专利名称：一种双荧光质粒、基于其的活细胞内dna错配修复功能活性的分析方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学研究领域，尤其涉及一种双荧光质粒及其应用，以及一种基于 双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法。
背景技术：
目前，分析生物体错配修复(MMR)功能活性的传统方法有三种即以噬菌体 M13mP2及其衍生株为材料的分析方法、以寡聚核苷酸为材料的分析方法以及基于酵母MMR 功能的分析方法。这三种MMR功能分析模型都是以细胞核提取物来进行MMR功能活性的评 价，均属于体外分析法，不能准确反应生物体内的真实状况，且存在分析过程复杂、指示参 数灵敏度和准确度低、不易统计等缺点。因此，这三种方法主要应用于对特定生物体MMR功 能活性的分析，很难在致癌机理与致癌风险评价中获得实际的应用与推广。2004年美国德州大学孙鲁浙(Lu-zhe SUN)教授所领衔的研究团队首次提出利用 增强型绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein, EGFP)作为报告基因直接对 活细胞DNA MMR活性进行定量分析的模型，其成果发表在国际著名学术期刊NucleicAcids Res (2004, 32, (12),el00)上。此后，研究发现，该模型所使用的一对质粒中EGFP突变型质 粒(EGFP基因起始密码ATG —ACG)并没有像预期的那样转染细胞后完全终止EGFP的表达， 那么以其提供的模板链所制备的异源双链核酸分子导入活细胞后错配在未被修复的情况 下也无法完全终止EGFP的表达，这势必会增加EGFP的背景值从而削弱该模型的检测灵敏 度与精度。此外，如何得到大规模高纯度的核酸分子也成了制约该模型得到推广应用的瓶 颈。为了进一步优化上述活细胞DNA MMR功能活性定量分析模型，Anal Biochem(2009, 388, (1)，167-9)上提出了一种方法，通过采取一种无义突变策略(在EGFP 基因合适位置引入终止密码子造成一个T/G错配)，彻底消除了该模型原有的EGFP本底表 达问题；同时，还开发出了一种高效快捷的方法来大规模制备高纯度的核酸分子，该成果发 表在Anal Biochem(2009, 389, (2), 177-9)上。优化后的模型的确提高了原有模型的分析 精度与灵敏度，同时为该模型的推广应用创造了一定的前提。但是此模型在实际操作中，校 正各细胞处理组间EGFP质粒转染效率和EGFP表达强度上的差别是通过平行转染另一种 RFP真核表达质粒来实现的，EGFP基因和RFP基因是位于两种不同质粒和开放阅读框内，因 此以RFP作为参照标准来校正各细胞处理组间参数，是很难实现单细胞水平上校验准确性 的。
发明内容
本发明的目的是构建一对双荧光质粒，解决现有技术中单色荧光质粒共转染所产 生单细胞水平上校验准确性差的问题。本发明的另一个目的是提供一种基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法，方法简单、指示参数灵敏度高和准确度高。为此，本发明是通过以下技术方案实现一种双荧光质粒，携带有EGFP和RFP基 因，其中，EGFP和RFP基因位于同一阅读框。同时，本发明还提供了一种基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活性 的分析方法，包括以下步骤(1)构建两个上述的双荧光质粒Pl和P2，其中质粒Pl中的 EGFP基因为正常表达，质粒P2中的EGFP基因具有无义突变；(2)以质粒Pl为材料制备单 链DNA分子；(3)基于质粒Pl和P2，以及单链DNA分子，制得同源和异源核酸双链分子；(4) 将同源和异源核酸双链分子分别转染至活细胞，进行错配修复功能活性分析。进一步地，步骤(1)中采用双顺反子克隆技术使得EGFP基因和RFP基因位于同一 阅读框中。进一步地，上述双顺反子克隆技术包括以下步骤分别以PGEM-EGFP质粒和 pGEM-(mt)EGFP质粒为模板，以具有SEQ No. 1序列的上游引物和具有SEQ No. 2序列的下 游引物扩增EGFP基因；其中，pGEM-EGFP中的EGFP基因为正常表达，而pGEM-(mt) EGFP中 的EGFP基因存在无义突变；将扩增得到的所述正常表达的EGFP基因酶连入具有RFP基因 的载体P IRES2-DSred2制得所述双荧光质粒P1，将扩增得到的所述存在无义突变的EGFP 基因酶连入具有RFP基因的载体ρ IRES2-Dsred2制得所述双荧光质粒P2。进一步地，上述双顺反子克隆技术包括以下步骤以PIRES2-Dsred2质粒为模板， pIRES2-Dsred2质粒中含有RFP基因，以具有SEQ No. 3序列的上游引物和具有SEQ No. 4 序列的下游引物扩增带有RFP的基因段；将扩增得到的带有RFP的基因片段分别酶连入 pGEM-EGFP载体和pGEM-(mt)EGFP载体，其中，pGEM-EGFP中的EGFP基因为正常表达而 pGEM-(mt)EGFP中的EGFP基因存在无义突变制得所述质粒Pl和质粒P2。