以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的骨桥蛋白产生 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及能够预防或改善因骨桥蛋白（osteopontin ;0ΡΝ)产生充进而引起的 疾病（例如，癌转移）的、以盘基网柄菌吡喃酮（Dictyopyrone)衍生物或二氢盘基网柄菌 P比喃酮（Dihydrodictyopyrone)衍生物为有效成分的OPN产生抑制剂。
【背景技术】
[0002] OPN是被鉴定为构成钙沉积的骨组织的基质（matrix)的主要非骨胶原性蛋白质 且分子量为41kDa的分泌型酸性磷酸化糖蛋白质。已确认其在乳汁、尿、肾小管、破骨细胞、 成骨细胞、巨噬细胞、活化T细胞以及较多的肿瘤组织中表达广泛。OPN被认为在骨基质中 发挥连接破骨细胞和羟磷灰石的架桥的作用（非专利文献1)，但是除此以外还报告称具有 参与细胞粘着、细胞迀移、一氧化氮产生的抑制、肿瘤或免疫系统的多种功能。
[0003] OPN表达与肿瘤的发展相关，并且表示与癌转移的相关性。在肺癌、肝癌、乳癌或 前列腺癌的患者的血浆中检测出OPN(非专利文献2)，报告称与正常部位相比癌部位的OPN mRNA上升（非专利文献3)，并且报告称神经胶质瘤中的OPN表达也具有与恶性度相关的倾 向（非专利文献4)。OPN表达与肿瘤的相关在动物模型中也被确认（非专利文献5)。根据 这样的与OPN相关的最近的见解认为抑制促进肿瘤细胞的转移以及侵袭的OPN的产生是防 止癌转移的抗癌剂的一种新靶点（非专利文献6)。
[0004] 现有技术文献： 非专利文献： 非专利文南犬 I :Miyauchi A, Alvarez J, Greenfield EM, Teti A, Grano M, Colucci S, Zambonin-Zallone A,Ross FP,Teitelbaum SL,Cheresh D,Hruska KA. (1991) Recognition of osteopontin and related peptides by an alpha v beta 3integrin stimulates immediate cell signals in osteoclasts. J Biol Chem 266,20369-20374. 非专利文献 2:Senger DR，Perruzzi CA,Gracey CF,Papadopoulos A，Tenen DG. (1988)Secreted phosphoproteins associated with neoplastic transformation: close homology with plasma proteins cleaved during blood coagulation. Cancer Res 48,5770 - 5774. 非 专利 文南犬 3 ：Brown LFj Papadopo μ Los-Seigiou A, Brygida B，Manseau EJ，Tognazzi K，Perruzzi CA, Dvorak HF, Senger DR. (1994)Osteopontin expression in human carcinoma. Am J Pathol. 145, 610 - 623. 非专利文献 4 :Saitoh Y，Kuratsu JI，Takeshima H，Yamamoto S，Ushio Y (1995) Expression of osteopontin in human glioma. Lab Invest 72,55-63. 非专利文献 5 :Suzuk M，Mose E，Galloy C，and Tarin T(2007)Osteopontin Gene Expression Determines Spontaneous Metastatic Performance of Orthotopic Human Breast Cancer Xenografts. Am J Pathol 171,682 - 692. 非专利文献6:Weber GF(2001)Review:The metastasis gene osteopontin:a candidate target for cancer therapy. Biochim Biophys Acta 1552,61-85. 非专利文献 7 :Kikuchi H，Sasaki Kj Sekiya J，Maeda M，Amagai A，Kubohara Y and Oshima Y(2004)Dihydrodictyopyrone A and C:new members of dictyopyrone family isolated from Dictyostelium cellular slime molds Bioorg Med Chem 12,3203-3214. 非专利文献8 :Matsuura M，Suzuki T，Suzuki M，Tanaka R，Ito E and Saito T(2011) Statin-mediated reduction of osteopontin expression induces apoptosis and cell growth arrest in ovarian clear cell carcinoma. Oncol Rep 25,41-47. 非 专利 文南犬 9 :Haruhisa Kikuchij Koji Nakamura, Yuzuru Kuboharaj Naomi Gokanj Kohei Hosakaj Yasuo Maedad and Yoshiteru Oshima，Tetrahedron Letters 48(2007)5905-5909.。
【发明内容】
[0005] 发明要解决的问题： 如上所述，通过抑制OPN的产生，以此可以防止癌转移。作为具有OPN产生抑制作用的 药物，已知有作为PPAR-γ (Peroxysome Proliferator-Activated Receptor-γ ;过氧化物 酶体增殖物激活受体γ)激动剂的胰岛素抵抗性改善药（曲格列酮、匹格列酮、罗格列酮）、 非甾体抗炎药（例如，吲哚美辛或布洛芬）以及作为HMG-CoA还原酶抑制剂的他汀类高胆 固醇血症治疗药（例如，瑞舒伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他 汀、西立伐他汀、匹伐他汀以及美伐他汀）。
