(来自于GAMBIA,公开使用载体，安 徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中屯、水稻组保存)为例，祀标基 因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID No : 2)5 '端带HindllI，酶切位点 (AAGCTT)，反向引物(SEQ ID齡:3)5'端带6曰恤1，酶切位点(664了0：)，引物序列如下：
[0042] 正向引物:AAGCTTACCTATCAACAAAACAACTCAA Hindlll
[0043] 反向引物：GGATCCAAAACCTTCTATGTGTCGTCTG BamHI
[0044] 由深圳华大基因公司合成。
[0045] 步骤2、启动子0sAnth3的获得
[0046] W水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子0sAnth3,按常 规PCR体系，采用如下扩增程序：95°C预变性5min;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸 2min30s，循环35次；最后72°C延伸lOmin。
[0047] 回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1812bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购 自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌化-Blue感受态 细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛 选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用化ndin和BamHI进行双酶切验证，如图2所示。 将经过鉴定的阳性克隆送至Invi化ogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子 0sAnth3,其核酸序列如沈Q ID No:l所示。
[0048] 植物表达载体的构建和农杆菌的转化
[0049] 从上面"启动子0sAnth3的获得"过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用化ndn I和 BamHI酶切，回收启动子0sAnth3片段。同时利用Hindin和BamHI对PCAMBIA1391进行线性化 处理、回收PCAMBIA1391，将上述的0sAnth3片段和PCAMBIA1391片段用T4DNA连接酶(购于 化KaRa公司）进行连接，得到启动子0sAnth3与Gus基因融合的植物表达载体PCAMBIA1391- 0sAnth3，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens) EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中屯、水稻组保存）。
[0050] 利用启动子0sAnth3驱动Gus报告基因在水稻中表达 [0051 ]步骤1:农杆菌介导的水稻遗传转化
[0052] 将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子Imin，倒掉酒精。用含有1滴 Tween20的50%次氯酸钢（原液有效氯浓度大于4% )溶液浸泡种子40min(15化/min)。倒掉 次氯酸钢，无菌水洗3-6遍至溶液澄清，无次氯酸钢味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿 种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养10-12天后将愈伤与 胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于 农杆菌的转化。
[0053] 采用上述"植物表达载体的构建和农杆菌的转化"过程中转入了重组表达载体的 根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得0sAnth3: : gus转基因水稻植株，该遗传转化、 转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，畑enguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Repo;rt，2012.D0I 10.1007/s00299- 012-1275-3.)等提出的方法。
[0化4] 步骤2、GUS组织化学染色
[0055] 参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion:0-Glucu;ronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.,1987,6: 3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37°C，过夜24小 时，75%乙醇脱色，直至将组织中的叶绿素脱掉。结果如图3所示，各组织与GUS染液中染色 2地后，仅有花药上有代表GUS活性的蓝色出现，组织放大后表明GUS仅着色与花粉和花药壁 中，并不着色与根、茎、叶、颖壳和花丝等其他位置。运表明，本发明的启动子0sAnth3启动子 具有花药特异表达活性。
[0056] 虽然本发明W水稻为例进行描述，但是申请人认为，本发明所获得启动子的应用 场景不限于水稻，本发明启动子可W用于各种禾本科作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高 梁或燕麦，优选为水稻。
[0057] W上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可W根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
【主权项】
1. 一种水稻花药特异表达启动子0sAnth3，其特征在于，所述水稻花药特异表达启动子 OsAnth3包含下列序列之一或者下列序列的互补序列之一： 与SEQ ID No: 1所示的DNA序列具有90%以上的同源性并且具有启动子功能的DNA序 列； 在SEQ ID No: 1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成 的具有启动子功能的突变体、等位基因或衍生物； 与具有SEQ ID No: 1所示DNA序列的植物杂交所得产物中的具有启动子功能的DNA序 列。2. 水稻花药特异表达启动子0sAnth3,其特征在于，所述水稻花药特异表达启动子 0sAnth3是从水稻属植物中分离获得的。3. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的水稻花药特异表达启动 子0sAnth3。4. 一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的水稻花药 特异表达启动子0sAnth3,在所述重组表达载体中，所述水稻花药特异表达启动子0sAnth3 连接于载体中待表达的基因序列的上游;所述重组表达载体为pCAMBIA1391-〇sAnth3,其中 pCAMBIAl 391为作物双元表达载体。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因是具有改善花 药性状功能的基因。6. -种获得宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1中所述的水稻花药 特异表达启动子0sAnth3、权利要求3所述的表达盒或者权利要求4或5所述的重组表达载 体，利用冻融法转入根癌农杆菌。7. -种获得转化子的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求6所获得的宿主菌 通过农杆菌介导方法对目标细胞、愈伤组织或植株进行转化，获得相应转化子。8. -种根据权利要求1所述的水稻花药特异表达启动子0sAnth3在培育转基因水稻中 的应用，其特征在于，所述应用包括:将权利要求1所述的水稻花药特异表达启动子0sAnth3 连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体;将所述重组表达载体转化 到水稻细胞、组织或器官中进行培育。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括： 利用序列表SEQ ID No. 2和3中的引物，以水稻品种日本晴DNA为模板，扩增权利要求1 所述的水稻花药特异表达启动子0sAnth3,采用如下扩增程序:95°C预变性5min;95°C变性 30s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 2min30s，循环 35 次；最后 72°C 延伸 lOmin; 回收PCR扩增的目的片段，将其连接到特定载体，按照冷激法转化大肠杆菌感受态细胞 后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获 得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用Hindlll和BamHI进行双酶切验证，验证正确的克隆 即为所要获得的水稻花药特异表达启动子0sAnth3; 从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用Hindlll和BamHI进行双酶切，回收所述的水稻 花药特异表达启动子0sAnth3; 将所述水稻花药特异表达启动子0sAnth3和另一个特定载体连接，得到所述水稻花药 特异表达启动子0sAnth3与该载体上的待表达基因融合的植物表达载体，利用冻融法将所 述植物表达载体转入根癌农杆菌； 利用农杆菌介导方法，对水稻种子，采用所获得的转入了植物表达载体的根癌农杆菌 进行农杆菌介导的遗传转化，获得相应水稻植株。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良作物生长特性，所述作 物为禾谷类作物:水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦、玉米等。
【专利摘要】本发明提供一种水稻花药特异表达启动子OsAnth3及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、重组表达载体以及利用其获得相应宿主菌和转化子的方法。经染色实验验证，本发明的水稻花药特异表达启动子OsAnth3能够驱动目标基因在水稻花药中强表达，而其他部位几乎没有任何表达，证明本发明的启动子具有很强的组织特异性。将其应用于转基因品种的培育，能够以最小代谢负担而改变花药部分的生长特性，具有显著的潜在社会和经济价值。本发明将其应用于植物基因工程中，驱动目标基因在作物花药中特异表达，利用本发明的启动子与具有抑制或干扰花药生长功能的基因配合使用，干扰作物花药的生长发育，用于杂交育种研究；阻断基因飘移，防控转基因作物可能引起的生态风险。
【IPC分类】C12R1/01, A01H5/00, C12N15/113, C12N15/84, C12N1/21
【公开号】CN105671049
【申请号】CN201610157500
【发明人】李娟 , 杨剑波, 魏鹏程, 李 浩, 李莉, 杨亚春, 许蓉芳, 秦瑞英
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月17日