进一步地，上述存在无义突变的EGFP基因是由正常表达的EGFP基因经具有SEQ No. 5序列的第一引物和具有SEQ No. 6序列的第二引物诱变PCR扩增制成。进一步地，质 粒P2中EGFP基因的第58三联密码子处带有无义突变。进一步地，上述步骤⑵包括如下步骤以质粒Pl为材料，使用缺刻酶形成带缺刻 的开环质粒，然后使用核酸外切酶进行消化反应获得所述单链DNA分子。进一步地，上述缺刻酶为Nb. BsrdI、Nb. BsmI 或 Nb. BtsI。进一步地，上述核酸外切酶为核酸外切酶III。进一步地，所述步骤(2)包括如下步骤以Pl为材料，使用辅助噬菌体M13ko7，通 过侵染的方法获取高纯单链DNA分子。进一步地，步骤(3)中制得同源和异源核酸分子包括如下步骤将单链DNA分子 与经限制性内切酶线性化的Pl或P2退火制备带缺刻的双荧光蛋白基因同源或异源核酸分 子；用质粒安全性酶PSAD去除残余的单链分子和双链线性分子，纯化回收后得到高纯度的 同源或异源双链核酸分子。进一步地，所述限制性内切酶为AseI或MluI。进一步地，所制备的异源双链核酸分子中EGFP基因的第58三联密码子处带有G/ T错配无义突变。同时，本发明还提供了一种上述荧光质粒在制备用于检测活细胞内DNA错配修复 功能活性试剂中的应用。
本发明产生的有益效果如下本发明所构建的一种双荧光质粒，通过将两种荧光 蛋白基因放置在同一阅读框中，很好的实现了两种荧光蛋白的共表达。同时，将一对上述 双荧光质粒应用于活细胞内DNA错配修复功能活性分析，提高了单细胞水平上校验的准确 性，方法简单，指示参数灵敏度高，准确性高，为活细胞内DNA错配修复功能活性的分析提 供一套行之有效的检测方法。并且，可将本发明提供的双荧光质粒应用到检测活细胞DNA 错配修复功能活性的试剂中，具有产业化的良好前景。
图1示出了根据本发明提供的基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活 性的分析方法中质粒Pl与P2的第一种构建流程示意图；图2示出了根据本发明提供的基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活 性的分析方法中质粒Pl与P2的第二种构建流程示意图；图3示出了本发明提供的单链DNA分子制备流程示意图；图4示出了根据本发明提供的同、异源双链核酸分子制备的流程示意图；图5示出了根据本发明实施例1所制备的同源-异源双链分子转染HTC116细胞 的荧光表达情况；图6为根据本发明实施例1所制备的同源-异源双链分子转染Hela细胞的荧光 表达情况；图7为根据本发明实施例2所制备的同源-异源双链分子转染HTC116细胞的荧 光表达情况；图8为根据本发明实施例2所制备的同源-异源双链分子转染Hela细胞的荧光 表达情况；图9示出了根据本发明具体实施例1中HCT116和Hela两种活细胞内DNA错配修 复功能活性的流式细胞仪分析效果图；以及图10示出了根据本发明具体实施例2中HCT116和Hela两种活细胞内DNA错配 修复功能活性的流式细胞仪分析效果图。
具体实施例方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另 有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常 理解的相同含义。现有技术中活细胞DNA MMR功能活性定量分析模型是采用共转染RFP质粒来指示 EGFP质粒的转染效率，但是目前技术水平并不能保证所有转入RFP质粒的细胞均可同时转 入EGFP质粒，从而必然存在非同步所产生的分析误差。在本发明的一种具体的实施方式中提供了一种双荧光质粒，这种双荧光质粒，同 时携带有EGFP和RFP两种基因，且EGFP和RFP基因位于同一阅读框。本发明所提供的双 荧光质粒将EGFP和RFP基因构建在同一阅读框中，提高了 EGFP和RFP基因共同转染的几 率，减少分析误差，增强单细胞水平上校验的准确性。同时，在本发明的一种具体的实施方式中，提供了一种基于上述双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法。该方法包括如下步骤(1)将EGFP和RFP基 因构建在同一阅读框中制得双荧光质粒Pl和P2，其中质粒Pl中的EGFP基因为正常表达， 质粒P2中的EGFP基因具有无义突变。⑵以质粒Pl为材料制备单链DNA分子；(3)基于 质粒Pl和P2，以及所制备的单链DNA分子，制得同源和异源核酸双链分子；(4)将同源和异 源核酸双链分子分别转染至活细胞，进行错配修复功能活性分析。该方法过程简单，通过使 用在同一阅读框中同时存在EGFP和RFP基因的质粒，增强检测活细胞内DNA错配修复功能 活性的指示参数灵敏度和准确度。