专利名称：：一种通过花药培养获得马蹄莲单培体植株的方法
技术领域：
：本发明涉及一种通过花药培养获得马蹄莲(Z朋tec/esc/w'aaeC/^'o戸'ca)单培体植株的方法，属花卉育种
技术领域：
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背景技术：
：马g帝莲(Zs/tec/e5T力iaaet力io;ics)为天南星禾斗(Arscese)马1S帝莲属(Z3/teotesc//s)多年生球根花卉，是优良的鲜切花和盆栽花卉；马蹄莲的传统品种开白花，但目前市场上该种中也有开其它艳丽色彩花的品种，高洁皓白或色彩艳丽、形态高雅的马蹄莲在花卉市场上占有重要的地位。现有技术中，采用系谱法获得马蹄莲遗传稳定纯系，该方法获得马蹄莲遗传稳定纯系需6-7代(15-20年)。该方法不仅时间长，而且成本高。马蹄莲单培体植株在遗传育种研究中具有重要应用价值，单培体植株经染色体加倍，只需要一个世代(2-3年)就获得遗传上稳定的纯系，为F1杂交一代新品种培育提供亲本材料，以及为园艺性状遗传规律研究提供纯系，与常规系谱法获得遗传稳定纯系需6-7代(15-20年)时间相比，通过产生单培体植株而获得纯系是加速育种材料的纯化与育种进程的一条途径。另一方面，马蹄莲单培体植株是基因工程中遗传转化的理想受体材料，也是无性系突变体筛选的理想材料，目的基因转化的单倍体，以及产生突变的单倍体，经染色体加倍后，基因型得以纯合，避免了后代群体中目的基因或突变基因的分离。由于基因重组，马蹄莲杂交品种的小孢子群体中出现不同基因型个体，因此对花药内小孢子进行再生培养，是获得不同与母体品种的新种质的一条有效途径。经文献检索，未见与本发明技术内容相同的公开报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种获得马蹄莲单培体植株的方法，即通过对马蹄莲花药进行离体培养，花药内小孢子发育为单培体植株。本发明方法的具体步骤如下a.供体马蹄莲材料的适宜生长季节为秋、冬季节，适宜生长温度为最高气温25'C，最低气温l(TC;b.进行离体培养的花药及小孢子的合适发育时期花蕾微露出叶柄、花药颜色呈乳白色、小孢子处在单核靠边期；C.外植体消毒取小孢子处在单核靠边期的马蹄莲花蕾，剥去苞片，在超净工作台中，用1%次氯酸钠+0.05%Tween-20消毒花蕊，时间为10分钟，然后用无菌水冲洗3次，冲洗时间分别为l分钟，5分钟，IO分钟；d.愈伤组织的诱导用解剖刀将经上述消毒的花药从花蕊上刮下，接种在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基配方为GamborgB5+蔗糖80g/L+KT1.0mg/L+2,4-D0.5mg/L+琼脂7g/L，培养基用母液配置，用1mol/LNaOH调pH到5.8，121。C15分钟高压灭菌，其中激素是过滤灭菌，在培养基分装前加入，高压灭菌后的培养基冷却到40。C时在超净工作台内快速分装在己高压灭菌的60x15mm的培养皿中，每皿装10mL愈伤组织诱导培养基，接种密度为60-70个花药/培养皿，培养条件为32。C、暗培养2天后，转入25。C、暗培养50天，再将其转至上述愈伤组织诱导培养基，在25'C、黑暗条件下，进行继代培养20天，花药长出愈伤组织；e.愈伤组织分化芽:将上述继代培养20天后的愈伤组织置于芽诱导培养基，诱导生芽，芽诱导培养基配方为MS十蔗糖30g/L+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7g/L，pH5.8，培养条件温度25。C，光强2000Lx，光照时间16小时，培养30天后愈伤组织分化出芽。f.芽生根芽长到高4cm时，将芽置于生根培养基诱导生根，生根培养基配方为MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L+琼脂7g/L，pH到5.8，在温度25。C'光强2000Lx，光照时间16小时的培养条件培养20天，小苗生根，形成马蹄莲单倍体植株。本发明对马蹄莲花药进行离体培养，花药内小孢子发育为单培体植株，单培体植株经染色体加倍，只需要一个世代(2-3年)就获得遗传上稳定的纯系，与常规系谱法获得遗传稳定纯系需6-7代(15-20年)时间相比，通过产生单培体植株而获得纯系是有效加速育种材料的纯化与育种进程的一条途径。具体实施例方式1、供体马蹄莲材料的合适生长条件。供体马蹄莲材料的适宜生长季节为秋、冬季节，适宜生长温度为最高气温25'C，最低气温1(TC。如昆明地区露地栽培马蹄莲的合适季节为秋季(9月-ll月)。2、离体培养的花药及小孢子的合适发育时期。花蕾、花药与小孢子的发育期存在着相关性，合适的发育期是影响花药培养效果，以及能否成功获得马蹄莲单培体植株的重要因素。小孢子处在单核靠边期是马蹄莲花药培养的最佳时期，此时，花蕾的尖端微露出叶柄，花序苞片呈嫩黄色，花药呈乳白色，对该发育期的花药进行培养能获得马蹄莲单培体植株(表1)。表1离体培养的花药及小孢子的合适发育时期<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>取小孢子处在单核靠边期的马蹄莲花蕾，剥去苞片，在超净工作台中，用1%次氯酸钠+0.05%Tween-20消毒花蕊，时间为10分钟，然后用无菌水冲洗3次，冲洗时间分别为1分钟，5分钟，IO分钟，利用该消毒方法的花药培养，平均2.4%的花药长出愈伤组织;而利用O.1%升汞进行消毒，不能诱导愈伤组织(表2)。