l]-isoindole_l, 3-dione)溶解于6mL的甲醇中，并且添加水合肼1038mg，加热回 流6小时。恢复到室温后，在反应液中添加 IM氢氧化钠水溶液30mL，用30mL的乙酸乙酯 萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一起，用60mL的水以及60mL的饱和食盐水分别 洗涤后，使用无水硫酸钠进行干燥，将减压蒸馏溶剂。将该残渣溶解于6mL的甲苯中，并且 添加 564mg 的 2, 2_ 二甲基 _5_ 辛醜基 _1，3_ 二恶烧 _4, 6_ 二酬（2, 2-dimethyl_5-〇ctano yl-1, 3-dioxane-4, 6-dione)，加热回流15小时。恢复至室温后，将反应液进行减压蒸馏。 将残渣进行硅胶柱层析，由被己烷-乙酸乙酯（2:1)洗脱的组分得到51mg的（S)-N-[l-甲 基-2-(2-甲基-1，3-二恶烷-2-基）乙基]-3-氧代癸酰胺（(3)4-[1116也71-2-(2116七 hyl-1, 3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-〇xodecanamide)〇
[0057] 将47mg的⑶-N-[I-甲基-2-(2-甲基-1，3-二恶烷-2-基）乙基]-3-氧代癸 酰胺溶解于80 %醋酸水溶液3mL中，在室温下搅拌7小时。将反应液减压蒸馏，将残渣进行 硅胶柱层析，由被己烷-乙酸乙酯（2:1)洗脱的组分得到38mg的（S)-N-(l-甲基-3-氧代 丁基）-3-氧代癸酰胺（（S) -N- (l-methyl-3-oxobutyl) -3-〇xodecanamide)。
[0058] 将23mg的（S) -N- (1-甲基-3-氧代丁基）-3-氧代癸酰胺溶解于2mL的N，N-二 甲基甲酰胺中，添加3mg的氢化钠（60%，分散在矿物油中），在室温搅拌10小时。将反应 液注入至IOmL的0. 5M盐酸中，使用IOmL的乙酸乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部 合在一起，用20mL的水以及20mL的饱和食盐水分别洗涤后，使用无水硫酸钠进行干燥，减 压蒸馏溶剂。将残渣进行硅胶柱层析，由被己烷-乙酸乙酯（2:1)洗脱的组分得到9mg的 (S) _5, 6_ 二氛 _4, 6_ 二甲基 _3_ 辛醜基-IH- P比啶 _2_ 酬（（S) _5, 6-dihydr〇-4, 6-dimethy l-3-〇ctanoyl-lH-pyridin-2-〇ne)(化学式 11 表示的化合物）。
[0059] 将产物通过基于EMS (电子轰击质谱）法的质量分析以 及NMR进行解析。E頂S以及NMR的结果如下。1H-NmrgoomHzJDCI 3) d 5. 52 (1H, br. s), 3. 65-3. 78 (1H, m), 2. 72 (2H, t, J = 7. 6Hz), 2. 31 (1H, dd, J = 17. 2, 5. 6Hz), 2. 23 (1H, dd, J = 17. 2, 7. 2Hz), I. 92 (3H, s), I. 60 (2H, quint, J = 7. 6Hz), I. 23-1. 35 (8H, m), I. 24 (3H, d, J = 6. 8Hz), 0. 87 (3H, t, J = 7. 0Hz) ；EIMS m/z (rel. int) 251 [M]+ (33), 236 (57), 180 (100), 167 (69), 152 (76), 109 (23)。
[0060] [化合物14所示的化合物的制造方法] 将按照非专利文献7的记载合成的IOmg的3-十二酰基-5, 6-二氢-4, 6, 6-三甲 基-2H-吡喃 _2_ 酮（3-dodecanoyl_5, 6-dihydr〇-4, 6, 6_trimethyl-2H-pyran-2-〇ne)溶 解于ImL的乙酸乙酯中，添加 Img的20 %氢氧化钯-碳，在氢气气氛下，在室温中搅拌20 小时。过滤反应液而去除钯碳，将其滤液进行减压蒸馏。将残渣进行硅胶柱层析，由被己 烷-乙酸乙酯（19:1)洗脱的组分得到9mg的化学式14所示的化合物。
