一种纳米磺化石墨烯的制备方法及纳米磺化石墨烯用作基因导入材料的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因导入材料【技术领域】，具体涉及一种纳米磺化石墨烯的制备方法及纳米磺化石墨烯用作基因导入材料的应用。一种纳米磺化石墨烯的制备方法，包括以下步骤：步骤一、制备氧化石墨烯；步骤二、还原氧化石墨烯的制备；步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备；步骤四、纳米磺化石墨烯的制备。本发明制备的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，该纳米磺化石墨烯依赖其颗粒表面离子的正电荷与绿色荧光蛋白质粒以非共价的方式结合，进行转染，用作基因导入材料的应用，该纳米磺化石墨烯应用于基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该纳米磺化石墨烯的转染效率达到40%左右。
【专利说明】一种纳米磺化石墨烯的制备方法及纳米磺化石墨烯用作基因导入材料的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因导入材料【技术领域】，具体涉及一种纳米磺化石墨烯的制备方法及纳米磺化石墨烯用作基因导入材料的应用。
【背景技术】
[0002]基因导入方法可以分为两类:第一类是病毒型基因导入方法，是以逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒为载体；第二类是非病毒型基因导入方法，如显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀、阳离子脂质体法、以及利用新兴的纳米基因导入材料进行基因转染。
[0003]病毒型基因导入方法存在许多严重的不足，例如病毒转染时有可能激活原癌基因。因此，非病毒型基因导入方法是目前的研究热点，但是，上述所述的非病毒型基因导入方法均存在不足:显微注射一次只能处理一个细胞，其转染效率非常低；基因枪的穿透力十分有限；磷酸钙共沉淀法的转染效率受温度、浓度、操作环境等众多因素影响，转染结果很不稳定；阳离子脂质体法虽然表现出良好的转染效率，但是阳离子脂质体因毒性高，使得阳离子脂质体法的应用受到了限制；现有技术中的纳米基因导入材料存在生产成本高、制备用原料不易得、难以普及推广应用的缺点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种纳米磺化石墨烯的制备方法，该纳米磺化石墨烯的制备方法所制得的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，且该制备方法具有生产成本低、制备用原料易得的特点。
[0005]本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供纳米磺化石墨烯用作基因导入材料的应用，该纳米磺化石墨烯应用于基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好的特点。
[0006]为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案:
一种纳米磺化石墨烯的制备方法，它包括以下步骤:
步骤一、Hmnmers法制备氧化石墨烯:用石墨粉末、高猛酸钾、硝酸钠和浓硫酸通过Hummers法制备氧化石墨烯；
步骤二、还原氧化石墨烯的制备:
(1)将氧化石墨烯分散于去离子水中，然后进行超声处理一定时间后，得到氧化石墨烯的分散体系；
(2)往氧化石墨烯的分散体系加入碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为9~10 ； (3)往上述pH值为扩10的氧化石墨烯的分散体系加入硼氢化钠溶液，然后在一定温度下搅拌一定时间，得到还原氧化石墨烯，然后将还原氧化石墨烯用双蒸水洗涤至PH值为7，得到中性的还原氧化石墨烯；步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备:将对氨基苯磺酸和硝酸钠溶解于盐酸溶液中，在冰浴冷却的条件下，制得对氨基苯磺酸重氮盐；
步骤四、纳米磺化石墨烯的制备:
(1)将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液；
(2)将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液，并在冰浴条件下搅拌一定时间，使还原氧化石墨烯与对氨基苯磺酸重氮盐发生耦合反应生成耦合物，然后进行离心处理，再用双蒸水将反应生成的耦合物洗涤至PH值为7，得到呈中性的耦合物；
(3)将上述所得的耦合物分散于水合肼和去离子水的混合溶液中进行还原反应，得到反应混合物，然后在一定温度下回流一定时间，得到磺化石墨烯； (4)将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在一定温度下进行真空干燥，得到纳米磺化石墨烯。
上述技术方案中，所述步骤二的第(I)步，所述氧化石墨烯的分散体系中，所述去离子水与所述氧化石墨烯的质量比为98(Tl020:1。
[0007]上述技术方案中，所述步骤二的第(3)步，所述氧化石墨烯的分散体系与所述硼氢化钠溶液的体积比为70-80:10-20 ;所述硼氢化钠溶液的质量体积百分比浓度(W/V)为3%~5%。
