专利名称：一种小报春的花药培养方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养，具体地说，涉及小报春(Primulaforbesii Franch.)的 花药培养方法。
背景技术：
小报春(Primula forbesii Franch.)为我国特有的报春花科报春花属二年生草 本植物，原产海拔1500 2000m的我国云南地区。小报春(Primula forbesii Franch.) 是典型的自交不亲和(self-incompatibility)植物，长期的异花授粉使其后代性状分离 广泛，难以稳定遗传。传统的杂交方法费时费力，育种周期较长。 为了縮短育种进程，尽快将优异的报春资源进行纯化，稳定。需要采用花药培养的 方法获得小报春单倍体，形成一套完整的花药培养技术体系，为今后的单倍体加倍获得双 单倍体的纯合种质奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种小报春(Primula forbesii Franch.)的花药培养方法， 以获得小报春单倍体植株，通过单倍体育种途径可快速获得纯合材料，增加有益性状的选 择几率，加快育种进程。 本发明提供一种小报春的花药培养方法，包括外植体的选择、外植体的消毒与接 种、愈伤组织诱导与增殖、愈伤组织分化、组培苗生根培养与移栽，其中，所述愈伤组织诱导 与增殖的培养基为MS+6-BA1. 0mg/L+2， 4-D 0. 5mg/L， 30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH为5. 9 6. 0 ;所述愈伤组织分化培养基为MS+6-BA 0. 2mg/L+NAA 0. 01mg/L， 40g/L蔗糖，7g/L琼脂， pH为5. 9 6. 0 ;所述生根培养基为MS， pH为5. 9 6. 0。 所述的外植体为小报春稍露色的花药；应选择小孢子发育时期大多处于单核靠 边期的花药进行培养，此时从外观上花蕾明显膨大，花瓣微露出花萼，长度在4. 0-5. 0mm之 间。 所述愈伤组织诱导与增殖时，光照条件为人工辅助光1500 2000Lux ;温度为 24 26。C，光照时间12 14h/d。 所述愈伤组织分化时，光照条件为人工辅助光2000 3000Lux ;温度为24 26。C，光照时间12 14h/d。 所述生根培养时，光照条件为人工辅助光2000 3000Lux ;温度为24 26°C ，光 照时间12 14h/d。 所述组培苗的移栽温度为18 25°C 。 所述外植体采用流水下冲洗lh，70% (体积比)乙醇进行表面消毒，消毒时间为 30s，无菌水冲洗3 5次后，2X次氯酸钠(重量比)进行表面消毒，消毒时间控制在8 10min，无菌水冲洗3 5次。 所述组培苗经在生根培养基中培养2 3周后，炼苗3 4天移栽至温室细草炭
3土中培养。 本发明所述的小报春的花药培养方法，具体为选取小报春的稍露色、长度在 4. 0 5. 0mm之间的花药为外植体，经流水下冲洗lh， 70%乙醇进行表面消毒，消毒时间为 30s，无菌水冲洗3 5次后，2%次氯酸钠进行表面消毒，消毒时间控制在8 10min，无菌 水冲洗3-5次；接种到花药愈伤组织诱导培养基，MS+6-BA 1. 0mg/L+2，4-D 0. 5mg/L，30g/L 蔗糖，6g/L琼脂，pH为5. 9 6. 0 ;光照条件为人工辅助光1500 2000Lux ;温度为24 26t:，光照时间12 14h/d ;之后移至相同培养基进行增殖，继代2 3次后转入愈伤组织 分化培养基，MS+6-BA 0. 2mg/L+NAA 0. 01mg/L， 40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5. 9 6. 0 ;光 照条件为人工辅助光2000 3000Lux ;温度为24 26。C，光照时间12 14h/d ;将分化的 组培苗转入生根培养基MS， pH为5. 9 6. 0 ;光照条件为人工辅助光2000 3000Lux ;温 度为24 26°C ，光照时间12 14h/d ;生根培养2 3周，炼苗3 4天后，移至细草炭土 中培养，保持湿度高于80%，每天喷水2 3次。 组培苗移栽时的温度应控制在18 25t:之间，过高或过低都不利于组培苗的成 活，夏季不宜进行组培苗的移栽。 —般来说，盛花期的小报春着花量很大，每株植株可以产生200朵以上的花朵数 量，因此花药的取材十分充足。通过小报春(Primulaforbesii Franch.)花药培养再生的 组培苗生长良好。 与传统技术相比，本发明小报春(Primula forbesii Franch.)的花药培养方法具 有以下有益效果 1)建立了一种小报春(Primula forbesii Franch.)的花药培养方法，相比传统的 自交获得纯合系的方法比，后者至少需要3-5年才可获得纯系，而花药培养摆脱了季节与 气候的限制因素，只需10-12个月就可获得大批量的单倍体，大大縮短了育种进程，为今后 的单倍体直接加倍成纯合双单倍体奠定基础； 2)本发明方法中，生根率为70%左右，移栽成活率达到80%以上。通过组织培 养方法得到的幼苗，成长良好，一致性强，适应性较强，病虫害少，易于管理，易于规模化生 产； 3)利用花药培养优质的报春花资源，可以保持该优良种质的特性不变，之后直接 染色体加倍后即可形成具有特异性、一致性、稳定性的新品种。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 小报春(Primula forbesii Franch.)小孢子发育时期的观察。