针对上述步骤(1)至(4)作以下具体描述步骤(1)中采用双顺反子克隆技术使得EGFP基因和RFP基因位于同一阅读框中。 其中，质粒P2中EGFP基因的第58三联密码子处带有无义突变，这个无意义突变点是通过 PCR诱变技术由TGG变为TAG，形成无意义突变点。将该无意义突变点设置在第58三联密 码子处不仅能提前终止EGFP的表达，而且此处也因为碱基改变引入了一个Bfa I限制性内 切酶位点，可以用于酶切鉴定。图1和图2示出了采用双顺反子克隆技术使得EGFP基因和RFP基因位于同一阅 读框的两种方案。具体步骤如下如图1所示，图1为根据本发明基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能 活性的分析方法中质粒Pl与P2的第一种构建流程图。Pl与P2质粒构建具体步骤采用双顺反子克隆技术分别以pGEM-EGFP质粒和 pGEM- (mt) EGFP质粒为模板，其中pGEM-EGFP中的EGFP基因序列正常，而pGEM- (mt) EGFP 中的EGFP基因是第58三联密码子突变为终止密码子的突变序列，以具有SEQ No. 1序列 的上游引物和具有SEQ No. 2序列的下游引物扩增EGFP基因。其中SEQ No. 1序列为 5，-CCGCTCGAGTCATTTTATGTTTCA GGTTC-3，和 SEQ No. 2 序列为5，-CTAGCTAGCTTCTGCAGT CGACGGTAC-3’(上述引物由大连宝生物公司合成，引物级别PAGE)，将扩增得到的正常表达的EGFP基因连入具有RFP基因的载体pIRES2-Dsred2 (购 自Clontech公司)改造成EGFP和RFP基因双顺反子表达质粒pEGFP-IRES2_DsRed2 (Pl)， 将扩增得到的存在无义突变的EGFP基因酶连入具有RFP基因的载体ρ IRES2-Dsred2制得 pmtEGFP-IRES2-DsRed2 (P2)，使EGFP和RFP处在同一条mRNA，同一阅读框上同步翻译，得到 的质粒Pl可同时表达EGFP和RFP，而质粒P2由于EGFP基因上具有无义突变，只表达RFP。如图2所示，图2为根据本发明基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能 活性的分析方法中质粒Pl与P2的第二种构建流程图。Pl与P2质粒构建具体步骤采用双顺反子克隆技术以含有IRES2-Dsred2基因段 的质粒为模板，IRES2-Dsred2基因段中含有RFP基因，以具有SEQ No. 3序列的上游引物和 具有SEQ No. 4序列的下游引物扩增带有RFP的基因片段；其中，SEQ No.3序列为5_CATGA TATCAGCTTCGAATTCTGCAGTC-3‘。SEQ No. 4序列为5，ACATGCATGCATACATTGATGAGTTTGG_3‘
(上述引物由上海生工公司合成，引物级别PAGE)。将扩增得到的具有RFP的基因片段分别 酶连入pGEM-EGFP载体和pGEM- (mt) EGFP载体，改造成EGFP和RFP基因双顺反子表达质粒 pEGFP-IRES2-DsRed2(Pl)和 pmtEGFP-IRES2_DsRed2(P2)。上述存在无义突变的EGFP基因是由正常表达的EGFP基因经具有SEQ No. 5序 列的第一引物和具有SEQ No.6序列的第二引物诱变PCR扩增制成。SEQ No.5序列为
6TAGGGCACGGGCAGCTTGCC, SEQ No. 6 序列为GCCCACCCTCGTGACCACC。(上述引物由大连宝 生物合成，引物级别HPLC，5，端磷酸化)。具体而言，上述pGEM-EGFP质粒或载体，是通过将CMV-EGFP-Po 1 yA片段从载体 pEGFP-Nl (购自Clontech公司)酶切下来，然后酶连入载体pGEI\KZf(+)(购自Promega公 司)形成的。pGEM- (mt) EGFP是在质粒pGEM_EGFP的基础上通过一对特异弓I物具有SEQ No. 5序 列的第一引物和具有SEQ No. 6序列的第二引物GCCCACCCTCGTGACCACC经诱变PCR扩增获得。如图3所示，本发明提供的分析方法中的步骤O)中以质粒Pl为材料制备单链 DNA分子可以通过多种方式实现。如以上述步骤中制备的Pl为材料，使用缺刻酶制得缺刻 的质粒，然后利用核酸外切酶进行消化，然后利用纯化试剂盒进行纯化而获得高纯的单链 DNA，其中可以使用的缺刻酶包括Nb. Bsrd I>Nb. Bsm I或Nb. Bts I。所使用的核酸外切酶 为宝生物公司生产的核酸外切酶IlKExonucleaselll)。又如以上述步骤中制备的Pl为材 料，使用辅助噬菌体M13ko7，通过侵染的方法获取高纯单链DNA分子。