[0008]上述技术方案中，所述步骤二的第(3)步，搅拌温度设置为75°C~85°C，搅拌时间设置为0.8小时~1.2小时。
[0009]上述技术方案中，所述步骤三中，对氨基苯磺酸、硝酸钠和盐酸溶液的质量比为40~50:8~12:10~15 ;所述盐酸溶液的摩尔浓度为lmol/L~2mol/L。
[0010]上述技术方案中，所述步骤四的第(2)步，在冰浴条件下搅拌1.5小时~2.5小时。
[0011]上述技术方案中，所述步骤四的第(3)步，水合肼和去离子水的体积比为1.5~3:95~110 ;回流温度为950C~105°C，回流时间为23小时~25小时。
[0012]上述技术方案中，所述步骤四的第(4)步，真空干燥的温度设置为55°C~65°C。
[0013]为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案:
上述所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法所制得的纳米磺化石墨烯用作基因导入材料的应用。
[0014]上述所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法所制得的纳米磺化石墨烯用于制作抗肿瘤药物的应用。
[0015]本发明与现有技术相比较，有益效果在于:
I)本发明提供的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，所制得的纳米磺化石墨烯为球形颗粒，该纳米磺化石墨烯颗粒的表面离子带正电，且纳米磺化石墨烯的平均粒径为95nnTl05nm,而现有技术中的磺化石墨烯一般只能达到微米级别。
[0016]2)本发明提供的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，由于使用对氨基苯磺酸制备对氨基苯磺酸重氮盐，再利用对氨基苯磺酸重氮盐与还原氧化石墨烯发生耦合反应，生成的耦合物最终被还原为磺化石墨烯，制备过程中的对氨基苯磺酸、对氨基苯磺酸重氮盐和耦合物所含有的磺酸基团能够控制最终生成的纳米磺化石墨烯颗粒为球形。
[0017]3)本发明提供的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，制备纳米磺化石墨烯所用的原料的成本较低，且制备用原料易得，因此，该制备方法具有生产成本低的优点。[0018]4)本发明提供的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，所制得的纳米磺化石墨烯为低毒性，且纳米磺化石墨烯颗粒表面的离子带正电，从而使得所制得的纳米磺化石墨烯具备成为基因导入材料的潜力。
[0019]5)本发明提供的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，该制备方法简单、容易操作，可重复性好。
[0020]6)本发明提供的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，所制得的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料。
[0021]7)本发明提供的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，该纳米磺化石墨烯依赖其颗粒表面离子的正电荷与绿色荧光蛋白质粒以非共价的方式结合，进行转染，用作基因导入材料的应用，该纳米磺化石墨烯应用于基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该纳米磺化石墨烯的转染效率达到40%左右。 【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是本发明的一种纳米磺化石墨烯的制备方法的实施例1所制得的纳米磺化石墨烯的扫描电镜图。
[0023]图2是本发明的纳米磺化石墨烯用作基因导入材料的应用的转染实验中纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的联合体在转染后的倒置荧光显微镜下的荧光图片。
[0024]图3是本发明的纳米磺化石墨烯用作基因导入材料的应用的转染实验中纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的联合体在转染后的细胞存活率图片。
[0025]图4是本发明的纳米磺化石墨烯用作基因导入材料的应用的转染实验中纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的联合体的转染效率图。
[0026]其中，在图3至图4中，cell viability (%)代表细胞存活率，transfectionefficiency (%)代表转染效率。
[0027]最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0029]实施例1。
[0030]一种纳米磺化石墨烯的制备方法，它包括以下步骤:
步骤一、Hmnmers法制备氧化石墨烯:用石墨粉末、高猛酸钾、硝酸钠和浓硫酸通过Hummers法制备氧化石墨烯；
步骤二、还原氧化石墨烯的制备:
(1)将氧化石墨烯分散于去离子水中，然后进行超声处理一定时间后，得到氧化石墨烯的分散体系；其中，去尚子水与氧化石墨烯的质量比为1000:1 ；
(2)往氧化石墨烯的分散体系加入碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为9 ；
