一种通过花药培养获得甜叶菊再生植株的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通过花药培养获得甜叶菊再生植株的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)又名“甜菊”、“甜草”，菊科甜叶菊属，原产南美洲巴拉圭的Amambay及Mbaxacayu山脉。甜叶菊糖苷有控制血糖、降低血压、促进新陈代谢的作用，对治疗糖尿病，肥胖症、调节胃酸、恢复神经疲劳之功效。甜叶菊是理想的甜味剂，其叶片富含甜叶菊糖苷，因其甜度高(甜度是蔗糖的350-400倍)、热量低(热量约为蔗糖的1/300)、安全无毒等特点。在国际上被誉为“世界第三健康糖源”。我国卫生部于1985年和1990年分别批准了甜叶菊糖苷为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料。甜菊糖苷易溶于水，被誉为最有发展前途的新糖原，是继蔗糖、甜菜糖的第3种天然糖原，因而日益引起人们的关注和重视。因此，甜叶菊逐渐成为食品和医药领域研究、开发的热点。
[0003]甜叶菊是菊科多年生草本植物，也是异花授粉植物，其抗逆性强，病虫害少，适应性广。花为4、5朵筒状小花组成的头状花序，排列在叶腋和枝端抽出的花枝上成伞房状，筒状小花先端6裂，白色，基部呈紫红色或白色，柱头二裂，花药在柱头下方。由于其长期进行异花授粉导致其群体的基因型多是杂合型，遗传并不稳定，用种子繁殖，后代难以保持亲本原有的优良性状，且由于甜叶菊种子极小，发芽率低，极易丧失活力，故不利于种子繁殖，对于杂交种的纯合及优良的防杂保存不利，甜菊的无性系繁殖，一般都采用传统的分株和扦插等方法，繁殖系数低，速度慢，不足以满足大量繁殖优良无性系或优良单株的需要。因此，近年来甜叶菊的植物组织培养快速繁殖技术成了甜叶菊工厂化育苗的主要途径。目前，人们对于甜叶菊的无菌繁殖体系、培养基和培养条件的选择、愈伤组织的诱导与分化、芽分化和继代增殖培养、茎尖培养、生根培养以及组培苗的移栽等方面都作了较为全面、系统的研究，但是关于甜叶菊花药离体培养相关研究却未见报道。利用本发明建立甜叶菊花药培养技术体系，从而优化甜叶菊植物组织培养植株再生体系，旨在为甜叶菊新品种的选育奠定一定的物质研究基础，可以缩短甜叶菊育种周期，为甜叶菊花培育种创造出新的种质资源。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种通过花药培养获得甜叶菊再生植株的方法。
[0005]本发明提供的一种通过花药培养获得甜叶菊再生植株的方法，所述的培养方法包括以下步骤:(I)花蕾采集；(2)花蕾低温预处理与消毒；(3)愈伤组织诱导培养；(4)愈伤组织分化培养；(5)不定芽生根培养；(6)再生植株炼苗与移栽。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现，所述的培养方法包括以下步骤:
Cl)花蕾采集
甜叶菊花期采集花粉发育时期为单核靠边的花蕾；取材当日早晨8~10点摘取直径约2~3mm、无病虫害、闭合的、花药饱满的花蕾置于冰盒中带回实验室；通过镜检确定此时的花粉发育处于单核靠边期； (2)花蕾低温预处理与消毒；
①采集到的花蕾进行温度预处理；将花药装入自封袋后置于4°C冰箱中，进行3d的预处理；
②洗洁精水清洗干净表面污垢后，蒸馏水冲洗3~4次，超净工作台上75%体积百分比的酒精浸泡20~30s，无菌水冲洗2~3次，再用加有1~2滴吐温0.1% HgCl2处理6~8min，无菌水中冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干多余水分后备用。
[0007]( 3 )愈伤组织诱导培养；
①诱导愈伤组织培养基:B5+6-BAl~l.5 mg/L+ NAA 0.2-0.5 mg/L+5.5g/L 琼脂 +6 %蔗糖；
②接种:在超净工作台上，将上述处理好的花蕾在超净台下用解剖针剥出花药，将花药接种于愈伤组织诱导培养基上，每个组培瓶接种4~6枚花药，
