸盐，或从约0. 1M或0. 2M至约0. 5M憐酸盐，抑为 约6. 5-8的溶液。在一些情况中，所述憐酸盐缓冲的溶液包含400mM憐酸盐，抑为7. 0。
[0012] 在一个实施方式中，所述氨氧化物包括碱性氨氧化物。在一些情况中，所述碱性氨 氧化物包括氨氧化钢或氨氧化钟。在一个实施方式中，所述再生逆转或消除在蛋白质纯化 或柱清洁步骤中发生的所述柱的降解。在另一个实施方式中，所述再生将憐灰石固体表面 的强度增加了至少约1 %、5%、10%、15%、20%或更多。
[0013] 在一个实施方式中，所述再生在洗脱吸附的生物化合物的憐酸盐清洁/剥离步骤 之前进行或替代该步骤进行。在一些情况中，所述再生步骤在洗脱目标分析物之后进行。
[0014] 在一个实施方式中，所述用含有憐酸盐，抑至少为约6. 5的溶液接触所述憐灰石 固体表面的步骤（U)还包括：用含有憐酸盐浓度为lOmM或低于约lOmM，抑值至少为约 6. 5或7的溶液接触所述憐灰石固体表面；随后用含有憐酸盐浓度至少为约lOOmMJOOmM、 400mM或500mM，抑值至少为约6. 5或7的溶液与所述憐灰石固体表面接触。
[0015] 在一个实施方式中，所述再生包括（i)、清洗、（ii)和（iii)。
[001引发明详述
[0017] 本文公开了用于预处理憐灰石固体表面的方法。已发现，预处理方法防止或减少 了在用于从样品中纯化目标分子的色谱过程中第一次使用之前的憐灰石固体表面的劣化 (即质量损失）。在结合和洗脱或流动通过纯化过程之前，可应用憐酸盐缓冲的溶液，随后 应用碱性氨氧化物。
[0018] 本文还公开了用于再生憐灰石固体表面的方法。已发现，通过用缓冲的巧溶液处 理所述憐灰石固体表面、随后用憐酸盐缓冲的溶液处理、随后用碱性氨氧化物处理，再生方 法能减少、消除或逆转在至少一个色谱过程中使用后的憐灰石固体表面的劣化。所述缓冲 的巧溶液、憐酸盐缓冲的溶液和碱性氨氧化物可接下来应用于结合和洗脱或流动通过纯化 过程。
[001引定义
[0020] "憐灰石"是指通式为Cas(P〇4)3佩的憐酸盐和巧的矿物，其中X为带负电荷的离 子。通常X是F、C1或0H。不过憐灰石的结构和化学性质允许有多种替代，包括替代结构 中Ca的各种金属阳离子（例如K、化、Μη、Ni、Cu、Co、化、Sr、Ba、Pb、Cd、Sb、Y、U或各种稀 ±元素中的一种或多种），W及替代结构中P〇43的阴离子复合物（例如AsO43、S〇42、C〇32、 Si〇4 4等）。
[0021] "径基憐灰石"是指包含结构式为化1。(P〇4)e(0H) 2的不可溶的憐酸巧的径基化矿物 的混合式固体支持物。其相互作用的主要模式是憐酷基阳离子交换和巧金属亲和力。径基 憐灰石是市售可得的，其可有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形 式。复合材料形式包含包埋在琼脂糖或其它珠的孔内的径基憐灰石微晶。
[00过"氣憐灰石"是指包含结构式为Cai。(P04)化的不可溶的憐酸巧的加氣 (fluoridated)矿物的混合式支持物。其相互作用的主要模式是憐酷基阳离子交换和巧金 属亲和力。氣化憐灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和 复合材料形式。
[0023] "憐灰石固体表面"是指稠合的纳米晶体（陶瓷憐灰石）、微晶或化合的憐灰石的 微晶。憐灰石固体表面包括但不限于径基憐灰石或氣憐灰石。陶瓷憐灰石包括但不限于陶 瓷径基憐灰石（例如CHT?)或陶瓷氣憐灰石。陶瓷憐灰石是憐灰石矿物的一种形式，其中 纳米晶体团聚成颗粒并在高溫下烙凝W形成适用于色谱应用的稳定的陶瓷微球。化合的 微晶包括但不限于HAUltmgel液（巧尔公司（PallCo巧.））。微晶包括但不限于Bio-Gel HTP、Bio-Gel狡HT、DM级HT(伯乐公司度io-Rad))和HypatiteC(克拉克森色谱公司 (C1曰rksonChrom曰togr曰phy))〇