花期时采集不同大小的花蕾，分别测量花蕾长，观察花蕾发育时期等指标。用镊子 剥去萼片、花瓣，剥出花药置于载玻片上，加一小滴卡宝品红，用镊子捣碎，去除残渣，盖上 盖玻片，显微镜镜检，总结花蕾长度、外观等与小孢子发育时期的关系。经过试验观察发现， 小报春(Primula forbesii Franch.)小孢子发育可分为4个时期，分别为四分体时期、单 核中期、单核靠边期和成熟期。花蕾不饱满，长度小于3. Omm，此时萼片包裹着花冠的小孢子 发育处在四分体时期；花蕾长在3. 0 4. Omm，饱满，花萼与花瓣等长的花药小孢子发育处于单核中期；花蕾明显膨大，花瓣微露出花萼，长度在4. 0 5. 0mm之间的花蕾，其小孢子发 育时期大多处于单核靠边期，满足花药培养的发育条件。花蕾长度大于5. 0mm，花萼充分膨 大，花瓣明显露出花萼的花药小孢子处于成熟期。
实施例2 以小报春(Primula forbesii Franch.)小孢子发育时期为单核靠边期的花药为 外植体进行愈伤组织诱导培养。探讨愈伤组织诱导的最佳基本培养基以及激素浓度最佳配 比。 天气晴朗、干燥的上午9时左右，采集温室内生长的单核靠边期的花蕾备用。先用 70%的酒精浸泡30s，然后用2%的次氯酸钠溶液消毒10分钟，用无菌水冲洗3 4次。在 超净工作台上用小镊子剥出花药，去除花丝，尽量避免花药受到伤害，接种于培养皿中，用 保险膜封口。每个培养皿接种20个花药，每个处理接种5个培养皿。 选取MS、 B5、 N6三种培养基作为小报春花药培养的基本培养基。加入不同浓度配 比的6-BA和2，4-D激素，以愈伤组织诱导率为依据选取最佳激素配比。6-BA的浓度设为 1. 0mg/L和2. Omg/L两个梯度，2，4-D的浓度设为0. 5mg/L、1. 0mg/L、1. 5mg/L、2. Omg/L四 个梯度，采用三因素完全随机试验设计，组合了 24组培养基配方。30g/L蔗糖，6g/L琼脂， pH为5. 9 6. 0。光照条件为人工辅助光1500 2000Lux。温度为24 26。C，光照时间 12 14h/d。 不同的基本培养基以及不同激素浓度配比影响着小报春(Primulaforbesii Franch.)花药愈伤组织的形成。接种60天左右，花药上开始形成浅黄绿色的愈伤组织，将 产生愈伤组织的花药转入相同培养基，愈伤组织逐渐增大。经统计证明，MS、Bs、Ne的愈伤诱 导率分别为1.2%、0.3%、0.5%。可以看出，MS是小报春花药培养的最为适合的基本培养 基。MS+6-BA 1. 0mg/L+2， 4-D 0. 5mg/L的培养基上，愈伤组织诱导率最大，为2. 3% ，该激素
浓度为小报春花药愈伤组织诱导的最佳培养激素配比。
实施例3 小报春(Primula forbesii Franch.)愈伤组织分化培养基的筛选。
将增殖后的愈伤组织转入分化培养基中。分化培养基是以MS为基本培养基，以 6-BA和NAA为激素种类，6-BA的浓度梯度为0. Img/L、0. 2mg/L、0. 5mg/L、l. 0mg/L、2. Omg/L， NAA的浓度梯度为0. 01mg/L、0. Img/L、0. 2mg/L、0. 5mg/L，组合了 10种分化培养基，探讨其 对小报春愈伤组织分化的影响。40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.9 6.0。光照条件为人工 辅助光2000 3000Lux。温度为24 26。C，光照时间12 14h/d。 愈伤组织接入分化培养基后40 60d，6-BA 0. 2mg/L+NAA 0. Olmg/L的分化培 养基上分化出腋芽，不断抽出新叶，并在愈伤上不断大量形成不定芽，后长出叶片；而6-BA 1. Omg/L+NAA 0. 5mg/L、6-BA2. Omg/L+NAA 0. lmg/L以及6-BA 2. Omg/L+NAA 0. 2mg/L这三 种培养基上均分化出根，而抑制了芽的分化，最终组织变褐死亡。
实施例4 小报春(Primula forbesii Franch.)花药培养组培苗的生根培养。
当不定芽在分化培养基上长出3-4片真叶时，将其从愈伤组织上切除，转入生根 培养基上，配方为MS、 MS+IBA(0. 05mg/L、0. Img/L、0. 2mg/L) ，40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为 5. 9 6. 0。光照条件为人工辅助光2000 3000Lux。温度为24 26。C，光照时间12 14h/d。各培养基均可使组培苗生根，观察发现，随着IBA浓度的增大，根逐渐变得粗短，MS
培养基中的生根量最大且须根长而密集，生根率为70%左右，是花药培养组培苗的最佳生
根培养基。 实施例5 小矛艮春(Primula forbesii Franch.)花药培养组培苗的移栽。 生根培养两周以后，待组培苗平均每株生根4 5条，根长达到1cm时，即可开始