③培养:接种后置培养室暗培养10d后光培养，培养室温度(25±1) °C，光源为28WT5灯，光照强度1000~15001x，光照时间12 h/d，相对湿度60%左右，25d左右产生愈伤组织；
(4)愈伤组织分化培养
①愈伤组织培分化培养基:MS+BA0.5~lmg/L+ NAA 0.1-0.2 mg/L+5.5 g/L 琼脂 +6%蔗糖；
②愈伤组织逐渐膨大至直径约05cm时，并有绿色芽点出现时转入分化培养基培养形成丛芽
③培养:，培养室温度(25±1)°C，光照强度20001x，光照时间12 h/d，相对湿度60%
左右;
(5)不定芽伸长与生根培养
①不定芽伸长培养基:MS+5.5g/L琼脂+3%蔗糖；
②当不定芽长至3~4cm时接入生根培养基培养；
③生根培养基:MS+NAA 0.1 mg/L+5.5g/L琼脂+2%蔗糖;
③培养室温度(25±1)°C，光照强度2000 lx，光照时间12 h/d，相对湿度60%左右；
(6)再生植株炼苗与移栽
①炼苗:当苗基部长出根，长度达1~2cm时，环境温度25°C，湿度控制在85%，光照强度 2000 lx，炼苗 2~3 d ；
②移栽与管理:经炼苗后的试管苗洗净根部琼脂移栽到穴盘中，期间温度控制在25°C，湿度控制在85%左右，当苗长至10~15cm左右时可移栽大田。
[0008]上述各培养基pH值均为5.8-6.0，IL上述各培养基中加琼脂5.5g/L。
[0009]本发明的优点:利用本发明建立甜叶菊花药培养技术体系，从而优化甜叶菊植物组织培养植株再生体系，可以缩短甜叶菊育种周期，为甜叶菊新品种的选育及种质资源创新奠定研究基础。
【附图说明】
[0010]图A为甜叶菊花药诱导愈伤组织分化出不定芽；
图B为不定芽伸长与增殖； 图C为不定芽生根获得再生植株；
图D为再生植株穴盘移栽。
【具体实施方式】
[0011]实施例1
(O花蕾采集
甜叶菊花期采集花粉发育时期为单核靠边的花蕾；取材当日早晨8~10点摘取直径约2~3mm、无病虫害、闭合的、花药饱满的花蕾置于冰盒中带回实验室；通过镜检确定此时的花粉发育处于单核靠边期；
(2)花蕾低温预处理与消毒；
①采集到的花蕾进行温度预处理；将花药装入自封袋后置于4°C冰箱中，进行3d的预处理；
②洗洁精水清洗干净表面污垢后，蒸馏水冲洗3~4次，超净工作台上75%体积百分比的酒精浸泡20~30s，无菌水冲洗2~3次，再用加有1~2滴吐温0.1% HgCl2处理6~8min，无菌水中冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干多余水分后备用。
[0012](3)愈伤组织诱导培养；
①诱导愈伤组织培养基:B5+6-BA1-1.5 mg/L+ NAA 0.2-0.5 mg/L+5.5g/L 琼脂+6%蔗糖；
②接种:在超净工作台上，将上述处理好的花蕾在超净台下用解剖针剥出花药，将花药接种于愈伤组织诱导培养基上，每个组培瓶中接种4~6枚花药，
③培养:接种后置培养室暗培养7(1后光培养，培养室温度(25±1)°(:，光源为28￥ T5灯，光照强度1000~1500 lx，光照时间12 h/d，相对湿度60 %左右，30~35 d左右产生愈伤组织，如图A所示；
(4)愈伤组织分化培养
①愈伤组织培分化培养基:MS+BA0.5~1 mg/L+ NAA 0.1-0.2 mg/L+5.5g/L 琼脂+3 %蔗糖；
②愈伤组织逐渐膨大至直径约05~0.6cm时，并有绿色芽点出现时转入分化培养基培养形成丛芽，
③培养:培养室温度(25±I) °C，光照强度约2000 lx，光照时间12 h/d，相对湿度60%左右；
(5)不定芽伸长与生根培养
①不定芽伸长培养基:MS+5.5g/L琼脂+3%蔗糖；
②当不定芽长至3~4cm时接入生根培养基培养；不定芽伸长如图B所示；
③生根培养基:MS+NAA 0.1 mg/L+5.5g/L琼脂+2%蔗糖;