(3)往上述pH值为9的氧化石墨烯的分散体系加入硼氢化钠溶液，然后在80°C下搅拌I小时，得到还原氧化石墨烯，然后将还原氧化石墨烯用双蒸水洗涤至pH值为7，得到中性的还原氧化石墨烯；其中，氧化石墨烯的分散体系与硼氢化钠溶液的体积比为75:15 ;硼氢化钠溶液的质量体积百分比浓度(W/V)为4% ；
步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备:将对氨基苯磺酸和硝酸钠溶解于盐酸溶液中，在冰浴冷却的条件下，制得对氨基苯磺酸重氮盐；其中，对氨基苯磺酸、硝酸钠和盐酸溶液的质量比为46:10:11 ;盐酸溶液的摩尔浓度为1.5mol/L ；
步骤四、纳米磺化石墨烯的制备:
(1)将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液；
(2)将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液，并在冰浴条件下搅拌2小时，使还原氧化石墨烯与对氨基苯磺酸重氮盐发生耦合反应生成耦合物，然后进行离心处理，再用双蒸水将反应生成的耦合物洗涤至PH值为7，得到呈中性的耦合物；
(3)将上述所得的耦合物分散于水合肼和去离子水的混合溶液中进行还原反应，得到反应混合物，然后在100°C下回流24小时，得到磺化石墨烯；其中，水合肼和去离子水的体积比为2:100 ;
(4)将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在60°C下进行真空干燥，得到纳米磺化石墨烯。
[0031]本实施例1制得的纳米磺化石墨烯为球形颗粒，且纳米磺化石墨烯的平均粒径为IOOnm,而且,纳米磺化石墨烯颗粒的表面离子带正电。
[0032]本实施例1制得的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，该纳米磺化石墨烯依赖其颗粒表面离子的正电荷与绿色荧光蛋白质粒发生作用，进行转染，纳米磺化石墨烯用作基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该纳米磺化石墨烯的转染效率达到40%左右。而且,所制得的纳米磺化石墨烯能够应用于制作抗肿瘤药物。
实施例2。
[0033]一种纳米磺化石墨烯的制备方法，它包括以下步骤:
步骤一、Hmnmers法制备氧化石墨烯:用石墨粉末、高猛酸钾、硝酸钠和浓硫酸通过Hummers法制备氧化石墨烯；
步骤二、还原氧化石墨烯的制备:
(1)将氧化石墨烯分散于去离子水中，然后进行超声处理一定时间后，得到氧化石墨烯的分散体系；其中，去尚子水与氧化石墨烯的质量比为980:1 ；
(2)往氧化石墨烯的分散体系加入碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为10 ；
(3)往上述pH值为10的氧化石墨烯的分散体系加入硼氢化钠溶液，然后在75°C下搅拌1.2小时，得到还原氧化石墨烯，然后将还原氧化石墨烯用双蒸水洗涤至pH值为7，得到中性的还原氧化石墨烯；其中，氧化石墨烯的分散体系与硼氢化钠溶液的体积比为70:10 ；硼氢化钠溶液的质量体积百分比浓度(W/V)为3% ；
步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备:将对氨基苯磺酸和硝酸钠溶解于盐酸溶液中，在冰浴冷却的条件下，制得对氨基苯磺酸重氮盐；其中，对氨基苯磺酸、硝酸钠和盐酸溶液的质量比为40:8:10 ;盐酸溶液的摩尔浓度为lmol/L ；
步骤四、纳米磺化石墨烯的制备:
(1)将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液；
(2)将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液，并在冰浴条件下搅拌1.5小时，使还原氧化石墨烯与对氨基苯磺酸重氮盐发生耦合反应生成耦合物，然后进行离心处理，再用双蒸水将反应生成的耦合物洗涤至PH值为7，得到呈中性的耦合物；
(3)将上述所得的耦合物分散于水合肼和去离子水的混合溶液中进行还原反应，得到反应混合物，然后在95°C下回流25小时，得到磺化石墨烯；其中，水合肼和去离子水的体积比为L 5:95 ；
(4)将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在58°C下进行真空干燥，得到纳米磺化石墨烯。
[0034]本实施例2制得的纳米磺化石墨烯为球形颗粒，且纳米磺化石墨烯的平均粒径为95nm,而且,纳米磺化石墨烯颗粒的表面离子带正电。
[0035]本实施例2制得的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，该纳米磺化石墨烯依赖其颗粒表面离子的正电 荷与绿色荧光蛋白质粒发生作用，进行转染，纳米磺化石墨烯用作基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该纳米磺化石墨烯的转染效率达到40%左右。而且,所制得的纳米磺化石墨烯能够应用于制作抗肿瘤药物。
[0036]实施例3。
[0037]一种纳米磺化石墨烯的制备方法，它包括以下步骤:
步骤一、Hmnmers法制备氧化石墨烯:用石墨粉末、高猛酸钾、硝酸钠和浓硫酸通过Hummers法制备氧化石墨烯；
步骤二、还原氧化石墨烯的制备:
(1)将氧化石墨烯分散于去离子水中，然后进行超声处理一定时间后，得到氧化石墨烯的分散体系；其中，去尚子水与氧化石墨烯的质量比为1020:1 ；
(2)往氧化石墨烯的分散体系加入碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为 9.5 ;
(3)往上述pH值为9.5的氧化石墨烯的分散体系加入硼氢化钠溶液，然后在85°C下搅拌0.8小时，得到还原氧化石墨烯，然后将还原氧化石墨烯用双蒸水洗涤至pH值为7，得到中性的还原氧化石墨烯；其中，氧化石墨烯的分散体系与硼氢化钠溶液的体积比为80:20 ；硼氢化钠溶液的质量体积百分比浓度(W/V)为5% ；
步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备:将对氨基苯磺酸和硝酸钠溶解于盐酸溶液中，在冰浴冷却的条件下，制得对氨基苯磺酸重氮盐；其中，对氨基苯磺酸、硝酸钠和盐酸溶液的质量比为50:12:15 ;盐酸溶液的摩尔浓度为2mol/L ；
步骤四、纳米磺化石墨烯的制备:
(1)将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液；
(2)将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液，并在冰浴条件下搅拌2.5小时，使还原氧化石墨烯与对氨基苯磺酸重氮盐发生耦合反应生成耦合物，然后进行离心处理，再用双蒸水将反应生成的耦合物洗涤至pH值为7，得到呈中性的耦合物；
(3)将上述所得的耦合物分散于水合肼和去离子水的混合溶液中进行还原反应，得到反应混合物，然后在105°C下回流23小时，得到磺化石墨烯；其中，水合肼和去离子水的体积比为3:110 ；
(4)将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在55°C下进行真空干燥，得到纳米磺化石墨烯。
[0038]本实施例3制得的纳米磺化石墨烯为球形颗粒，且纳米磺化石墨烯的平均粒径为105nm,而且,纳米磺化石墨烯颗粒的表面离子带正电。
[0039]本实施例3制得的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，该纳米磺化石墨烯依赖其颗粒表面离子的正电荷与绿色荧光蛋白质粒发生作用，进行转染，纳米磺化石墨烯用作基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该纳米磺化石墨烯的转染效率达到40%左右。而且,所制得的纳米磺化石墨烯能够应用于制作抗肿瘤药物。
[0040]实施例4。
[0041]一种纳米磺化石墨烯的制备方法，它包括以下步骤:
步骤一、Hmnmers法制备氧化石墨烯:用石墨粉末、高猛酸钾、硝酸钠和浓硫酸通过Hummers法制备氧化石墨烯；
步骤二、还原氧化石墨烯的制备:
(1)将氧化石墨烯分散于去离子水中，然后进行超声处理一定时间后，得到氧化石墨烯的分散体系；其中，去尚`子水与氧化石墨烯的质量比为990:1 ；
(2)往氧化石墨烯的分散体系加入碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为 9.8 ;
(3)往上述pH值为9.8的氧化石墨烯的分散体系加入硼氢化钠溶液，然后在83°C下搅拌0.9小时，得到还原氧化石墨烯，然后将还原氧化石墨烯用双蒸水洗涤至pH值为7，得到中性的还原氧化石墨烯；其中，氧化石墨烯的分散体系与硼氢化钠溶液的体积比为72:13 ;硼氢化钠溶液的质量体积百分比浓度(W/V)为3.5% ；
步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备:将对氨基苯磺酸和硝酸钠溶解于盐酸溶液中，在冰浴冷却的条件下，制得对氨基苯磺酸重氮盐；其中，对氨基苯磺酸、硝酸钠和盐酸溶液的质量比为42:9:12 ;盐酸溶液的摩尔浓度为1.8mol/L ；
步骤四、纳米磺化石墨烯的制备:
(1)将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液；
(2)将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液，并在冰浴条件下搅拌2.2小时，使还原氧化石墨烯与对氨基苯磺酸重氮盐发生耦合反应生成耦合物，然后进行离心处理，再用双蒸水将反应生成的耦合物洗涤至PH值为7，得到呈中性的耦合物；
(3)将上述所得的耦合物分散于水合肼和去离子水的混合溶液中进行还原反应，得到反应混合物，然后在98°C下回流24.7小时，得到磺化石墨烯；其中，水合肼和去离子水的体积比为1.8:97 ；
(4)将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在65°C下进行真空干燥，得到纳米磺化石墨烯。[0042]本实施例4制得的纳米磺化石墨烯为球形颗粒，且纳米磺化石墨烯的平均粒径为98nm,而且,纳米磺化石墨烯颗粒的表面离子带正电。
[0043]本实施例4制得的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，该纳米磺化石墨烯依赖其颗粒表面离子的正电荷与绿色荧光蛋白质粒发生作用，进行转染，纳米磺化石墨烯用作基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该纳米磺化石墨烯的转染效率达到40%左右。而且,所制得的纳米磺化石墨烯能够应用于制作抗肿瘤药物。
[0044]实施例5。