表2:1%次氯酸钠与0.1%升汞消毒的花药培养愈伤组织诱导率比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注愈伤组织诱导率^产生愈伤组织的花药数/接种的花药数X100%4、愈伤组织的诱导用解剖刀将经1%次氯酸钠+0.05%Tween-20消毒的花药从花蕊上刮下，接种在愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为B5+蔗糖80g/L+KT1.0mg/L+2,4-D0.5mg/L+琼脂7g/L。培养基用母液配置，用1mol/LNaOH调pH到5.8，121'C15分钟高压灭菌，其中激素是过滤灭菌，在培养基分装前加入。高压灭菌后的培养基冷却到40'C左右时在超净工作台内快速分装在己高压灭菌的60x15咖的培养皿中，每皿装10mL愈伤组织诱导培养基。接种密度为60-70个花药/培养皿。培养条件，32°C、暗培养2天后，转入25t:、暗培养50天，再将其转至上述愈伤组织诱导培养基，在25°C，黑暗条件下，进行继代培养20天，平均2.4%的花药长出愈伤组织(见表3)。表3:花药培养的愈伤组织诱导率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注花药接种在愈伤组织诱导培养基中，培养70天时统计愈伤组织诱导率(产生愈伤组织的花药数/接种的花药数x100%)5、愈伤组织分化芽将上述继代培养20天后的愈伤组织置于芽诱导培养基，诱导生芽，芽诱导培养基配方为MS+蔗糖30g/L+BA1.0mg/L+NAAO.lmg/L+琼脂7g/L，pH5.8，培养条件温度25'C，光强2000Lx，光照时间16小时，培养30天后愈伤组织分化出芽，平均每个愈伤组织分化出6.8个芽(表4)。表4:愈伤组织分化芽情况<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注愈伤组织接种在芽诱导培养基中，培养30天时统计每个愈伤组织产生的芽数目。6、芽生根芽长到高4cm时，将芽置于生根培养基诱导生根，生根培养基配方为MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L+琼脂7g/L，pH5.8，在温度25。C，光强2000Lx，光照时间16小时的培养条件培养20天，平均每株小苗生根ll条(表5)，形成马蹄莲植株，其中单倍体植株的比率为69.6%。表5:小苗生根情况<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注小苗在生根培养基培养20天时统计每株生根数。7、植株染色体数目鉴定对获得的上述植株进行染色体数目鉴定，方法步骤如下(1)取材上午9:00—10:00取马蹄莲花药培养获得的植株的根尖。(2)预处理根尖浸入0.002mol/L8—羟基喹啉处理3小时，并用蒸馏水冲洗。(3)固定卡诺氏剂(无水乙醇冰醋酸=3:1)固定20小时。(4)酸解1mol/L盐酸，酸解30分钟。(5)软化45%的冰醋酸软化10分钟。(6)染色改良苯酚品红染色20分钟。(7)镜检取1-2咖的根尖，放在载玻片上，盖上盖玻片，用铅笔的橡皮头敲打，使细胞分散，在显微镜(10x40)下观察，计数染色体数目。马蹄莲单倍体植株的染色体数目为16，二倍体植株的染色体数目为32，经镜检，花药培养获得的植株中，单倍体植株的比率为69.6%，见表6。表6:单倍体植株的比率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实际应用表明本发明的方法可在多次不同重复试验中获得单倍体植株、可靠性强。与常规系谱法获得遗传稳定的马蹄莲纯系需6-7代(15-20年)时间相比，通过产生单培体植株获得纯系是有效加速育种材料的纯化与育种进程的一条途径。权利要求1、一种通过花药培养获得马蹄莲单培体植株的方法，包括外植体消毒、愈伤组织的诱导、愈伤组织分化芽及芽生根步骤；其特征在于a.愈伤组织的诱导用解剖刀将经消毒的花药从花蕊上刮下，接种在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基配方为GamborgB5+蔗糖80g/L+KT1.0mg/L+2，4-D0.5mg/L+琼脂7g/L，花药接种密度为60-70个花药/60x15mm培养皿，培养条件为32℃、暗培养2天后，转入25℃、暗培养50天，再将其转至上述愈伤组织诱导培养基，在25℃、黑暗条件下，进行继代培养20天，花药长出愈伤组织；b.愈伤组织分化芽将上述继代培养20天后的愈伤组织置于芽诱导培养基，诱导生芽，芽诱导培养基配方为MS+蔗糖30g/L+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7g/L，pH5.8，在温度25℃，光强2000Lx，光照时间16小时培养条件下，培养30天后愈伤组织分化出芽，芽经生根后形成马蹄莲单倍体植株。全文摘要本发明涉及一种通过花药培养获得马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)单培体植株的方法，属花卉育种
技术领域：
。本方法步骤为取蕾期马蹄莲幼小花蕾、消毒；取花药置于愈伤组织诱导培养基上培养、诱导小孢子形成愈伤组织；将愈伤组织置于芽诱导培养基上培养，诱导愈伤组织形成芽；将芽置于生根培养基上培养，诱导芽生根，获得马蹄莲单培体植株。应用该方法对马蹄莲花药进行离体培养，其平均2.4％的花药长出愈伤组织，平均每个愈伤组织能分化出6.8个芽，单倍体植株的比率为69.6％。本方法获得的马蹄莲单培体植株经染色体加倍，只需要一个世代就获得遗传上稳定的纯系，通过产生单培体植株而获得纯系是有效加速育种材料的纯化与育种进程的一条途径。文档编号C12N5/04GK101385442SQ20081005898公开日2009年3月18日申请日期2008年9月27日优先权日2008年9月27日发明者张乐民,王世敏,郑思乡申请人:云南大学