如图4所示了本发明提供的分析方法中的步骤C3)基于质粒Pl和P2，以及所制备 的单链DNA分子，制得同源和异源核酸双链分子的具体步骤，包括将单链DNA分子与经限 制性内切酶线性化的Pl或P2退火，制备带缺刻的双荧光蛋白基因同源或异源核酸分子；用 质粒安全性酶PSAD去除多余的单链分子和双链线性分子，纯化回收后得到高纯度的同源 或异源双链核酸分子(图4中，A为同源双链核酸分子，B为异源双链核酸分子)。优选地， 在本发明中所使用的限制性内切酶为AseI或Mlu I。经过上述步骤所制备的异源核酸双 链分子中，EGFP基因的第58三联密码子处的无义突变点TAG形成了 G/T错配。本发明提供的分析方法中的步骤中将同源和异源核酸双链分子分别转染至 活细胞，进行错配修复功能活性分析的步骤具体地说，是将制备好的同、异源双链核酸分子 转染活细胞，36小时后荧光显微镜下观察并拍照，胰酶消化制成200ul PBS细胞悬液后上 流式细胞仪检测EGFP与RFP表达情况，即可检测活细胞内DNAMMR活性。在上述方法中，所构建的一对EGFP和RFP基因真核同步表达的双链核酸分子，其 中同源双链核酸分子的碱基序列正确，导入活细胞后由于EGFP和RFP基因位于同一开放阅 读框内，可以同步表达，降低了检测误差，从而在荧光显微镜看到绿色荧光和看到的红色荧 光数量相近。异源双链核酸分子为EGFP基因第58三联密码子处带一个G/T错配的异源双 链核酸分子，导入活细胞后，P2上错配未被修复的情况下EGFP无法正常表达，只有RFP的 表达，从而在荧光显微镜只能看到红色荧光。把这对双荧光双链核酸分子平行地导入两组 细胞中，根据两组细胞间各自绿色荧光的相对强弱来评估该细胞株DNA MMR活性的强弱。同时，在本发明中还提供了一种根据本发明所提供的荧光质粒在制备用于检测活 细胞内DNA错配修复功能活性试剂中的应用。如下给出一种用于检测活细胞内DNA错配修复功能活性试剂制备办法。具体步骤 如下1.质粒Pl和P2的构建方法同上。2.质粒Pl和P2的大量制备转化菌株的培养将质粒Pl和P2分别转化感受态细胞DH5 α，制得DH5 α /Pl与DH5 α /Ρ2。DH5 α /Pl与DH5 α /Ρ2分别提前一天在LB/Kana平板上画板，次日挑取新鲜的单 菌落至LB/Kana液体培养基中预培养过夜，次日取菌液至液体培养基中培养。其中DH5 α 感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司，采用常规培养方法。质粒的分别提取，可以通过使用天根无内毒素大提试剂盒(该试剂盒购自“北京 天根生化科技有限公司”)，按照试剂盒的操作方法实现大量提取。3.以质粒Pl为材料制备单链DNA分子，步骤与上述制备单链DNA分子相同。4.基于质粒Pl和Ρ2，以及所制备的单链DNA分子，制得同源和异源核酸双链分 子，步骤与上述步骤相同，制得了大量的同源和异源核酸双链分子。5.将所制备的同源和异源核酸双链分子以ΤΕ(ρΗ8. 0)溶解，分光光度计进行浓度 定量即制得了用于检测活细胞内DNA错配修复功能活性试剂。TE溶液的组成10mmol/L Tris-HCKpH 8. 0) lmmol/L EDTA (pH 8.0)。将制得的试剂加入活性细胞中进行转染，在荧光显微镜下观察并拍照，胰酶消化 制成200 μ L PBS细胞悬液后上流式细胞仪检测EGFP与RFP表达情况，即可检测活细胞内 DNA MMR 活性。具体实施如下实施例1按照本发明所提供的检测活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法进行操作， 具体步骤如下一、Pl质粒的构建(1) PCR扩增获取EGFP片段以本文中提供的制备方法得到的pGEM_EGFP质 粒为模板(约50ng)，加入10 X Thermolpol缓冲液(PlusMg2+) 10 μ L (购自NEB公司， New England Biolabs)， dNTP M 合液 2μ L(10mM/L,购自 NEB 公司)，sense-primer 5’ -CCGCTCGAGTCATTTTATGTTTCAGGTTC 和 anti-sense primer 5' -CTAGCTAGCTTCTGCAGT CGACGGTAC-3’各6 μ L(上述引物由大连宝生物合成，引物级别PAGE，引物工作浓度 5 μ M)，使其在100 μ L的PCR反应体系中的终浓度为0. 3 μ Μ，再加入De印ventDNA聚合酶 1 μ L (2U/ μ L，NEB)，进行PCR反应来获取EGFP片段(以下称为PCR产物)；(2) Dpn I去除模板DNA 将PCR产物中加入20U的Dpn I (NEB)中，混勻后37°C孵 育1小时。进行酚氯仿抽提与酒精沉淀，得到纯化的PCR产物；(3) PCR产物进行Nhe I和Xho I双酶切将纯化的PCR产物用30 μ L TE洗脱，取 30 μ L进行Nhe I和Xho I (NEB)双酶切，37°C孵育过夜，获得带有EGFP基因的目的片段。(4)将带有RFP基因的载体pIRES2-Dsred2 (购自Clontech公司)使用Nhe I和 Xho I双酶切；(5)目地片段与双酶切后的载体pIRES2-Dsred2(购自Clontech公司)片段连接 将双酶切后的目的片段和载体P IRES2-Dsred2 (购自Clontech公司)，用PCR纯化试剂盒 (购自碧云天公司)进行纯化，然后按照目的片段载体彡1 8(质量比)的比例混合， 加入400UT4连接酶连接过夜。(6)将酶连接混合物取IOyL转化感受态细胞DH5 α。(7)重组质粒的筛选与鉴定重组质粒经菌落PCR进行筛选，再用Nhe I和Bio I 双酶切、测序以及细胞转染等方法进一步鉴定得到阳性菌落。
