专利名称：通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法
通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法技术领域
本发明属于农业领域，特别涉及矮牵牛通过花药培养获得再生植株的方法。
技术背景
矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)，又名碧科茄、灵芝牡丹，属茄科矮牵牛属的多年生草本植物，因其色彩丰富艳丽、品种繁多、花色多变、花期长、适应性强、粗放型管理，是当前我国优良的重要花坛绿化草花，亦可以作盆栽花卉。矮牵牛较为耐热是我国夏秋季节常用的绿化草花。由于矮牵牛具有明显的杂种优势，观赏性强，目前市面上销售的矮牵牛种子多为Fl代，并且主要从国外进口。利用杂交优势进行杂交育种的关键是获得优良性状的纯系父母本(自交系)。为了获得自交系，按常规的自交方法，需要耗费大量的田间土地、时间和劳力，一般需要5-6年的时间，而且手续十分繁琐，最终的纯度也不够理想。而采用花药培养获得单倍体再加倍的方法，只需1年时间就可以获得和多代自交效果相同的纯系，可以极大地缩短杂交育种年限，提高育种效率(王成社，西安联合大学学报(自然科学自版)， 2000,3(4) :7-10)。目前，有关矮牵牛花药培养的研究在国外有一定的研究基础，但在国内仅有3篇相关的论文报道，并且再生率相当低。此外，笔者按照其所述方法并没有得到经花药培养的矮牵牛再生植株。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法， 通过本发明可对矮牵牛进行花药培养产生单倍体植株，再经常规的秋水仙素加倍或经自然加倍能够产生纯合自交系，可为矮牵牛通过杂交获得Fl代种子提供优良的亲本材料。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法，依次包括以下步骤
A)、低温预处理和消毒选取矮牵牛花蕾，并于3 7°C中进行低温预处理2 4 天；低温预处理后进行消毒处理；
B)、将步骤A)所得的花蕾用镊子剥去花萼和花瓣，取出花药，将花药去净花丝后接种在诱导愈伤组织培养基上；培养温度为25士 1°C，培养条件为暗培养；每13 17天更换一次新鲜的诱导愈伤组织培养基，待愈伤组织形成后将愈伤组织转接到新鲜的诱导愈伤组织培养基上进行继代培养；继代培养至少2次；
C)、将步骤B)继代培养所得的愈伤组织转接到分化培养基上进行不定芽的分化培养；培养室温度25士 1°C，光照培养，光照强度为180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照时间为 13 1 ( 一般可选择在5 00-19 00进行光照)；当所得的不定芽达到3 5cm时，停止分化培养；
上述分化培养一般需要4 6周，此时会形成较多的芽丛；
D、再生苗的生根培养
将步骤C)所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养，直至小苗上长出至少3条且长度> 2cm的不定根(一般需要20天左右)；得可出瓶种植的种苗，该可出瓶种植的种苗为再生植株；培养条件25士 1°C，需光培养，光照强度为200 300mol m_2 · s—1 ；
上述步骤Α) D)均在无菌环境中进行。
作为本发明的通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法的改进
诱导愈伤组织培养基为=Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0. 5 2. 0mg/L6-BA+0. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 为 5·8 ；
上述诱导愈伤组织培养基的制备方法为在每L Nitsch基本培养基上添加7g的琼脂、20g 的麦芽糖、0. 5 2. Omg 的 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤，6-Benzylaminopurine)、0. 2mg 的 2，4-DQ，4- 二氯苯氧乙酸，2，4-dichlorophenoxyacetic acid)和 0. 5mg 的 ΝΑΑ(α -萘乙酸，1-naphthlcetic acid)；然后用浓度为lmol/L的NaOH溶液或lmol/L的HCl溶液调节PH值为5.8。