为移栽作准备。炼苗是组培苗移栽前的过渡，可以帮助组培苗逐步适应外界环境，使组培苗
更健壮，叶色更加深绿，从而提高成活率。小报春(Primula forbesii Franch.)组培苗炼
苗3 4天后，移栽至温室细草炭土中，草炭土提前铺满穴盘，清水浸透；组培苗移栽后保持
湿度80%以上，覆薄膜并每天喷水2 3次，2周以后即可逐步进行正常管理，移栽成活率
达到80%以上。 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
一种小报春的花药培养方法，包括外植体的选择、外植体的消毒与接种、愈伤组织诱导与增殖、愈伤组织分化、组培苗生根培养与移栽，其特征在于，所述愈伤组织诱导与增殖的培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH为5.9～6.0；所述愈伤组织分化培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L，40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.9～6.0；所述生根培养基为MS，pH为5.9～6.0。
2 根据权利要求1所述的花药培养方法，其特征在于，所述的外植体为小报春稍露色 的花药，长度在4. 0 5. Omm之间，此时的大部分小孢子的发育时期为单核靠边期。
3. 根据权利要求1所述的花药培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导与增殖时，光 照条件为人工辅助光1500 2000Lux ;温度为24 26。C，光照时间12 14h/d。
4. 根据权利要求1所述的花药培养方法，其特征在于，所述愈伤组织分化时，光照条件 为人工辅助光2000 3000Lux ;温度为24 26。C，光照时间12 14h/d。
5. 根据权利要求1所述的花药培养方法，其特征在于，所述生根培养时，光照条件为人 工辅助光2000 3000Lux ;温度为24 26。C，光照时间12 14h/d。
6. 根据权利要求1 5任意一项所述的花药培养方法，其特征在于，所述组培苗的移栽 温度为18 25°C。
7. 根据权利要求1 6任意一项所述的花药培养方法，其特征在于，所述外植体采用流 水下冲洗lh，70X乙醇进行表面消毒，消毒时间为30s，无菌水冲洗3 5次后，2%次氯酸 钠进行表面消毒，消毒时间控制在8 10min，无菌水冲洗3 5次。
8. 根据权利要求1 7任意一项所述的花药培养方法，其特征在于，所述组培苗经在生 根培养基中培养2 3周后，炼苗3 4天移栽至温室细草炭土中培养。
9. 根据权利要求1 8任意一项所述的花药培养方法，其特征在于，选小报春的稍 露色、长度在4. 0 5. Omm之间的花药为外植体，经流水下冲洗lh， 70 %乙醇进行表面消 毒，消毒时间为30s，无菌水冲洗3 5次后，2%次氯酸钠进行表面消毒，消毒时间控制在 8 10min，无菌水冲洗3-5次；接种到花药愈伤组织诱导培养基，MS+6-BA 1. 0mg/L+2，4-D 0. 5mg/L， 30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH为5. 9 6. 0 ;光照条件为人工辅助光1500 2000Lux ; 温度为24 26t:，光照时间12 14h/d ;之后移至相同培养基进行增殖，继代2 3次后 转入愈伤组织分化培养基，MS+6-BA 0. 2mg/L+NAA 0. 01mg/L， 40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为 5. 9 6. 0 ;光照条件为人工辅助光2000 3000Lux ;温度为24 26°C ，光照时间12 14h/ d ;将分化的组培苗转入生根培养基MS， pH为5. 9 6. 0 ;光照条件为人工辅助光2000 3000Lux ;温度为24 26°C ，光照时间12 14h/d ;生根培养2 3周，炼苗3 4天后，移 至细草炭土中培养，保持湿度高于80%，每天喷水2 3次。
全文摘要
本发明提供一种小报春的花药培养方法，包括外植体的选择、外植体的消毒与接种、愈伤组织诱导与增殖、愈伤组织分化、组培苗生根培养与移栽，其中，所述愈伤组织诱导与增殖的培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH为5.9～6.0；所述愈伤组织分化培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L，40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.9～6.0；所述生根培养基为MS，pH为5.9～6.0。利用本发明方法得到的幼苗，成长良好，一致性强，适应性较强，病虫害少，易于管理，易于规模化生产。
文档编号A01H4/00GK101766121SQ200910244440
公开日2010年7月7日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者孙明, 张启翔, 潘会堂, 程堂仁, 董玲玲, 贾茵 申请人:北京林业大学