一种决明酮-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，具体涉及一种决明酮-8-0-f-D-吡喃葡萄糖苷对照品的制备方法。
【背景技术】
[0002]决明酮-8-0- β -D-吡喃葡萄糖苷，又名决明酮苷，属于奈苷类化合物，英文名称torachrysone-8-O-β-D-glucopyranoside，具有具有 α -葡萄糖苷酶抑制作用[Babu KS，et al.B10rg Med Chem Lett，2004，14:3841]、神经保护作用[Xiang L，et al.TsinghuaSci Technol，2005，10:426]、促进毛发生长作用[Sun YN，et al.B10rg Med Chem Lett，2013，23:4801]和抗炎作用[Matsuda H，et al.B10rg Med Chem Lett，2000，10:323]。本案发明人发现了决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷具有明显抑制黄嘌呤氧化酶活性，已申请中国发明专利(申请号:201510113689.3)。
[0003]决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷主要存在于虎杖、巴天酸模、尼泊尔酸模、戟叶酸模、何首乌、掌叶大黄、唐古特大黄、喜马拉雅大黄、波叶大黄、长柱琉璃草、刺亦模、毛脉廖等植物中。其中虎杖收载于《中华人民共和国药典》虎杖项下，何首乌收载于《中华人民共和国药典》何首乌项下，掌叶大黄和唐古特大黄收载于《中华人民共和国药典》大黄项下，但是目前无法从国内外市场购得决明酮-8-0- β -D-吡喃葡萄糖苷对照品，未见有关植物中决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量测定的文献报道。
[0004]2000年日本学者Matuda Η从波叶大黄根茎中分离鉴定出决明酮-8-0-β _D_吡喃葡萄糖苷[Matsuda H，et al.B10rg Med Chem Lett，2000，10:323]，米用的方法为甲醇提取物经大孔吸附柱色谱、硅胶柱色谱、0DS柱色谱和高效液相柱色谱；2001年土耳其学者Demirezer G从巴天酸模根中分离鉴定出决明酮-8_0_ β _D_ R比喃葡萄糖苷[Demirezer
0,et al.Phytochemistry，2001，56:399-402]，采用的方法为甲醇提取物经聚酰胺柱色谱、中低压柱色谱和硅胶柱色谱；2001年中国学者原源从巴天酸模根中分离鉴定出决明酮-8-0- β -D-吡喃葡萄糖苷[原源，等.中国中药杂志，2001，26:256]，采用的方法为80%乙醇提取经有机溶剂萃取和硅胶柱色谱；2005年中国学者戚欢阳从毛脉寥根中分离鉴定出决明酮-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷[戚欢阳，等.中国药学杂志，2005，11:819]，采用的方法为80%乙醇提取经有机溶剂萃取、硅胶柱色谱、0DS柱色谱和S印hardex LH-20柱色谱；2006年中国学者张志国从何首乌根中分离鉴定出决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷[张志国，等.中国中药杂志，2006，12: 1027]，采用的方法为90%乙醇提取经有机溶剂萃取、硅胶柱色谱和S印hardex柱色谱；2013年中国学者曾涌从巴天酸模地上部位根中分离鉴定出决明酮-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷[曾涌，等.中药材，2013，36:57]，采用的方法为95%乙醇提取经有机溶剂萃取、硅胶柱色谱和聚酰胺柱色谱。上述分离方法均使用硅胶柱色谱，硅胶柱色谱目标成分分离周期长，重复性差；有机溶剂消耗量大，成本高；死吸附严重，产率低；同时未进行纯度检测。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷对照品的制备方法。
[0006]本案发明人通过对虎杖化学成分进行细致深入的研究，发明了虎杖的根及根茎回流提取，提取物经大孔吸附柱色谱和脱色树脂柱色谱结合制备高效液相色谱制备决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷，经纯度检测大于98 %，符合含量测定用中药化学对照品的要求，因而完成了本发明。
[0007]本发明提供一种决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷对照品的制备方法，该方法包括以下步骤:
a)虎杖的根及根茎粗粉加50~90%乙醇回流提取，滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
b)将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用50%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得决明酮-8-0-f-D-吡喃葡萄糖苷粗提取物；
c)将步骤b)获得的决明酮-8-0-f-D-卩比喃匍萄糖苷粗提取物经制备尚效液相色谱，色谱柱:十八烷基键合硅胶，流动相为48%体积甲醇和52%体积水，同步采用紫外检测器检测波长280nm监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得决明酮_8_0- β-Υ)~吡喃葡萄糖苷。
[0008]所述的虎杖的根及根茎粗粉回流提取溶剂优选的浓度为80 %乙醇。
[0009]所述的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂或弱极性大孔吸附树脂，优选大孔吸附树脂为D101。