[0045]一种纳米磺化石墨烯的制备方法，它包括以下步骤:
步骤一、Hmnmers法制备氧化石墨烯:用石墨粉末、高猛酸钾、硝酸钠和浓硫酸通过Hummers法制备氧化石墨烯；
步骤二、还原氧化石墨烯的制备:
(1)将氧化石墨烯分散于去离子水中，然后进行超声处理一定时间后，得到氧化石墨烯的分散体系；其中，去离子水与氧化石墨烯的质量比为1010:1 ；
(2)往氧化石墨烯的分散体系加入碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为 9.2 ;
(3)往上述pH值为9.2的氧化石墨烯的分散体系加入硼氢化钠溶液，然后在78°C下搅拌1.1小时，得到还原氧化石墨烯，然后将还原氧化石墨烯用双蒸水洗涤至PH值为7，得到中性的还原氧化石墨烯；其中，氧化石墨烯的分散体系与硼氢化钠溶液的体积比为78:17 ;硼氢化钠溶液的质量体积百分比浓度(W/V)为4.5% ；
步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备:将对氨基苯磺酸和硝酸钠溶解于盐酸溶液中，在冰浴冷却的条件下，制得对氨基苯磺酸重氮盐；其中，对氨基苯磺酸、硝酸钠和盐酸溶液的质量比为48:11:14 ;盐酸溶液的摩尔浓度为1.3mol/L ；
步骤四、纳米磺化石墨烯的制备:
(1)将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液；
(2)将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液，并在冰浴条件下搅拌1.8小时，使还原氧化石墨烯与对氨基苯磺酸重氮盐发生耦合反应生成耦合物，然后进行离心处理，再用双蒸水将反应生成的耦合物洗涤至PH值为7，得到呈中性的耦合物；
(3)将上述所得的耦合物分散于水合肼和去离子水的混合溶液中进行还原反应，得到反应混合物，然后在102°C下回流23.5小时，得到磺化石墨烯；其中，水合肼和去离子水的体积比为2.5:105 ;
(4)将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在62°C下进行真空干燥，得到纳米磺化石墨烯。
[0046]本实施例5制得的纳米磺化石墨烯为球形颗粒，且纳米磺化石墨烯的平均粒径为97nm,而且,纳米磺化石墨烯颗粒的表面离子带正电。
[0047]本实施例5制得的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，该纳米磺化石墨烯依赖其颗粒表面离子的正电荷与绿色荧光蛋白质粒发生作用，进行转染，纳米磺化石墨烯用作基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该纳米磺化石墨烯的转染效率达到40%左右。而且,所制得的纳米磺化石墨烯能够应用于制作抗肿瘤药物。
[0048]实施例6 。
[0049]一种纳米磺化石墨烯的制备方法，它包括以下步骤:
步骤一、Hmnmers法制备氧化石墨烯:用石墨粉末、高猛酸钾、硝酸钠和浓硫酸通过Hummers法制备氧化石墨烯；
步骤二、还原氧化石墨烯的制备:
(1)将氧化石墨烯分散于去离子水中，然后进行超声处理一定时间后，得到氧化石墨烯的分散体系；其中，去尚子水与氧化石墨烯的质量比为1015:1 ；
(2)往氧化石墨烯的分散体系加入碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为 9.6 ;
(3)往上述pH值为9.6的氧化石墨烯的分散体系加入硼氢化钠溶液，然后在76°C下搅拌1.1小时，得到还原氧化石墨烯，然后将还原氧化石墨烯用双蒸水洗涤至PH值为7，得到中性的还原氧化石墨烯；其中，氧化石墨烯的分散体系与硼氢化钠溶液的体积比为73:12 ;硼氢化钠溶液的质量体积百分比浓度(W/V)为4.2% ；
步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备:将对氨基苯磺酸和硝酸钠溶解于盐酸溶液中，在冰浴冷却的条件下，制得对氨基苯磺酸重氮盐；其中，对氨基苯磺酸、硝酸钠和盐酸溶液的质量比为45:10:13 ;盐酸溶液的摩尔浓度为1.6mol/L ；
步骤四、纳米磺化石墨烯的制备:
(1)将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液；
(2)将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液，并在冰浴条件下搅拌2.3小时，使还原氧化石墨烯与对氨基苯磺酸重氮盐发生耦合反应生成耦合物，然后进行离心处理，再用双蒸水将反应生成的耦合物洗涤至PH值为7，得到呈中性的耦合物；
(3)将上述所得的耦合物分散于水合肼和去离子水的混合溶液中进行还原反应，得到反应混合物，然后在97°C下回流24.8小时，得到磺化石墨烯；其中，水合肼和去离子水的体积比为2.2:102 ;
(4)将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在59°C下进行真空干燥，得到纳米磺化石墨烯。
[0050]本实施例6制得的纳米磺化石墨烯为球形颗粒，且纳米磺化石墨烯的平均粒径为102nm,而且,纳米磺化石墨烯颗粒的表面离子带正电。