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P2质粒构建的具体步骤与Pl质粒的构建步骤相同，其中P2质粒进行PCR扩增获 取EGFR片段过程中以pGEM- (mt) EGFP质粒为模板制备。P1/P2质粒大量制备的具体方法如下菌株液体培养将Pl质粒构建过程中步骤(7)中得到的阳性菌落及P2质粒构 建过程中产生的阳性菌落分别提前一天在LB/Kana平板上画板，次日挑取新鲜的单菌落至 5mL的LB/Kana液体培养基中预培养过夜，次日取500 μ L菌液至IOOmL的液体培养基中 37°C、250rpm 培养 16 小时。质粒提取质粒提取使用天根无内毒素大提试剂盒进行；如此便能够实现P1/P2 质粒的大量制备。以双荧光质粒Pl为材料制备单链DNA分子取50 μ g质粒Pl，加入缺刻酶Nb. Bsrd I (购自New England Biolabs) 50U，金属浴中65°C作用3小时。进行酚氯仿抽提后酒精沉 淀，其产物用核酸外切酶ΠΙ(购自大连宝生物公司，Exonucleaselll)消化，37°C孵育10分 钟，PCR纯化试剂盒纯化(购自江苏碧云天公司)，可以获得大约20-25 μ g的单链DNA分子 ssPl。(此处缺刻酶还可以用Nb. BsmI或Nb. Bts I代替，其它操作相同)二、基于质粒Pl的同源双链分子的制备(1)质粒的线性化及纯化取质粒Pl 60yg用限制性内切酶Ase I 37°C酶切过 夜，65°C孵育10分钟终止反应，酚氯仿抽提、酒精沉淀，最后用60 μ L TE洗脱。纯化后产物 取0. 5 μ L以1. 0%的琼脂糖(Agarose)凝胶进行电泳鉴定。(2)同源核酸双链分子的退火杂交取线性化质粒Pl 6 μ g于200 μ L的PCR管 中，在水浴锅中90°C加热4分钟；取出向其中加入40 μ L的ssPl (9 μ g)混勻，在水浴锅 中继续作用2分钟；取出立即置于冰上，向其中加入20XSSC(含盐的柠檬酸钠，saline sodiumcitrate，)，所述20 X SSC的组分17. 52g氯化钠，8. 82g柠檬酸钠·2水，溶于80ml去 离子水中，用氢氧化钠调节PH，使其PH = 7. 0，定容至100ml，高压灭菌备用溶液2. 5 μ L混 勻；置于60°C温育10分钟，立即取出置于冰中待其冷却；退火杂交完毕后，取3yL以1.0% 的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。(3)PSAD(Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase)消化将上述退火杂交得到的产 物转移到一个无菌的1.5mL离心管中，用PSAD消化以去除残留的单链分子和线性化质粒。 离心混勻，置金属浴中37°C过夜。65°C孵育10分钟终止反应，取3μ L以1. 0%的琼脂糖凝 胶进行电泳鉴定。(4)同双链核酸分子的定量取2μ L原液稀释100倍，用紫外分光光度计测定其 OD26tl,然后用公式DNA浓度(yg/mL) = OD260 X 50 X稀释倍数来计算其浓度。异源双链分子的制备与同源双链分子的制备方法相同，其中，异源双链分子的制 备是基于质粒P2完成的，此时，P2上带有的无意义突变点处形成一个G/T错配。实施例2按照本发明所提供的检测活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法进行操作， 具体步骤如下一、Pl 质粒的构建PCR 扩增获取 IRES2_Dsred2 片段(1)以 pIRES2_Dsred2 质粒 (购自Clontech公司)为模板(约50纳克)，加入IOXPfu缓冲液10 μ L(购自碧云天公 司)，dNTP 混合液 2 μ L(10mM/L,购自 NEB 公司)，sense-primer 5-CATGATATCAGCTTCGAATTCTGCAGTC-3‘ anti-sense primer 5，ACATGCATGCATACATTGATGAGTTTGG-3‘各 6yL(上述 引物由上海生工公司合成，引物级别PAGE，浓度为5 μ M)，使其在100 μ L的PCR反应体系 中的终浓度为0. 3 μ Μ，再加入Pfu DNA聚合酶0. 