本发明制备的决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷经es1-ms/h-nmr^c-nmi^hsqc^hmbc鉴定为决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷；经高效液相色谱纯度检查，不同色谱柱和不同流动相梯度洗脱条件测定结果表明均为一个主色谱峰；以峰面积归一化法和不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数均大于98 %，符合含量测定用中药化学对照品的要求。而且本发明方法分离周期短，具备可重复性，产率高，成本低。
【附图说明】
[0010]
图1为本发明制备的决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷的高效液相色谱条件Α纯度检查图
图2为本发明制备的决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷的高效液相色谱条件Β纯度检查图
图3为本发明制备的决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷的高效液相色谱条件C纯度检查图
图4为本发明制备的决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷的高效液相色谱峰面积归一化法纯度检查图
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。
【具体实施方式】
[0011]
实施例1
(1)虎杖药材提取:取虎杖根及根茎粗粉1000g，加80%乙醇回流提取2次，每次2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
(2)柱色谱分离:提取物加水溶解，经大孔吸附树脂D101柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30 %乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用50 %乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得决明酮-8-0-β -D-啦喃葡萄糖苷粗提取物；
(3)制备高效液相色谱分离:决明酮-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷粗提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45 ^m)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱:十八烷基键合硅胶，流动相为48%体积甲醇和52%体积水，同步采用紫外检测器检测波长280nm监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷对照品0.52go
[0012]化合物结构鉴定数据:
mp 151~153°C。ES1-MS m/z..407 [Μ - Η] , ^-NMR (CD30D，500 MHz) δ 6.98 (2H，s，H-4，5)，6.77 (1H，s，H_2)，5.07 (1H，d，/ = 7.7 Hz, H_l’ ),3.94 (1H，dd，/= 12.1，1.8 Hz，H-6，a)，3.84 (3H，s，3_0CH3)，3.75 (1H, dd, / = 12.1,5.6 Hz，H_6，b)，3.42?3.58(4H，m，H-2’~5’ ),2.58 (3H，s，Η_12)，2.27 (3H，s，H—13) ；13C-NMR (CD30D，125 MHz) δ208.1 (C-ll)，160.4 (C_3)，157.1 (C_l)，153.7 (C_8)，139.1 (C—10)，135.4 (C_6)，123.9(C-7)，120.3 (C-5)，110.3 (C_9)，104.4 (C_2)，104.3 (C_l，)，102.5 (C_4)，78.8 (C_5，)，78.1 (C-3，)，74.9 (C_2，)，71.3 (C_4，)，62.4 (C_6，)，56.0 (3_0CH3)，32.6 (C_12)，20.2(C-13)。
高效液相色谱纯度检测:
溶液的制备
精密称取决明酮-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷适量，加50 %甲醇制成0.3414 mg -mL 1的溶液。
[0013]色谱条件
色谱条件A色谱柱为Zorbax SB_Cls，柱温为25 °C，流动相为乙腈(A) -0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱条件为:0 min (A 15%,Β 85%)—20 min (A 20%,B 80%)—35 min (A 30%，B 70%) — 80 min (A 30%，B 70%)，检测波长为 236 nm，流速为 1.0 mL.min、
[0014]色谱条件B色谱柱为Zorbax SB_Cls，柱温为25 °C，流动相为乙腈(A)_0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱条件为:0 min (A 15%，Β 85%) — 20 min (A 30%，B 70%) — 80 min (A30%，B 70%)，检测波长为 236 nm，流速为 1.0 mL.min、
[0015]色谱条件C色谱柱为Eclipse XDB_C1S，柱温为25 °C，流动相为乙腈(Α)_0.1%甲酸水(Β)，梯度洗脱条件为:0 min (A 15%,Β 85%) — 20 min (A 30%,B 70%) — 80 min (A30%，B 70%)，检测波长为 236 nm，流速为 1.0 mL.min、
[0016]方法与结果精密吸取10 piU注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，决明酮-8-0- β -D-吡喃葡萄糖苷为一个主色谱峰，色谱峰保留时间分别为:38.270 min、25.027min和24.674 min，色谱图见附图1?附图3。
[0017]峰面积归一化法纯度检测:
溶液的制备
精密称取决明酮-8-0- β-V)-吡喃葡萄糖苷对照品适量，加50%甲醇制成3.4140mg.mL 1的溶液。
[0018]色谱条件
色谱柱为Zor