[0051]本实施例6制得的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，该纳米磺化石墨烯依赖其颗粒表面离子的正电荷与绿色荧光蛋白质粒发生作用，进行转染，纳米磺化石墨烯用作基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该纳米磺化石墨烯的转染效率达到40%左右。而且,所制得的纳米磺化石墨烯能够应用于制作抗肿瘤药物。
[0052]实施例7。
[0053]一种纳米磺化石墨烯的制备方法，它包括以下步骤:
步骤一、Hmnmers法制备氧化石墨烯:用石墨粉末、高猛酸钾、硝酸钠和浓硫酸通过Hummers法制备氧化石墨烯；
步骤二、还原氧化石墨烯的制备:(1)将氧化石墨烯分散于去离子水中，然后进行超声处理一定时间后，得到氧化石墨烯的分散体系；其中，去尚子水与氧化石墨烯的质量比为995:1 ；
(2)往氧化石墨烯的分散体系加入碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为 9.3 ;
(3)往上述pH值为9.3的氧化石墨烯的分散体系加入硼氢化钠溶液，然后在84°C下搅拌0.8小时，得到还原氧化石墨烯，然后将还原氧化石墨烯用双蒸水洗涤至pH值为7，得到中性的还原氧化石墨烯；其中，氧化石墨烯的分散体系与硼氢化钠溶液的体积比为76:16 ;硼氢化钠溶液的质量体积百分比浓度(W/V)为3.8% ；
步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备:将对氨基苯磺酸和硝酸钠溶解于盐酸溶液中，在冰浴冷却的条件下，制得对氨基苯磺酸重氮盐；其中，对氨基苯磺酸、硝酸钠和盐酸溶液的质量比为47:10:11 ;盐酸溶液的摩尔浓度为1.lmol/L ；
步骤四、纳米磺化石墨烯的制备:
(1)将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液；
(2)将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液，并在冰浴条件下搅拌1.9小时，使还原氧化石墨烯与对氨基苯磺酸重氮盐发生耦合反应生成耦合物，然后进行离心处理，再用双蒸水将反应生成的耦合物洗涤至PH值为7，得到呈中性的耦合物；
(3)将上述所得的耦合物分散于水合肼和去离子水的混合溶液中进行还原反应，得到反应混合物，然后在103°C下回流23.3小时，得到磺化石墨烯；其中，水合肼和去离子水的体积比为1.7:98 ；
(4)将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在ere下进行真空干燥，得到纳米磺化石墨烯。
[0054]本实施例7制得的纳米磺化石墨烯为球形颗粒，且纳米磺化石墨烯的平均粒径为IOlnm,而且,纳米磺化石墨烯颗粒的表面离子带正电。
[0055]本实施例7制得的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，该纳米磺化石墨烯依赖其颗粒表面离子的正电荷与绿色荧光蛋白质粒发生作用，进行转染，纳米磺化石墨烯用作基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该纳米磺化石墨烯的转染效率达到40%左右。而且,所制得的纳米磺化石墨烯能够应用于制作抗肿瘤药物。
[0056]实施例8。
[0057]一种纳米磺化石墨烯的制备方法，它包括以下步骤:
步骤一、Hmnmers法制备氧化石墨烯:用石墨粉末、高猛酸钾、硝酸钠和浓硫酸通过Hummers法制备氧化石墨烯；
步骤二、还原氧化石墨烯的制备:
(1)将氧化石墨烯分散于去离子水中，然后进行超声处理一定时间后，得到氧化石墨烯的分散体系；其中，去尚子水与氧化石墨烯的质量比为985:1 ；
(2)往氧化石墨烯的分散体系加入碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为 9.4 ;
(3)往上述pH值为9.4的氧化石墨烯的分散体系加入硼氢化钠溶液，然后在82°C下搅拌0.9小时，得到还原氧化石墨烯，然后将还原氧化石墨烯用双蒸水洗涤至pH值为7，得到中性的还原氧化石墨烯；其中，氧化石墨烯的分散体系与硼氢化钠溶液的体积比为74:14 ;硼氢化钠溶液的质量体积百分比浓度(W/V)为4.7% ；
步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备:将对氨基苯磺酸和硝酸钠溶解于盐酸溶液中，在冰浴冷却的条件下，制得对氨基苯磺酸重氮盐；其中，对氨基苯磺酸、硝酸钠和盐酸溶液的质量比为44:9:11 ;盐酸溶液的摩尔浓度为1.9mol/L ；
步骤四、纳米磺化石墨烯的制备:
(1)将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液；
(2)将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液，并在冰浴条件下搅拌2.1小时，使还原氧化石墨烯与对氨基苯磺酸重氮盐发生耦合反应生成耦合物，然后进行离心处理，再用双蒸水将反应生成的耦合物洗涤至PH值为7，得到呈中性的耦合物；
(3)将上述所得的耦合物分散于水合肼和去离子水的混合溶液中进行还原反应，得到反应混合物，然后在96°C下回流24.9小时，得到磺化石墨烯；其中，水合肼和去离子水的体积比为1.7:98 ；
(4)将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在57°C下进行真空干燥，得到纳米磺化石墨烯。
[0058]本实施例8制得的纳米磺化石墨烯为球形颗粒，且纳米磺化石墨烯的平均粒径为99nm,而且,纳米磺化石墨烯颗粒的表面离子带正电。