[0061] 将产物通过基于E頂S (电子轰击质谱）法的质量分析以及NMR进行解析。EMS 以及 NMR 的结果如下。1H-NmrGOOMHz, CDCl3) d 3. 13 (1H, d, J = 10. 8Hz)，2. 87 (1H, dt，J =14. 8, 7. 2Hz), 2. 59-2. 67(1H, m), 2. 55(1H, dt, J = 14. 8, 6. 8Hz), I. 84 (1H, dd, J = 13. 4, 4. 0Hz), I. 57-1. 66 (2H, m), L 51 (1H, t, J = 13. 4Hz), I. 43 (3H, s), L 42 (3H, s), I. 25 -1.31(16H,m),0. 95(3H, d, J = 6. 4Hz), 0. 88 (3H, t, J = 6. 6Hz) ；EIMS m/z (rel. int) 324 [M] +(3), 309(6), 84(100) 〇
[0062] [表 1]
[0063] 关于化学式1、化学式2以及化学式8所示的盘基网柄菌吡喃酮衍生物、和化学 式3、化学式4、化学式15以及化学式16所示的二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物，EC50浓度 为IC50浓度的1/2以下。尤其是，对于化学式1~4所示的化合物（化合物1~化合物 4)，EC50浓度小于30 μ M，在低浓度下将OPN启动子控制下的荧光素酶（OPN Luc)表达抑制 50%〇
[0064] < B :化合物3对于人非小细胞肺癌细胞株Α549以及人肝癌细胞株!fepG2的OPN 产生的抑制效果> 如上所述证实了在盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物中，存 在以抑制50%细胞增殖的浓度（IC50)的1/2以下的浓度将OPN启动子控制下的荧光素酶 表达抑制50%的化合物。因此，对于EC50浓度最低且IC50浓度示出EC50浓度的两倍以上 的化学式3所示的化合物（化合物3)进行了是否能够实际抑制由癌细胞株产生的OPN量 的确认试验。
[0065] 将化合物3加入至人非小细胞肺癌细胞株A549以及人肝癌细胞株H印G2的培 养液中，将培养两天后的培养上清中的OPN量使用人骨桥蛋白免疫检测试剂盒（Human Osteopontin Immunoassay Kit) (R&D systems)进行测定，通过与化合物3无添加组（对照 组）的OPN量进行比较，以此进行确认试验。
[0066] 化合物3还具有细胞增殖抑制效果，因此为了正确评价OPN产生量抑制效果，而 在去除培养上清后孔内剩余的细胞中添加在荧光素酶实验中使用的IXCCLR液而配制出 细胞裂解液，并且将其蛋白量使用BCA蛋白定量试剂盒（BCA protein assay kit) (Thermo Scientific)进行测定。对于化合物3的添加对OPN产生量的影响，通过每Img蛋白量的 OPN量进行比较。
[0067] BI)试样配制方法 首先，使A549细胞或H印G2细胞在分别添加了 10% FCSU % P/S的DMEM培养基中悬 浮并达到4X 104cellS/mL，并且向24孔板的各孔内分别注入500 μ L。由于将试验重复实 施三次，因此将对照以及各浓度的被试化合物添加组分别准备三孔。将24孔板在二氧化碳 培养器（37°C，5% CO2条件下）内培养24±4小时。
[0068] 将作为被试化合物的化合物3使用DMSO制成50mmol/L溶液，并且保存在一 80°C。 将该化合物3溶液使用DMSO进行稀释，分别配制成3. 75mmol/L、7. 5mmol/L以及15mmol/L 的浓度。在培养A549细胞的各孔内，将化合物3的7. 5mmol/L溶液或15mmol/L溶液分别 添加2 μ L。在对照孔内仅分别添加2 μ LDMS0。
[0069] 在培养!fepG2细胞的各孔内分别添加化合物3的3. 75mmol/L溶液或7. 5mmol/L 溶液2 μ L。在对照孔内仅分别添加2 μ LDMS0。