5 μ L (购自碧云天公司，5U/ μ L)，进行PCR 反应来获取IRES2-Dsred2片段，该IRES2_Dsred2片段中含有RFP基因；(2) Dpn I去除模板DNA 将PCR产物中加入20U的Dpn I (NEB)，混勻后37°C孵育 1小时。进行酚氯仿抽提与酒精沉淀，得到纯化的PCR产物；(3) PCR产物Sph I和Hpa I双酶切将纯化的PCR产物用30ulTE洗脱，取30 μ L 进行Sph I和Hpa I(NEB)双酶切，37°C孵育过夜，获得带有IRES2-Dsred2基因的目的片 段；(4)取10 μ g载体pGEM-EGFP进行Sph I和Hpa I酶切，37°C孵育过夜。凝胶回收 试剂盒(购自碧云天公司)回收。(5)目的片段与载体pGEM-EGFP连接将目的基因片段IRES2-Dsred2和载体 pGEM-EGFP按照目的基因载体彡1 8(质量比)的比例进行酶连接，加入400U T4连接 酶16 °C连接过夜；(6)将酶连接混合物取IOul转化感受态细胞ultramaxDH5a (invtrogen)；(7)重组质粒的筛选与鉴定重组质粒经菌落PCR进行筛选，阳性菌落用Sph I和 Hpa I双酶切、测序以及细胞转染等鉴定。P2质粒构建的具体步骤与Pl质粒的构建步骤相同，其中P2质粒进行酶连接所用 的载体是 pGEM- (mt) EGFP。Pl和P2质粒大量制备的具体方法与实施例1相同。二、以双荧光质粒Pl为材料，使用辅助噬菌体M13ko7 (NEB公司)侵染的方法来制 备单链DNA分子的具体操作步骤如下提前一天用保存的ultraDH5 α /Pl菌液在AMP板上 画板，在细菌培养箱中37°C过夜培养。挑取几个长出单菌落的平板单菌落(菌落大时可接 5-6个，菌落小的时候接10-20个)接种于IOOmL的LB培养基(使AMP终浓度为100 μ g/ mL)，置于恒温振荡培养箱中37°C，250rpm/min培养。2_4小时后(随时注意观察)用分光 光度计测定其OD6tltl值(使0D_<0.05)，然后加入辅助噬菌体M13ko7 100 μ L振荡培养 1-1. 5小时候后加入卡纳霉素(购自上海生工公司)，使其终浓度为70ug/ml。过夜培养 14-18小时，4°C 8000rpm离心lOMin，将上清液转入另一个新的50ml离心管中，继续离心 lOmin，离心完毕后，将上清液转移到一干净的250mL尖头瓶中。向上清中加入0. 2倍体积 的(即 20ml)的噬菌体析出液(phage precipitation)，所述 Phage precipitation 组分 PEG8000(聚乙二醇8000)30% (V/V)(购自碧云天公司)以及2. 5M的NaCl (氯化钠)(国产 分析纯)，在4°C下储存。颠倒混勻，4°C放置Ih或_20°C放置15-30min，期间混勻几次。于 4°C，IOOOOrpm离心15min，倒掉90%的上清液，用剩余菌液吹打瓶壁，使沉淀充分悬浮，转 移至一 50mL的离心管中lOOOOrpm、IOmin收集沉淀，倒置离心管2_;3min，使上清流尽，吸出 瓶壁和颈上残留的上清液，用吹风机吹干(不要碰到瓶底和瓶壁上的薄层白色的噬菌体颗 粒沉淀)。向50mL的离心管中加入1. 6mL的TE溶解沉淀(用Vortex涡旋30s)，等体积分 装到2个1.5mL的EP管中。离心lmin，将上清转移到两个新的离心管中。每管加入200 μ L phage precipitation缓冲液置于室温5min后，13000rpm离心lOmin。弃上清，用吹风机吹 干沉淀，加入400ul TE重悬沉淀。加入等体积的饱和酚，混勻后静置5min，12000rpm离心5min。取上清到另一新的离心管中，然后再加入200 μ L的苯酚，200 μ L的氯仿或异戊醇抽 提两次，振荡20-30sec，静置5min，离心12000rpm5min。向离心管中加入氯仿400 μ L抽提 一次，吸取上清至一新的EP管中。加入1/10体积的3Μ醋酸钠，2. 5倍体积的预冷的无水乙 醇(放置_20°C中冷却30min效果更好)。13000rpm离心15min。加入ImL 70%的乙醇洗 涤，13000rpm离心15min，吹风机吹干后加入200 μ L TE溶解沉淀，得到ssPl。三、基于Pl质粒制备同源双链分子的制备和基于P2质粒制备异源双链分子的制 备方法与实施例1中相同，其中所使用的限制性内切酶为限制性内切酶MluI(购自碧云天 公司)测试使用根据本发明实施例1与2所制备的同源双链分子与异源双链分子进行活细胞 内错配修复功能活性分析。活细胞选用美国德州大学孙鲁浙教授赠送的Hela细胞以及HCT116细胞。活细胞的培养使用DMEM培养基加上10%的胎牛血清，在细胞培养箱中以10%的 CO2 37°C条件下培养Hela细胞以及HCT116细胞。其中，DMEM培养基与胎牛血清是由美国 Invitrogen 公司 Gibco 生产。同源和异源双链核酸分子转染细胞的操作方式转染前一天，将活细胞接种 于6孔板中，每孔2ml培养基不含抗生素；待活细胞长至80 %汇合后(约接种于六孔 板M小时后)，准备转染复合体溶液，将1. 