一种水稻花药特异表达启动子OsAnth3及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明设及一种水稻 花药特异表达启动子0sAnth3及其应用，该启动子能够在水稻转基因工程中驱动目标基因 在水稻花药中特异表达。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是良好的单子叶植物模式生物。在当今 人口数量日益增长，而耕地面积不断减少的情况下，提高粮食单产，已成为确保我国粮食安 全的重要途径之一。提高水稻产量在保障我国粮食安全中始终担当着重要角色。杂种优势 的利用是提高水稻产量和改良作物品种的重要途径。然而，杂交水稻的常规育种方式，种质 资源有限，转育周期长，受环境溫度和光周期等条件的影响，使得杂种优势的潜力得不到更 大的发挥。近年来，利用分子育种手段开展杂交育种，广泛的研究应用转基因水稻，解决了 常规育种方法资源利用率低、育种周期长等瓶颈问题，提高杂交制种纯度，降低杂交制种成 本。但是，转基因作物的基因漂移及其可能引起的环境后果，是转基因生态安全的潜在风 险。
[0003] 利用植物基因工程创建雄性不育则既为杂交制种提供可利用种质资源，又可阻断 基因漂移，有效规避转基因生物生态安全等问题，具有广阔的应用前景。杂交制种创建雄性 不育，造成植物花器官败育是必然途径，需要花粉或花药特异表达启动子引导。
[0004] 因此在水稻运种单子叶模式生物中发掘和研究花药特异启动子具有重要的理论 和实际价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种驱动目标基因在水稻花药特异性表达的启动子，获得含 有该启动子序列的宿主菌、转化子的方法W及该启动子的应用。
[0006] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻花药特异表达启动子，所述水稻 花药特异表达启动子0sAnth3包含下列序列之一或者下列序列的互补序列之一：
[0007] 与SEQ ID No:l所示的DNA序列具有90%w上的同源性并且具有启动子功能的DNA 序列；
[000引在SEQ ID No: 1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个W上核巧酸 生成的具有启动子功能的突变体或等位基因或衍生物；
[0009] 与具有SEQ ID No:l所示DNA序列的植物杂交所得产物的DNA序列，该DNA序列具有 启动子功能。
[0010] 优选地，所述水稻花药特异表达启动子0sAnth3由序列表中SEQ ID No:l所示的 DM序列或其互补序列构成。序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻 (Oiyza sativa L CV.化卵onbare)的序列，本文中称为0sAnth3或启动子0sAnth3。
[0011] 具体而言，本申请的发明人发现并且分离克隆了日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Ni卵onbare)中的1812bp的DNA序列，并鉴定了该DNA序列的功能，具有驱动目标基因在 水稻花药中特异性表达的功能。
[0012] 另一方面，本发明还提供一组扩增权利要求1或2所述的水稻花药特异表达启动子 的全部或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正 向引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:2所述，所述反向引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:3所 /J、- 〇
[0013] 另一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻 花药特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻花药特异表达启动子连接于待表 达的基因序列的上游。优选地，所述待表达的基因为Gus基因。该重组表达载体为将SEQ ID No: 1所示的序列即0sAnth3或启动子0sAnth3构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体， 本文中称为pCAMBIA1391-〇sAnth3。或者待表达基因可W为任何对水稻花药具有改善功能 的基因。
[0014] 另一方面，本发明还提供一种获得宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括将所 述的启动子、所述的表达盒或者所述的重组表达载体，利用冻融法转入根癌农杆菌。
[0015] 另一方面，本发明提供一种获得转化子的方法，其特征在于，所述方法包括将所获 得的宿主菌通过农杆菌介导方法对目标细胞、愈伤组织或植株进行转化，获得相应转化子。
[0016] 再一方面，本发明提供上述水稻花药特异表达启动子在培育转基因植物中的应 用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻花药特异表达启动子连接于载体的待表达的基 因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所述 重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0017] 所述应用具体包括：
[001引利用序列表SEQ ID No.2和3中的引物，W水稻品种日本晴DNA为模板，扩增权利要 求1所述的水稻花药特异表达启动子0sAnth3,采用如下扩增程序:95°C预变性5min;95°C变 性 30s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 2min30s，循环 35 次;最后 72°C 延伸 lOmin;
[0019] 回收PCR扩增的目的片段，将其连接到特定载体，按照冷激法转化大肠杆菌感受态 细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛 选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用化ndlll和BamHI进行双酶切验证，验证正确的 克隆即为所要获得的水稻花药特异表达启动子0sAnth3;
[0020] 从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用化ndlll和BamHI进行双酶切，回收所述的 水稻花药特异表达启动子0sAnth3;
[0021] 将所述水稻花药特异表达启动子0sAnth3和另一个特定载体连接，得到所述水稻 花药特异表达启动子0sAnth3与该载体上的待表达基因融合的植物表达载体，利用冻融法 将该植物表达载体转入根癌农杆菌；
[0022] 利用农杆菌介导方法，对水稻种子，采用上面所获得的转入了植物表达载体的根 癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得相应水稻植株。
[0023] 并且所述应用可W用于改良植物生长特性。所述植物为禾本科植物，例如水稻、小 麦、高梁、大麦、燕麦、黑麦、玉米等。优选为水稻。
[0024] 本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:l中相同）：
[0025]
[0027]需要说明的是，本发明所提供的启动子序列中，序列开头的"acctatcaac aaaacaactc aa"为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp;序列末尾的 序列"cagacgacac a化gaaggtt tt"为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留 存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp;该DNA序列中剩余的部分则为来自日本晴 水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可W指上述整个DNA序列，也可 W指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的 基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
[002引综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)中的一段具有转录调控活性的1812bp的DNA序列，并将其命名为启动子 0sAnth3。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质 粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌介导的 方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行GUS组织化学染色检 测发现，GUS仅着色与花粉和花药壁中，并不着色与根、茎、叶、颖壳和花丝等其他位置，从而 证明该1812bp的序列具有驱动基因在花药部位特异性表达的活性。
[0029] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可W与所需的祀标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水 稻的花药部位特异性的驱动祀标基因的表达，有效改良水稻的育性。
[0030] 技术效果
[0031] 本发明所克隆的水稻启动子0sAnth3能够调控基因在作物花药中特异性集中表 达，利用本发明的启动子与具有抑制或干扰花药生长功能的基因配合使用，可W干扰作物 雄性生殖器官的生长发育，得到花粉败育作物，用于杂交育种研究；阻断基因漂移，降低转 基因作物的生态风险。经染色实验验证，将其应用于转基因品种的培育，能够W最小代谢负 担而改变花药部分的生长特性，具有显著的潜在社会和经济价值。
【附图说明】
[0032] W下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0033] 图1为将0sAnth3启动子构建于PCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为 PCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-〇sAnth3示意图，其中示出了利用0sAnth3启动 子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0034] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0035] 图3为10周龄0sAnth3-GUS转基因植物各组织GUS染色图。（A)根；（B)茎；（C)成熟叶 片；（D)小花；（E)雄蕊；（F)花药。标尺化mm。
【具体实施方式】
[0036] W下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，运些实施例仅 用于说明本发明，其不W任何方式限制本发明的范围。
[0037] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生 化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0038] 含有酶切位点的0sAnth3启动子的获得
[0039] 步骤1、引物的设计
[0040] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（0;ryza sativa L cv.Ni卵onbare)全基因组 序列，依据水稻0sAnth3基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及祀标基因的特点， 设计引物的酶切位点。
[0041 ] 本实施例中W水稻双元表达载体PCAMBIA1391