[0070] 将24孔板前后左右摇动，将孔内的溶液混合后，在二氧化碳培养器（37°C，5% CO2 条件下）中培养48±4小时。之后，将培养上清全部转移至1.5mL管内，在留下细胞的孔内 添加 500 μ L D-PBS (-)。
[0071 ] 将24孔板轻轻地摇动后，去除D-PBS (_)，并且向各孔内分别注入200 μ L的将在荧 光素酶实验中使用的5 X CCLR用水稀释5倍而配制出的I X CCLR。之后，将24孔板放置于 摇摆式振荡器（rocking shaker)中摇摆15分钟。
[0072] 从摇摆15分钟后的24孔板的各孔中将细胞裂解液转移至I. 5mL管内，并且为了 去除细胞碎片等的夹杂物而通过微量高速冷却离心机在4°C、15000rpm下离心1分钟。将 得到的上清作为蛋白量测定用试样。
[0073] 另一方面，为了去除如细胞碎片等的夹杂物而将转移至I. 5mL管内的培养上清通 过微量高速冷却离心机在4°C、15000rpm下离心1分钟。将得到的上清作为ELISA用试样。
[0074] B2) OPN蛋白量的测定： 将ELISA用试样如下进行稀释； A549细胞（稀释20倍）：试样5 μ L+培养基95 μ L !fepG2细胞（稀释80倍）：试样2 μ L+培养基158 μ L。
[0075] 在包含于ELISA试剂盒中的OPN标准品的小瓶（vial)中加入lmL7K，平稳地混合， 在室温中静置15分钟而配制出200ng/mL的OPN标准品。然后，如表2所示，将OPN标准品 用包含于试剂盒中的稀释液RD5-24进行依序稀释。
[0076] [表 2]
[0077] 准备包含于试剂盒中的所需数量的OPN微孔板（microplate)和RD1-6,向孔中分 别注入100 μ LRD1-6。将稀释的OPN标准品（小瓶A~H)以及试样50 μ L分别进一步添加 于已添加 RD1-6的孔内。之后，将孔上部用密封件覆盖，在室温下静置2小时。在这期间， 用水稀释包含于试剂盒中的浓缩洗涤缓冲液（wash buffer concentrate)，配制出洗涤缓 冲液（wash buffer)。
[0078] 在静置2小时后，去除各孔内的液体。向各孔内分别注入250 μ L洗涤缓冲液后， 去除洗涤缓冲液，将孔进行洗涤。将该洗涤操作进行四次。
[0079] 在各孔中分别注入200 μ L OPN结合物（conjugate)。然后，将孔上部用密封件覆 盖，在室温下静止两个小时。在这期间，将包含于试剂盒中的显色剂A(Color Reagent A)和 显色剂B (Color Reagent B)进行等量混合，从而配制出底物溶液（Substrate Solution)。
[0080] 在静置两个小时后，去除各孔内的液体。向各孔中分别注入250 μ L洗涤缓冲液 后，去除洗涤缓冲液，将孔进行洗涤。将该洗涤操作进行了四次。
[0081] 向各孔内分别注入200 μ L底物溶液，并且在遮光下室温中静置30分钟。之后， 在各孔内分别添加50yL的包含于试剂盒中的终止液（stop solution)，并且通过涡旋混 合器平稳地混合至孔的全部液体从蓝色变成黄色。在混合后，使用酶标仪（microplate Reader)(Bio-Rad !Benchmark 或 Thermo Scientific ；Varioskan Flash)测定吸光值 (450nm以及570nm)。进行从所有的测定数据的OD 450nm减去OD 570nm的值的运算，以后 的计算使用这一值。
[0082] 根据标准曲线样品的吸光值制作标准曲线。使用标准曲线的数学式根据各样品的 吸光值算出OPN蛋白量。
[0083] B3)细胞中的总蛋白量测定： 将蛋白量测定用试样10 μ L和水90 μ L进行混合，稀释10倍。如表3所示用水稀释 BSA溶液而配制出标准曲线样品。
[0084] [表 3]
[0085] 将包含于蛋白测定用试剂盒中的BCA试剂A和BCA试剂B(50:1)进行混合，配制 出工作试剂（Working Reagent)。向96孔板中分别注入标准曲线样品（小瓶A~F)以及 稀释10倍的蛋白测定用试样各25 μ L。由于试验重复实施两次，因此将对照组以及各浓度 的被试化合物添加组分别准备两个孔。
[0086] 向各孔内分别添加200 μ L工作试剂，并且通过涡旋混合器混合30秒钟。以60°C 加热30分钟后，在室温下静置15分钟。