分化培养基为=Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0. 1 0. 5mg/ LIBA+1. 0 2. Omg/L 6-BA+ 水解酪蛋白 0. 5g/L, pH 为 5. 8 ；或者为Nitsch 基本培养基 +7g/L 琼脂 +20g/L 麦芽糖 +0. 1 0. 5mg/L IBA+1. 0 2. Omg/L TDZ(噻苯隆， thidiazuron) + 水解酪蛋白 0. 5g/L, pH 为 5. 8 ；
上述该分化培养基的制备方法为在每L Nitsch基本培养基上添加7g的琼脂、 20g 的麦芽糖、0. 1 0. 5mg 的 IBA (吲哚丁酸，3-indolebutyric acid)、1. 0 2. Omg 的 6-BA 和0. 5g水解酪蛋白，然后用浓度为lmol/L的NaOH溶液或lmol/L的HCl溶液调节pH值为 5. 8 ；或者为在每L Nitsch基本培养基上添加7g的琼脂、20g的麦芽糖、0. 1 0. 5mg的 IBA、1. 0 2. Omg的TDZ和0. 5g水解酪蛋白，然后用浓度为lmol/L的NaOH溶液或lmol/L 的HCl溶液调节pH值为5. 8 ；
生根培养基为=Nitsch基本培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值为 5.8 ；
上述生根培养基的制备方法为在每L Nitsch基本培养基上添加7g琼脂、30g蔗糖、0. 2mg的NAA，然后用浓度为lmol/L的NaOH溶液或lmol/L的HCl溶液调节pH值为5. 8。
作为本发明的通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法的进一步改进步骤A) 中低温预处理和消毒为依次进行以下步骤
1)、在晴天的上午，选取纵径长度在0. 8cm 1. 3cm的矮牵牛的花蕾，
2)、将上述花蕾装入塑料袋中，放入3 7°C冰箱中低温预处理2 4天；
3)、将上述低温预处理后的花蕾先放在自来水下冲洗，再用蒸馏水冲洗2 4次后用吸水纸吸干水分；然后放在超净工作台上，用体积浓度为70 80%的酒精灭菌0. 5 1. 5min ；接着用无菌蒸馏水冲洗2 4次后用质量浓度为0. 05 0. 15 %的HgCl2溶液进行消毒8 12min，消毒完后用无菌蒸馏水冲洗3 5次。
通过本发明方法获得的矮牵牛再生植株，连同步骤D)所用的培养容器(例如培养瓶)以及培养容器内原装有的生根培养基一起从培养室内取出后放入温室内进行炼苗， 此时先不打开培养容器的盖子，2 3天后打开盖子(即敞开瓶口)，并加入少量水(加水的量一般控制在生根培养基上有一层水即可)炼苗2 3天后进行移栽，温室内的环境为 25士2°C，自然光照。
在本发明中，所用到的培养容器、培养基(为配制完成后的诱导愈伤组织培养基、 分化培养基和生根培养基)、蒸馏水以及花蕾消毒灭菌用装置要在使用前进行灭菌，灭菌条件在1. 1个大气压、121°c条件下灭菌20分钟。
本发明对矮牵牛的花药进行离体培养，花药内小孢子发育为单倍体植株，单倍体植株经染色体加倍，只需一个世代就可获得遗传上稳定的纯系，与常规自交方法获得遗传稳定纯系需6-7代时间相比，采用花药培养获得单倍体而获得纯系是有效加速育种材料的纯化与育种进程的一条途径，可以极大地缩短杂交育种年限，提高育种效率。
本发明中经花药培养获得再生植株实为矮牵牛单倍体和双倍体(或多倍体)的混合植株。诸多研究表明植物花药培养的后代是不同倍植株的混合体(花药培养成的单倍体植株多经自然加倍成二倍体或多倍体)，我们在研究中发现获得的再生植株有一些生长正常，形态表现为茎杆较粗、叶片较大(图1A)，而有一些植株生长徒长，形态表现为茎杆很细、叶片较小(图1B)。对两种类型的植株进行根尖细胞染色体镜检分析表明A植株的染色体数为7条，而B植株为2n = 2X = 14条染色体。同时通过流式细胞仪分别对花药培养原植株和花药培养获得再生植株的细胞DNA含量分析也表明矮牵牛花药培养获得的再生植株为单倍体和双倍体(或多倍体)的混合体。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
图1是本发明所获得的矮牵牛不同倍性的植株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1、一种通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法，依次进行以下步骤
Α)低温预处理和消毒，依次进行以下步骤
1)、所选用的矮牵牛材料为梅林系列红色，于12月份播种育苗，次年4月下旬开始，在晴天的上午，选取纵径长度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾(此时期的花蕾多处于单核靠边期)，