④培养室温度(25±1)°C，光照强度约2000 lx，光照时间12 h/d，相对湿度60%左右，培养20~25 d的花药再生苗如图C所示；
(6)再生植株炼苗与移栽
①炼苗:不定芽接入生根培养基10-15 d左右，植株根长度达1~2 cm时，环境温度25°C，湿度控制在85 %，光照强度约1500 lx，炼苗2~3d; ②移栽与管理:经炼苗后的试管苗洗净根部琼脂移栽到穴盘中，在穴盘基质中用手扒出小凹穴，将苗的根部放入凹穴中，用基质轻轻将根部盖上，适当压实。少量喷雾状水，使基质表面湿润，盖上塑料薄膜保持湿度。期间温度控制在25~28°C，湿度控制在85%左右，移栽成活率达90%，当苗长至10~15 cm左右时移栽至花盆，图D为移栽至穴盘中20 d的花药再生植株。
【主权项】
1.一种通过花药培养获得甜叶菊再生植株的方法，其特征在于:所述的培养方法包括以下技术环节:(I)花蕾采集；(2)花蕾低温预处理与消毒；(3)愈伤组织诱导培养；(4)愈伤组织分化培养；(5)不定芽生根培养；(6)再生植株的秧苗锻炼与移栽。2.根据权利要求1所述的甜叶菊花药培养方法，其特征在于，所述的培养方法具体包括以下步骤: (O花蕾采集:采集花粉发育时期为单核靠边的花蕾； (2)花蕾低温预处理与消毒，包括: ①对采集的花蕾进行低温预处理； ②用洗洁精水清洗干净花蕾表面的污垢后，再用蒸馏水冲洗3~4次，置于超净工作台上，用75%的酒精浸泡20~30s，无菌水冲洗2~3次，再用0.1% HgCl2处理6~8min，无菌水冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干多余水分后备用； (3)愈伤组织诱导培养，包括: ①诱导愈伤组织的培养基为B5+6-BAl~l.5mg/L+ NAA 0.2-0.5mg/L+5.5g/L琼脂+6%蔗糖； ②将上述处理好的花蕾在超净台下用解剖针剥出花药，将花药接种于愈伤组织诱导培养基上，每瓶接种4~6枚花药； ③接种后黑暗条件下培养1d后再进行光培养，培养温度(25±1)°C，光照强度1000-1500LX，光照时间12 h/d，相对湿度60%左右； (4)愈伤组织分化培养，包括: ①愈伤组织分化培养基为MS+BA0.5~lmg/L+ ΝΑΑ0.1-0.2 mg/L+5.5g/L琼脂+6%蔗糖； ②愈伤组织直径约0.5cm，并有出现绿色生长点时转入分化培养基培养形成丛芽； ③培养温度(25±1)°C，光照强度2000Lx，光照时间12 h/d，相对湿度60%左右； (5)不定芽生根培养，包括: ①生根培养基为MS+ΝΑΑ0.1 mg/L+2%蔗糖，当不定芽长至3~4cm时接入生根培养基培养； ②培养温度(25±1)°C，光照强度2000Lx，光照时间12 h/d，相对湿度60%左右； (6)再生植株的秧苗锻炼与移栽，包括: ①当幼苗生根，苗高l~2cm时打开瓶盖添加10-20mL无菌水，环境温度25°C，相对湿度85%左右，光照强度2000Lx，炼苗2~3天； ②锻炼后的试管苗洗净根部琼脂移栽到穴盘中，期间温度控制在25°C，湿度控制在85%左右，当苗长至10~15cm左右时即可移栽大田。
【专利摘要】本发明涉及一种通过花药培养获得甜叶菊再生植株的方法，属于生物技术领域。以甜叶菊的花药为材料，其主要过程有：花蕾采集、低温预处理与消毒、愈伤组织诱导培养、愈伤组织分化培养、不定芽生根培养、再生植株炼苗与移栽。利用本发明建立甜叶菊花药培养技术体系，从而优化甜叶菊植物组织培养植株再生体系，旨在为甜叶菊新品种的选育奠定一定的物质研究基础，可以缩短甜叶菊育种周期，为甜叶菊花培育种创造出新的种质资源。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105104207
【申请号】CN201510603674
【发明人】周玉丽, 舒英杰, 胡能兵, 何克勤, 张雪平, 崔广荣
【申请人】安徽科技学院
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月22日