2 μ g的同源或异源双链核酸分子及6 μ L转 染试剂lipofectamine2000 (美国hvitrogen公司)；混勻，室温放置20分钟，形成 DNA-Iipofectamine2000复合物。将DNA-lipofectamine2000复合物逐滴加到六孔板中含 细胞和培养基的孔中，前后轻轻摇动培养板混勻；4 6小时后更换为正常的细胞培养基； 继续培养30小时左右后观察分析。(1)荧光显微镜观察将转染后的活细胞放置在荧光显微镜下(日本Nikon公司，ECLIPSETE2000U)观 察细胞荧光表达情况。结果参见图5-图8。图5示出了实施例1所制备的同源-异源核酸双链分子转染HTCl 16细胞的荧光表 达情况。图6为实施例1所制备的同源-异源核酸双链分子转染Hela细胞的荧光表达情 况。图7为实施例2所制备的同源-异源核酸双链分子转染HTC116细胞的荧光表达情况。 图8为实施例2所制备的同源-异源核酸双链分子转染Hela细胞的荧光表达情况。其中 图5-1，6-1，7-1，8-1为同源双链分子转染活细胞的荧光表达情况，5-2，6-2，7-2，8-2为异 源双链分子转染活细胞的荧光表达情况。其中A为EGFP蛋白基因的荧光表达，B为RFP蛋 白基因的荧光表达。由图5-图8所示，以RFP蛋白基因的荧光表达为对比，由EGFP蛋白基因的荧光表 达做参照，分别观察由实施例1所制备的同源-异源核酸分子的荧光表达图5和图6，以及 由实施例2所制备的同源-异源核酸分子的荧光表达图7和图8可明显发现，错配修复阳 性Hela和错配修复阴性HCT116之间的相对绿色荧光表达率存在显著性差异，即错配修复 活性存在差别，错配修复阴性HCT116的错配修复活性明显差于错配修复阳性Hela的错配 修复活性。由此可知，本发明所提供的基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活 性的分析方法能够有效地检测出待测活细胞的DNA错配修复功能活性。0.6628.701.0532.101.629.150.0252.466.544522.306.51937.5 199.3113.3178.3618.2183.2116.530.0147.8314.06901.308.22437.810.6730.761.2731.651.4527.850.0365.497.124332.127.51675.499.2824.3176.8718.2982.5516.530.0248.8314.73925.588.5422.50.6925.401.6925.401.5930.450.0550.468.543579.67.01837.699.213.3175.4622.3585.2114.600.0645.4414.31850.326.2695.45
0.383
0.364
0.398
#相对绿色
平均荧共止疋
并宓；t焚光蛋白
^ ^^ 表达率
平均荧光
密度(2)流式细胞仪分析用胰酶(购自杭州四季青公司)处理活细胞1-2分钟后，加入等体积DMEM培养基 即可终止反应，在离心率IOOOrpm条件下，离心4分钟，弃除上清液，加入磷酸盐缓冲溶液 (PBS)清洗一遍，最后用PBS定容至200 μ L，将由PBS定容的液体放入流式细胞仪(美国BD 公司，BD FACSArial)进行检测。流式细胞仪散点图结构参见图9-图10，相应数据列入到 表1、表2、表3、表4中。图9示出了根据本发明具体实施例1的HCT116和Hela两种活细胞内DNA错配修 复功能活性的流式细胞仪分析效果图。图9-1为HCT116细胞的分析效果，图9-2为Hela 细胞的分析效果。图10示出了根据本发明具体实施例2的HCT116和Hela两种活细胞内 DNA错配修复功能活性的流式细胞仪分析效果图。图10-1为HCT116细胞的分析效果，图 10-2为Hela细胞的分析效果。其中，A为对比例的分析效果，B为同源核酸分子的分析效 果，C为异源核酸分子的分析效果。其中对比例为空白对照例。由图9-10所示，分别对照9-1、9-2、9_3以及9_4中各图，可以看出流式细胞仪检 测同种细胞各孔中红色荧光蛋白(RFP)的表达强度相当，说明同、异源分子在量和转染效 率上无差别。针对实施例1与实施例2所制备的同源-异源核酸分子转染HCTl 16或Hela 细胞中EGFP蛋白基因经流式细胞仪分析的数据列表如下表1中为实施例1所制备的同 源-异源核酸分子转染HCT116细胞中EGFP蛋白基因经流式细胞仪分析的数据。表2为实 施例1所制备的同源-异源核酸分子转染Hela细胞中EGFP蛋白基因经流式细胞仪分析的 数据。表3为实施例2所制备的同源-异源核酸分子转染HCT116细胞中EGFP蛋白基因经 流式细胞仪分析的数据。表4为实施例1所制备的同源-异源核酸分子转染Hela细胞中 EGFP蛋白基因经流式细胞仪分析的数据。各表中均包括针对相应细胞所测的三组数据。表1中为实施例1所制备的同源-异源核酸分子转染HCT116细胞中EGFP蛋白基 因经流式细胞仪分析的数据。表1