2)、将上述花蕾装入塑料袋中，放入5°C冰箱中低温预处理2天；
3)、将上述低温预处理后的花蕾先放在自来水下冲洗5min，再用蒸馏水冲洗3次后用吸水纸吸干水分；然后放在超净工作台上，用体积浓度为75%的酒精灭菌Imin ；接着用无菌蒸馏水冲洗3次后用质量浓度为0. 1 %的HgCl2溶液进行消毒lOmin，消毒完后用无菌蒸馏水冲洗4次。
B)、在超净工作台上，将步骤A)所得的花蕾用镊子剥去花萼和花瓣，取出花药，将花药去净花丝后接种在诱导愈伤组织培养基上培养；培养室温度为25士 1°C，培养条件为暗培养；每15天更换一次新鲜的诱导愈伤组织培养基，待愈伤组织(即初代愈伤组织)形成后，及时将愈伤组织转接到新鲜的诱导愈伤组织培养基上进行继代培养；继代培养2次， 继代培养条件同上，此时可形成比较多的淡绿色、质地较硬的愈伤组织。
所用的诱导愈伤组织培养基为=Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖 +0. 5mg/L 6-BA+O. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 为 5.8。
上述初代愈伤组织的诱导培养一般需20 30天，继代培养每次需要30天左右。
C)、将步骤B)继代培养所得的愈伤组织转接到分化培养基上进行不定芽的分化；培养室温度25士 1°C，光照培养，光照强度为180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照时间为 14h (5:00-19:00，其余时间为暗培养)；当所得的不定芽达到3 5cm时，停止分化培养；
上述分化培养的时间一般需要4 6周；
上述分化培养基为=Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0. lmg/L IBA+1. Omg/L TDZ+ 水解酪蛋白 0. 5g/L，pH 值为 5. 8。
D)、再生苗的生根培养
将步骤C)所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养，直至小苗上长出至少3条且长度彡2cm的不定根(需要20天左右)；得可出瓶种植的种苗，该可出瓶种植的种苗即为再生植株；培养条件25士小时需光培养，光照强度为200 250mol m_2 · s—1 ；
生根培养基为=Nitsch基本培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值为 5. 8。
上述步骤A) D)均在无菌环境中进行。
该例愈伤组织诱导率可达40 %，愈伤组织分化率可达45 %。
注诱导率=(形成愈伤组织的花药数/接种的花药总数)X 100%。
分化率=(分化出芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织总数)X 100%。
将上述实施例1所得的再生植株(即可出瓶种植的种苗)连同培养瓶(包括培养瓶内的生根培养基)从培养室内取出放在温室内进行炼苗，此时不打开瓶盖，2-3天后敞开瓶口，并加入少量水(加水的量一般控制在生根培养基上有一层水即可)炼苗2-3天后进行移栽，温室内的环境为25士2°C，自然光照。
在温室内对矮牵牛再生苗进行移栽，移栽时洗去根部的培养基，将苗移栽到营养钵中(土质为营养土和珍珠岩重量比例为8 1)。待小苗长到5cm以上高度(一般需要 20 30天)时，带基质移栽至6 X IOcm的塑料花盆中，并放于单体棚中，单体棚的环境为 自然光照，温度25-30°C。移栽后要适当遮荫并定时浇水，成活率可达70%以上。注成活率指的是培养瓶中的小苗移到花盆中，在田间种植最后的成活率。
实施例2、一种通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法，依次进行以下步骤
A)、低温预处理和消毒，依次进行以下步骤
1)、所选用的矮牵牛材料为梅林系列蓝色，于12月份播种育苗，次年4月下旬开始，在晴天的上午，选取纵径长度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾(此时期的花蕾多处于单核靠边期)，
2)、将上述花蕾装入塑料袋中，放入5°C冰箱中低温预处理3天；
3)、将上述低温预处理后的花蕾先放在自来水下冲洗5min，再用蒸馏水冲洗3次后用吸水纸吸干水分；然后放在超净工作台上，用体积浓度为75%的酒精灭菌Imin ；接着用无菌蒸馏水冲洗3次后用质量浓度为0. 1 %的HgCl2溶液进行消毒lOmin，消毒完后用无菌蒸馏水冲洗4次。