[0059]本实施例8制得的纳米磺化石墨烯能够用作基因导入材料，该纳米磺化石墨烯依赖其颗粒表面离子的正电荷与绿色荧光蛋白质粒发生作用，进行转染，纳米磺化石墨烯用作基因导入材料时，具有转染效果高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该纳米磺化石墨烯的转染效率达到40%左右。而且,所制得的纳米磺化石墨烯能够应用于制作抗肿瘤药物。
[0060]结合性能的测定 1、主要材料
实施例1制得的纳米磺化石墨烯(见图1);绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-Cl) ;HEPES平衡盐溶液(自配)；电泳缓冲液(0.5 X TBE,自配)；DNA上样缓冲液；溴化乙啶(EB)。
[0061]2、主要方法
IuL的纳米磺化石墨烯溶液(5mg纳米磺化石墨烯溶解在500μ?双蒸水中)与I μ LpEGFP-CI水溶液(0.1 mg /mL)以及8 ml双蒸水(pH=7.4)在1.5mL离心管中混合,置于室温下让其充分结合30分钟。然后在5000rpm的速度下离心5分钟，再将沉淀物加载到1%的琼脂糖(ΕΒ0.1 mg/mL)中，并在TAE缓冲液的缓冲下和在100V电压下跑40分钟，然后在320nm处观察条带。
[0062]其中，本实验制定五个以下样品:纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的质量比分别用100:1,50:1,30:1,10:1,1:1,上述样品并分别标记为样品1、样品2、样品3、样品4和样品5。
[0063]其中，上述TAE的配制方法如下:
(1)称量氨基丁三醇242g、Na2EDTA.2H20 37.2g置于IL烧杯中；
(2)向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀；
(3)再向烧杯中加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；(4)然后往烧杯中加入NaOH将烧杯中的混合液的pH值调至8.3，再加去离子水定容至1L后，室温保存，使用时再稀释50倍，即得到TAE缓冲液。
[0064]3、结果
结果观察，有多种条带出现，这是因为pEGFP-Cl有多种构型所致。在样品3、样品4和样品5处的条带清晰明显，说明纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的质量比为30:1，10:1和1:1时，纳米磺化石墨烯和绿色荧光蛋白质粒的结合不是很好，然而样品I和样品2处的条带消失，说明纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的质量比为100:1和50:1时，纳米磺化石墨烯和绿色荧光蛋白质粒的结合完全。
[0065]上述结果表明:pEGFP-Cl与纳米磺化石墨烯存在一个最佳的结合比，当纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的质量比大于50:1,继续添加纳米磺化石墨烯，绿色突光蛋白质粒也不会再与多余的纳米磺化石墨烯结合，因此，本实验结果得出，以纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的质量比为50:1的结合比进行转染。
[0066]转染实验 1、主要材料
人乳腺癌细胞；质量比为50:1的纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的联合体；DMEM培养基；胎牛血清FBS ；6孔培养板。
[0067]2、主要方法
(1)人乳腺癌细胞的培养:将人乳腺癌细胞用胰蛋白酶-EDTA消化出来，计数后加入到6孔板中(5X 106/孔)，然后用含FBS10%的DMEM溶液并加转染优化试剂培养至细胞密度为60%~70%的融合度。
[0068](2)细胞转染实验:将培养好的人乳腺癌细胞的上清除去，并换上新的培养液，然后分成三份，分别为第一样品、第二样品和第三样品，第一样品中不添加任何其它物质，往第二样品中加入质量比为50:1的纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的联合体，往第三样品中加入脂质体2000和pEGFP-Cl的联合体，然后对第一样品、第二样品和第三样品分别培养48小时，然后对第二样品进行荧光测定(见图2)，并对第一样品、第二样品和第三样品分别进行细胞存活率测定(见图3)、转染效率测定(见图4)。其中，细胞存活率测定时，是用碘化吡啶进行标识，并使用流式细胞仪进行检测。转染效率测定是使用流式细胞仪进行检测。
[0069]3、结果分析
从图2中的荧光图片可以看出有明显的绿色荧光，并且绿色荧光的覆盖面较大，说明纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的联合体在人乳腺癌细胞中转染成功。
[0070]图3的细胞存活率图片中，由左到右分别代表第一样品(control)、第二样品(ACCnanoparticles)和第三样品(Iipofectamine 2000)的存活率,其中，第一样品的存活率为100%，第二样品的存活率为98%，第三样品的存活率为88%。因此，从图3中可以看到，质量比为50:1的纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的联合体对人乳腺癌细胞的存活率的影响是很小的，相比之下，脂质体2000和pEGFP-Cl的联合体对人乳腺癌细胞的存活率的影响较大。