[0024] "样品"是指含有感兴趣的目标分子或颗粒的任何组合物。样品可W未纯化或部分 纯化。样品可包括生物来源的样品，包括但不限于：血液或血液组分（包括但不限于血清）、 尿液、唾液、排泄物W及组织。样品可来源于未纯化的、部分纯化的或纯化的细胞裂解物或 用过的细胞生长介质。
[00巧]"目标分子"或"目标分析物"是指样品中待检测的分子或分析物。在一些实施方 式中，该目标分子是肤、蛋白质（如抗体、酶、生长调节因子、凝血因子或憐蛋白）、多核巧酸 (例如DNA(如dsDNA或ssDNA) ;RNA(如mRNA或miRNA);或DNA-RNA杂交体）、适体、粘合 素（affimer)、肤核酸、碳水化合物、病毒、病毒样颗粒、药物化合物、代谢物或细胞。
[0026] 在树脂水合和柱填充过程中发生的树脂劣化可引起巧损失、树脂颗粒强度损失和 颗粒断裂的增加。在一些实施方式中，运样的影响可通过本文所述的方法防止或减少。
[0027] 色谱过程中使用后发生的树脂劣化可造成树脂颗粒失去其强度，并因而断裂成导 致柱内阻塞的较小颗粒。劣化也可W憐灰石的化学破损形式出现，造成质量损失，运可转而 导致出现柱体积损失、颗粒强度损失、颗粒断裂增加或其组合。在一些实施方式中，运样的 影响可通过本文所述的方法逆转。可通过实践本发明的方法而实现的劣化的逆转可导致较 低的树脂质量损失速率、较低的颗粒强度减弱速率，或同时导致上述两者。在许多情况中， 劣化的逆转可伴随树脂质量增加、颗粒强度增加或两者均有。
[0028] 可通过例如称重干燥的憐灰石样品，例如清洗掉缓冲液组分和吸附的生物化合物 后的样品，来测定憐灰石固体表面的质量。可通过例如测定对揽动力（例如揽拌）、超声处 理或压缩（例如单轴压缩力的应用）的耐受性来测定憐灰石介质强度。可通过处理后的憐 灰石固体表面的检查W测量细小物质的生成来测定对超声处理或揽动力的耐受性。可通过 测量将给定质量的憐灰石压缩到设定的恒定终端力所需的力并测定压缩距离来测量对压 缩的耐受性。可相对于没有经受过憐灰石纯化（即使用憐灰石的目标分子的纯化）或憐灰 石再生过程的样品来测定憐灰石劣化或降解。
[0029] "碱性氨氧化物"是指包含元素周期表第1族中任何阳离子元素（包括例如裡 (Li)、钢（化)、钟化)、钢巧b)、飽（Cs)和巧（化)）的碱金属氨氧化物。因此，示例性的碱性 氨氧化物包括但不限于化0H、LiOH和K0H。
[0030] 两性离子缓冲剂是一种可同时含有带正电荷和带负电荷的缓冲剂。示例性的两性 离子缓冲剂可包括但不限于含横酸基团的缓冲剂。如本文中所用的，"横酸"是指具有通式 RS( = 0)2-OH的一类有机硫化合物中的一种，其中R是有机基团（例如烷基或締基或芳 基），S( = 0) 2 - 0H是横酷基氨氧化物。
[0031] 包含横酸基团的示例性的两性离子缓冲剂可包括但不限于氨基烷基横酸 (aminoa化anesul化nicacids)。示例性的氨基烷基横酸可包括但不限于在氨基和横酸基 团之间具有最少2个碳的氨基烷基横酸。包含横酸基团的示例性的两性离子缓冲剂可包括 但不限于N,N-二烷基氨基甲烧横酸（N,N-dia化ylaminomethanesulfonicacids)。
[003引包含横酸基团的示例性的两性离子缓冲液可包括但不限于：MES(2-(N-吗嘟代） 乙横酸）、PI阳S(1，4-赃嗦二乙横酸）、ACES(2-(氨基甲酯甲烧氨基）乙横酸）、M0PS0 (3-吗 嘟代-2-径基丙横酸）、M0PS(3-吗嘟代丙烷-1-横酸）、邸S(N，N-双（2-径乙基）-2-氨基乙 横酸）、TES(2- [ [ 1，3-二径基-2-(径甲基）丙-2-基]氨基]乙横酸），肥PES(2- [4- (2-径 乙基）赃嗦-1-基]乙横酸）、DIPS0(3-(N，N-双[2-径乙基]氨基）-2-径丙横酸）、 TAPS(3-[[1，3-二径基-2-(?甲基）丙-2-基]氨基]丙-1-横酸）、TAPS0(3-[[1，3-二 径基-2-(?甲基）丙-2-基]氨基]-2-径丙-1-横酸）、P0PS0(赃嗦-1,4-双（2-径 丙横酸））或肥PPS0(N-(2-^乙基）赃嗦-Ν' -(2-径丙横酸））、EPPS(N-(2-^乙基） 赃嗦-Ν' -(3-丙横酸））、CAPS(3-(环己基氨基）-1-丙横酸）、CAPS0