B)、在超净工作台上，将步骤A)所得的花蕾用镊子剥去花萼和花瓣，取出花药，将花药去净花丝后接种在诱导愈伤组织培养基上培养；培养室温度为25士 1°C，培养条件为暗培养；每15天更换一次新鲜的诱导愈伤组织培养基，待愈伤组织(即初代愈伤组织)形成后，及时将愈伤组织转接到新鲜的诱导愈伤组织培养基上进行继代培养；继代培养2次， 继代培养条件同上，此时可形成比较多的淡绿色、质地较硬的愈伤组织。
所用的诱导愈伤组织培养基为=Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖 +1. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 为 5.8。
上述初代愈伤组织的诱导培养一般需20 30天，继代培养每次需要30天左右。
C)、将步骤B)继代培养所得的愈伤组织转接到分化培养基上进行不定芽的分化；培养室温度25士 1°C，光照培养，光照强度为180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照时间为 14h (5:00-19:00，其余时间为暗培养)；当所得的不定芽达到3 5cm时，停止分化培养；
上述分化培养的时间一般需要4 6周；
上述分化培养基为=Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0.5mg/L IBA+1. Omg/L 6-BA+ 水解酪蛋白 0. 5g/L，pH 值为 5. 8。
D)、再生苗的生根培养
将步骤C)所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养，直至小苗上长出至少3条且长度彡2cm的不定根(需要20天左右)；得可出瓶种植的种苗，该可出瓶种植的种苗即为再生植株；培养条件25士小时需光培养，光照强度为220 MOmol m_2 · s—1 ；
生根培养基为=Nitsch基本培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值为 5. 8。
上述步骤A) D)均在无菌环境中进行。
该例愈伤组织诱导率可达35 %，愈伤组织分化率可达30 %。
将上述实施例2所得的再生植株(即可出瓶种植的种苗)连同培养瓶(包括培养瓶内的生根培养基)从培养室内取出放在温室内进行炼苗，此时不打开瓶盖，2-3天后敞开瓶口，并加入少量水(加水的量一般控制在生根培养基上有一层水即可)炼苗2-3天后进行移栽，温室内的环境为25士2°C，自然光照。
在温室内对矮牵牛再生苗进行移栽，移栽时洗去根部的培养基，将苗移栽到营养钵中(土质为营养土和珍珠岩重量比例为8 1)。待小苗长到5cm以上高度(一般需要 20 30天)时，带基质移栽至6 X IOcm的塑料花盆中，并放于单体棚中，单体棚的环境为 自然光照，温度25-30°C。移栽后要适当遮荫并定时浇水，成活率可达70%以上。
实施例3、将实施例1步骤C中的分化培养基改成=Nitsch基本培养基+7g/L琼脂 +20g/L麦芽糖+0. lmg/L IBA+1. Omg/L 6-BA+水解酪蛋白 0. 5g/L，pH值为 5. 8。即将 1. Omg/ LTDZ改成了 1. Omg/L 6-BA。其余同实施例1。
所得结果为
该例愈伤组织诱导率可达40%，愈伤组织分化率可达33%。成活率可达70%以上。
对比例1、将实施例1中的选取纵径长度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾改成选取径长度在 1. 4cm-1. 6cm的花蕾；其余同实施例1。
所得结果为不能获得花药愈伤组织。
对比例2、将实施例1中的选取纵径长度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾改成选取径长度在0. 5cm-0. 7cm的花蕾；其余同实施例1。
所得结果为不能获得花药愈伤组织。
对比例3、将实施例1步骤A)中的放入5°C冰箱中进行低温预处理2天改成放入 8°C冰箱中进行低温预处理2天；其余同实施例1。
所得结果为
该例愈伤组织诱导率可达35%，愈伤组织分化率可达40%。
对比例4、将实施例1步骤A中的放入5°C冰箱中进行低温预处理2天改成放入 2°C冰箱中进行低温预处理2天；其余同实施例1。
所得结果为
该例愈伤组织诱导率可达18 %，愈伤组织分化率可达30 %。
对比例5、将实施例1步骤C)分化培养基中的麦芽糖改成蔗糖(浓度不变)；其余同实施例1。