[0006] 另一方面，细胞性粘菌是广泛分布于土壤表层中的一种原生生物，在生态循环中 同时具备动物性与植物性、单细胞与多细胞这样的较大不同的性质，并且包括如细胞运动、 细胞质分裂或分化等的构成多细胞生物的产生系统的主要过程。与天然化学中以往经常利 用的生物种大为不同，因此期待产生各种新型化合物。
[0007] 本发明的目的是提供能够预防因 OPN产生亢进而引起的疾病（例如癌转移）的 OPN产生抑制剂。
[0008] 解决问题的手段： 本发明人等为了发现抑制OPN的基因表达的化合物，而使用在OPN启动子的控制下表 达报告基因的荧光素酶的细胞株，并且将如盘基网柄菌（D.discoideum)那样的细胞性粘 菌的二次代谢产物作为对象进行了筛选。
[0009] 其结果是，本发明人等在盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍 生物中发现了抑制荧光素酶表达的化合物。
[0010] 本发明人等又发现了这样的抑制在OPN启动子控制下的荧光素酶活性的化合物 会降低人小细胞肺癌细胞株A549或人肝癌细胞株H印G2所产生的OPN量。本发明人等进 一步通过细胞划痕实验（Wound-Healing assay)发现盘基网柄菌P比喃酮衍生物以及二氢盘 基网柄菌吡喃酮衍生物抑制OPN的生理功能的细胞迀移能力，并且通过基质胶侵袭实验发 现盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物抑制细胞的转移以及侵袭 能力，从而完成本发明。
[0011] 具体而言，本发明涉及以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生 物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂。
[0012] 报告称在盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物中存在具 有抑制人白血病细胞K562细胞的增殖的活性的化合物（非专利文献7)，但是OPN产生抑制 剂作用至今未被报道。
[0013] 作为盘基网柄菌吡喃酮衍生物，优选的是化学式1或化学式2表示的化合物。
[0016] 作为二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物，优选的是化学式3或化学式4表示的化合物。
[0019] 发明效果： 本发明的以盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分 的OPN产生抑制剂是具有不同于胰岛素抵抗性改善药或他汀类高胆固醇血症治疗药的作 用机理的OPN产生抑制剂。
【附图说明】
[0020] 图1示出通过添加化合物3 (化学式3示出的化合物）而产生的A549细胞的OPN 产生抑制效果的图表； 图2示出通过添加化合物3 (化学式3示出的化合物）而产生的H印G2细胞的OPN产 生抑制效果的图表； 图3示出通过添加化合物3 (化学式3示出的化合物）而产生的A549细胞的创伤恢复 抑制效果的图表； 图4示出通过添加化合物3 (化学式3示出的化合物）而产生的A549细胞的基质侵袭 抑制效果的图表； 图5示出相对于由SVS (simvastatin ;辛伐他汀）所产生的OPN产生量抑制效果的、通 过添加 MVA (mevalonic acid ;甲轻戊酸）而产生的恢复效果的图表； 图6示出相对于由化合物3所产生的OPN产生量抑制效果的、通过添加 MVA而产生的 影响的图表。
【具体实施方式】
[0021] 关于本发明的实施形态，适当参照附图进行说明。本发明不限于以下记载。
[0022] < A :0ΡΝ启动子控制下的荧光素酶表达抑制效果的确认方法> 在pGL-3basic载体（Promega)的多克隆位点中组入人OPN启动子序列（从一 765至 23)而形成的报告载体pOPNl-luc在转染至动物细胞中时表达荧光素酶。将该pOPNl-luc 与表达噪呤霉素耐性基因（puromycin-N-acetyl-transferase gene)的 pPUR(Clontech) 一起转染至人非小细胞肺癌细胞株A549,并且选择了能够在嘌呤霉素添加培养基中增殖且 表达荧光素酶的细胞。将选择的细胞命名为A549/0PN1UC细胞，并且使用于后述的OPN启 动子控制下的荧光素酶表达抑制效果的观察中。
[0023] 将被试化合物添加到A549/0PN1UC细胞的培养液中，并且观察了对细胞内的荧光 素酶表达量的影响。在这里，考虑到在被试化合物具有细胞毒性或细胞增殖抑制效果的情 况下，因依赖于被试化合物的浓度的活细胞数量的减少而总荧光素酶表达量下降，无法正 确地评价被试化合物在OPN启动子控制下的荧光素酶表达抑制效果。因此，首先实施作 为通过显色测定对细胞增殖能力或细胞生存能力进行定量的方法的WST(water-soluble tetrazolium salt;水溶性四氮唑盐）实验，并且求出被试化合物对于细胞增殖的 IC50 (50%细胞增殖抑制浓度）。之后，实施荧光素酶活性测定，求出被试化合物对于OPN启 动子控制下的荧光素酶表达的EC50 (50%荧光素酶表达抑制浓度）。
[0024] Al) WST 实验 使A549/0PN1UC细胞在添加了 10%胎牛血清（FCS)以及1%青霉素-链霉素（P/S)的 DMEM培养基中达到3X 104cells/mL并悬浮于其中，并且将它向96孔板的各孔内分别注入 100 μ L。由于将试验重复实施三次（triplicate)，因此作为对照组以及各浓度的被试化合 物添加用孔，每个分别准备了三个孔。在分注后，将96孔板在二氧化碳培养器（37°C，5% CO2条件下）中培养24±4小时。
[0025] 将被试化合物通过二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide ;DMS0)形成50mmol/L溶液， 并且保存在一 80°C。为了 WST实验，准备了将该被试化合物溶液通过DMSO稀释为两倍稀 释系列（通常是0. 31mmol/L~20mmol/L的范围）而浓度分别以两倍变化的被试化合物溶 液。
[0026] 在加入了细胞悬浮液的各孔内分别注入0. 5 μ L仅DMSO(对照）或者稀释的被试 化合物（待测样品）的溶液（稀释200倍）。通过涡旋混合器（vortex mixer)混合后，将 96孔板在二氧化碳培养器（37°C，5% CO2条件下）中培养48±4小时。之后，将预混WST-I 试剂（Pr