[0071]图4的转染效率图片中，由左到右分别代表第一样品(control)、第二样品(ACCnanoparticles)和第三样品(Iipofectamine 2000)的转染效率。由图4中可以看到,纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的联合体可以达到约40%的转染效率，这是在保证了人乳腺癌细胞存活率为98%的前提下达到的转染效率。虽然纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的联合体的转染效率不及脂质体2000的转染效率高，但是，纳米磺化石墨烯和pEGFP-Cl的联合体的高细胞相容性是脂质体2000所无法比拟的。
[0072] 终上所述，由上述实验结果和分析可知，纳米磺化石墨烯作为转染试剂具有巨大的潜力。
【权利要求】
1.一种纳米磺化石墨烯的制备方法，其特征在于:它包括以下步骤: 步骤一、Hmnmers法制备氧化石墨烯:用石墨粉末、高猛酸钾、硝酸钠和浓硫酸通过Hummers法制备氧化石墨烯； 步骤二、还原氧化石墨烯的制备: (1)将氧化石墨烯分散于去离子水中，然后进行超声处理一定时间后，得到氧化石墨烯的分散体系； (2)往氧化石墨烯的分散体系加入碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为9~10 ； (3)往上述pH值为扩10的氧化石墨烯的分散体系加入硼氢化钠溶液，然后在一定温度下搅拌一定时间，得到还原氧化石墨烯，然后将还原氧化石墨烯用双蒸水洗涤至PH值为7，得到中性的还原氧化石墨烯； 步骤三、对氨基苯磺酸重氮盐的制备:将对氨基苯磺酸和硝酸钠溶解于盐酸溶液中，在冰浴冷却的条件下，制得对氨基苯磺酸重氮盐； 步骤四、纳米磺化石墨烯的制备: (1)将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液； (2)将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液，并在冰浴条件下搅拌一定时间，使还原氧化石墨烯与对氨基苯磺酸重氮盐发生耦合反应生成耦合物，然后进行离心处理，再用双蒸水将反应 生成的耦合物洗涤至PH值为7，得到呈中性的耦合物； (3)将上述所得的耦合物分散于水合肼和去离子水的混合溶液中进行还原反应，得到反应混合物，然后在一定温度下回流一定时间，得到磺化石墨烯； (4)将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在一定温度下进行真空干燥，得到纳米磺化石墨烯。
2.根据权利要求1所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，其特征在于:所述步骤二的第(I)步，所述氧化石墨烯的分散体系中，所述去离子水与所述氧化石墨烯的质量比为980~1020:lo
3.根据权利要求1所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，其特征在于:所述步骤二的第(3)步，所述氧化石墨烯的分散体系与所述硼氢化钠溶液的体积比为70-80:10-20 ;所述硼氢化钠溶液的质量体积百分比浓度(W/V)为3%~5%。
4.根据权利要求1所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，其特征在于:所述步骤二的第(3)步，搅拌温度设置为75°C~85°C，搅拌时间设置为0.8小时~1.2小时。
5.根据权利要求1所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，其特征在于:所述步骤三中，对氨基苯磺酸、硝酸钠和盐酸溶液的质量比为40-50:8^12:10-15 ;所述盐酸溶液的摩尔浓度为lmol/L~2mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，其特征在于:所述步骤四的第(2)步，在冰浴条件下搅拌1.5小时~2.5小时。
7.根据权利要求1所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，其特征在于:所述步骤四的第(3)步，水合肼和去离子水的体积比为1.5^3 =95^110 ;回流温度为95°C~105°C，回流时间为23小时~25小时。
8.根据权利要求1所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法，其特征在于:所述步骤四的第(4)步，真空干燥的温度设置为55°C~65°C。
9.权利要求1至8任意一项所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法所制得的纳米磺化石墨烯用作基因导入材料的应用。
10.权利要求1至8任意一项所述的一种纳米磺化石墨烯的制备方法所制得的纳米磺化石墨烯用于制作抗肿 瘤药物的应用。
【文档编号】C01B31/04GK103641106SQ201310620668
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】王深明, 徐安武, 张德元, 常光其, 周鸿雁, 李梓伦, 夏浩明, 张红霞 申请人:中山大学附属第一医院