象 限
l r lrirlr 乩ir丄 r
U U Lluulluull
-组
数据
第
第二组
数据
第三组
数椐
组细百量 源色数含 异绿胞分
组细百量 源色数含 同绿胞分
均光度 平荧密
组细百量 照色数含 对绿胞分
表2为实施例1所制备的同源-异源核酸分子转染Hela细胞中EGFP蛋白基因经 流式细胞仪分析的数据。表权利要求
1.一种双荧光质粒，携带有EGFP和RFP基因，其特征在于， 所述EGFP和RFP基因位于同一开放阅读框。
2.一种基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法，包括以下步骤(1)分别构建两个权利要求1所述的双荧光质粒Pl和P2，其中所述质粒Pl中的EGFP 基因为正常表达，所述质粒P2中的EGFP基因具有无义突变；(2)以所述质粒Pl为材料制备单链DNA分子；(3)基于所述质粒Pl和P2，以及所述单链DNA分子，制得同源和异源核酸双链分子；(4)将所述同源和异源核酸双链分子分别转染至所述活细胞，进行DNA错配修复功能 活性分析。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用双顺反子克隆技 术使得所述EGFP基因和RFP基因位于同一阅读框中。
4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述双顺反子克隆技术包括以下步骤分别以pGEM-EGFP质粒和pGEM- (mt) EGFP质粒为模板，以具有SEQ No. 1序列的上游引 物和具有SEQ No. 2序列的下游引物扩增EGFP基因；其中，所述pGEM-EGFP中的EGFP基因 为正常表达，而pGEM- (mt) EGFP中的EGFP基因存在无义突变；将扩增得到的所述正常表达的EGFP基因酶连入具有RFP基因的载体ρ IRES2-Dsred2 制得所述双荧光质粒P1，将扩增得到的所述存在无义突变的EGFP基因酶连入具有RFP基因 的载体P IRES2-Dsred2制得所述双荧光质粒P2。
5.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述双顺反子克隆技术包括以下步骤以pIRES2-Dsred2质粒为模板，所述pIRES2_Dsred2质粒中含有RFP基因，以具有SEQ No. 3序列的上游引物和具有SEQNo. 4序列的下游引物扩增带有RFP的基因片段；将扩增得到的所述带有RFP的基因片段分别酶连入pGEM-EGFP载体和pGEM-(mt)EGFP 载体，其中，所述pGEM-EGFP中的EGFP基因为正常表达，而pGEM- (mt) EGFP中的EGFP基因 存在无义突变，制得所述质粒Pl和质粒P2。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述存在无义突变的 EGFP基因是由正常表达的EGFP基因经具有SEQ No. 5序列的第一引物和具有SEQ No. 6序 列的第二引物诱变PCR扩增制成。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述质粒P2中EGFP基因的第58三 联密码子处具有无义突变。
8.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(2)包括如下步骤 以质粒Pl为材料，使用缺刻酶形成带缺刻的开环质粒，然后使用核酸外切酶进行消化反应获得所述单链DNA分子。
9.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(2)包括如下步骤 以质粒Pl为材料，使用辅助噬菌体M13ko7，通过侵染的方法获得高纯单链DNA分子。
10.权利要求1所述的双荧光质粒在制备用于检测活细胞内DNA错配修复功能活性试 剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种双荧光质粒，携带有EGFP和RFP基因，其中，EGFP和RFP基因位于同一阅读框。本发明所构建的双荧光质粒，通过将两种荧光蛋白基因放置在同一阅读框中，很好的实现了两种荧光蛋白的共表达。同时，将上述双荧光质粒应用于活细胞内DNA错配修复功能活性分析，提高了单细胞水平上校验的准确性，方法简单，指示参数灵敏度高，准确性高，为活细胞内DNA错配修复功能活性检测提供一套新的有效的检测方法。同时，本发明中还提供了该双荧光质粒在制备用于检测活细胞内DNA错配修复功能活性试剂中的应用。
文档编号C12N15/65GK102121027SQ20101058630
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年9月30日
发明者任湘鹏, 白承连, 葛红山, 董巧香, 陈元红, 黄长江 申请人:温州医学院