所得结果为
该例愈伤组织诱导率可达40 %，愈伤组织分化率可达15 %。
对比例6、将实施例1步骤B)的诱导愈伤培养基中的6-BA改成IBA (浓度不变)； 其余同实施例1。
所得结果为不能获得花药愈伤组织。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法，其特征是依次包括以下步骤A)、低温预处理和消毒选取矮牵牛花蕾，并于3 7°C中进行低温预处理2 4天；低温预处理后进行消毒处理；B)、将步骤A)所得的花蕾用镊子剥去花萼和花瓣，取出花药，将花药去净花丝后接种在诱导愈伤组织培养基上；培养温度为25士 1°C，培养条件为暗培养；每13 17天更换一次新鲜的诱导愈伤组织培养基，待愈伤组织形成后将愈伤组织转接到新鲜的诱导愈伤组织培养基上进行继代培养；继代培养至少2次；C)、将步骤B)继代培养所得的愈伤组织转接到分化培养基上进行不定芽的分化；培养室温度25士 1°C，光照培养，光照强度为180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照时间为13 15h ； 当所得的不定芽达到3 5cm时，停止分化培养；D)、再生苗的生根培养将步骤C)所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养，直至小苗上长出至少3条且长度> 2cm的不定根；得可出瓶种植的种苗，所述可出瓶种植的种苗为再生植株；培养条件25 士 1°C，需光培养，光照强度为200 300mol πΓ2 · s—1 ；上述步骤Α) D)均在无菌环境中进行。
2.根据权利要求1所述的通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法，其特征是所述诱导愈伤组织培养基为=Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0. 5 2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 为 5·8 ；所述分化培养基为=Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0. 1 0. 5mg/ LIBA+1. 0 2. Omg/L 6-BA+水解酪蛋白0. 5g/L，pH为5. 8 ；或者为=Nitsch基本培养基 +7g/L 琼脂 +20g/L 麦芽糖 +0. 1 0. 5mg/L IBA+1. 0 2. Omg/L TDZ+ 水解酪蛋白 0. 5g/L， PH 为 5. 8 ；所述生根培养基为=Nitsch基本培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值为 5. 8。
3.根据权利要求2所述的通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法，其特征是所述步骤A)中低温预处理和消毒为依次进行以下步骤1)、在晴天的上午，选取纵径长度在0.8cm 1. 3cm的花蕾；2)、将上述花蕾装入塑料袋中，放入3 7°C冰箱中低温预处理2 4天；3)、将上述低温预处理后的花蕾先放在自来水下冲洗，再用蒸馏水冲洗2 4次后用吸水纸吸干水分；然后放在超净工作台上，用体积浓度为70 80%的酒精灭菌0. 5 1. 5min ；接着用无菌蒸馏水冲洗2 4次后用质量浓度为0. 05 0. 15 %的HgCl2溶液进行消毒8 12min，消毒完后用无菌蒸馏水冲洗3 5次。
全文摘要
本发明公开了一种通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法，依次包括以下步骤A)、矮牵牛花蕾低温预处理和消毒；B)、将步骤A)所得的花蕾用镊子剥去花萼和花瓣，取出花药，将花药去净花丝后接种在诱导愈伤组织培养基上；C)、将步骤B)继代培养所得的愈伤组织转接到分化培养基上进行不定芽的分化；当所得的不定芽达到3～5cm时，停止分化培养；D)、将步骤C)所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养，直至小苗上长出至少3条且长度≥2cm的不定根；得可出瓶种植的种苗；上述步骤A)～D)均在无菌环境中进行。
文档编号A01H4/00GK102499091SQ201110351730
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者傅巧娟, 刘辉, 沈国正, 沈莲佳, 陈一 申请人:杭州市农业科学研究院