西洋参发状根诱导及植株再生研究方法
【专利摘要】本发明涉及一种西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，属于作物生物【技术领域】。该方法包括以下步骤：(1)外植体处理；(2)菌种保存、活化及培养；(3)西洋参发状根诱导条件的优化；(4)西洋参发状根的获得与鉴定；(5)西洋参发状根液体培养生长量与总皂苷含量的测定：(6)西洋参发状根再生体系的建立及条件优化。本发明以西洋参的发状根为材料通过胚状体发生途径诱导再生植株，为西洋参的育种开辟了一个新方向。采用Ri质粒可以更简单、方便地将外源基因导入；另外由发状根获得的再生植株本身即为转基因植株，使转基因植株具有很容易生根的特点，可以较好地解决植株再生面临的根的分化难，或者生长能力弱和形成的根数量少难题。
【专利说明】西洋参发状根诱导及植株再生研究方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，属于作物生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]西洋参(Panaxquinque folium L.) American Ginseng,是我国传统名贵药材，它属于五加科人参属多年生草本植物，又称为美国参、花旗参、洋参、广东参等名字，它最早是产于北美的原始森林，现在主产于法国、加拿大及美国，生长的最佳环境是在海拔2000公尺左右的丘陵地 带，并且属于海洋性气候，大概分布于北纬30°~47°、西经67°~125°的大森林中。从20世纪80年代起我国就成功地大面积引种西洋参，经过几十年的努力，我国已经发展成为继美国、加拿大之后的世界第三大西洋参生产的国家和世界最大的消费国家。
[0003]西洋参不论是地下还是及地上部分都含有多种生理活性成分，其中包括西洋参皂甙，它主要是三萜类化合物，与人参皂甙结构基本相似。其它成分还包括黄酮类、挥发油、蛋白质、、肽类、氨基酸、淄醇类、维生素、多糖、微量元素、核酸等。西洋参中最主要的有效成分是西洋参皂甙，它也是西洋参中生理活性最显著的物质，为此人们对西洋参皂苷进行了大量的研究，先后从中分离出20多种单体皂苷。近十几年来许多学者开始关注西洋参多糖的免疫功能。
[0004]西洋参为我国传统珍贵的药用植物，广泛的应用在人类保健和医疗上，并且市场对其需求量逐渐增加。由于西洋参对土壤条件要求十分严格且容易受气候及病虫害的影响，所以生产成本高、资源破坏严重，而且其生长周期特别长，以至于西洋参产量偏低，经济效益不好。因此要寻找一条有效的途径改善西洋参的产量和质量，提高其生产效益。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，以便更好地解决植株再生面临的根的分化难，或者生长能力弱和形成的根数量少难题。
[0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
[0007]—种西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，包括以下步骤:
[0008](I)外植体处理:(I)西洋参种子萌发及处理:经过沙藏层积处理，已经裂口的种子，播种到栽培盘中，遮荫培养，待播种I~2周苗长出后，用0.1%升汞消毒6min，无菌水清洗4~5次。将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，接于MS固体培养基上预培养用作转化的起始材料。(II)西洋参一年、二年生根的处理:将西洋参一年、二年生根表面用清水清洗干净后，流水冲洗3~4h,用0.1 %升萊消毒IOmin~20min后,无菌水洗5遍，切成0.2cm厚的薄片放在MS固体培养基上待用。
[0009](2)菌种保存、活化及培养:发根农杆菌的长期保存方法是将农杆菌菌种溶于甘油中，于-20°C条件下保存，这种方法可以保存菌种几年。短期保存的方法是将发根农杆菌接种于YEB固体培养基上培养，当长出菌斑后，于4°C冰箱中保存，此种方法可以保存菌种数月。
[0010]无菌条件下，用接种针挑取保存的菌液，于YEB固体平板上划线，28°C置于黑暗条件下培养，直到长出明显的单菌落。然后挑取一个单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，120r/min、28°C、暗条件下培养24h，此时YEB液体培养基由接种前的透明的红棕色变成浑浊的淡黄色，证明细菌已正常长出。取ImL已活化的菌液加入50mL的YEB液体培养基中，120r/min，28°C暗条件下培养，活化菌液达到生长对数期时，此时的菌液就可以作为感染用。
[0011](3)西洋参发状根诱导条件的优化:
[0012](3a)不同菌种对西洋参发状根诱导率的影响:选择发根农杆菌R1601、8196、A4、rolA四个菌种经平板活化培养后接入YEB液体培养基中，待其菌液生长浓度达到0D_=0.6时用于侵染用。2~3周苗龄的西洋参实生苗，选择生长良好幼嫩的，将其叶片、带叶幼茎和莖段切成1.0cm的切段,在无25± 1°C摇床100~120r/min侵染10~30min,无菌条件下取出。灭菌滤纸吸干材料表面菌液，接于MS培养基上，考察不同菌种对西洋参发状根诱导率的影响。
[0013](3b)菌液浓度对西洋参发状根诱导率的影响:制备好的R1601菌液用YEB液稀释至OD6tltl值为0.2,0.4,0.6,0.8和1.0，将西洋参实生苗外植体投入不同浓度的菌液中浸染15~30min, 25± 1°C摇床100~120r/min,然后取出用无菌滤纸吸干表面的菌液,在共培养基上培养2d后，再转接到 MS共培养培养基上，每隔7d换一次培养基。
[0014](3c)AS与侵染时间对西洋参发状根诱导率的影响:挑取的单菌落接种于添加AS的50mL YEB液体培养基中活化，AS浓度选为O、100 u mol/L振荡培养，待其光密度值为0.6时将西洋参实生苗的组织段浸入，侵染时间选为10min、15min、20min、25min和30min。
[0015](3d)不同外植体对西洋参发状根诱导率的影响:选择外植体为2~3周苗龄西洋参实生苗的叶片、茎段、叶柄和西洋参愈伤组织、一年、二年生西洋参根，选择菌种为发根农杆菌R1601，考察西洋参外植体的选择对发状根诱导率的影响。其中叶片、茎段、叶柄为叶盘法，浸染时间为15~30min，西洋参愈伤组织、西洋参一年、二年生根为滴加法。
[0016](3e) NAA浓度对西洋参发状根诱导率的影响:在预培养的MS基本培养基中添加一定量的NAA有益于发状根的诱导。以2~3周西洋参实生苗的叶柄为材料，MS基本培养基中添加NAA的浓度选择分为0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L,比较发状根诱导率以考察NAA最适浓度。
[0017](3f)预培养时间对西洋参发状根诱导率的影响:选择MS+NAA2.0mg/L固体培养基为预培养基质，选择2~3周西洋参实生苗的茎段为材料，预培养时间选为0h、12h、24h、48h、72h、96h，以考察预培养时间对西洋参发状根诱导率。
[0018](3g)NAA浓度对西洋参发状根诱导率的影响在预培养的MS基本培养基中添加一定量的NAA有益于发状根的诱导。以2~3周西洋参实生苗的叶柄为材料，MS基本培养基中添加NAA的浓度选择分为Omg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L,比较发状根诱导率以考察NAA最适浓度。
[0019](3h)共培养时间对西洋参发状根诱导率的影响:选择共培养时间为12h、24h、36h、48h，共培养培养基选为MS。以2~3周西洋参实生苗的茎段为材料，预培养培养基为MS+NAA2.0mg/L时间为48h，菌种为R1601，以考察基质与共培养时间对西洋参发状根诱导率的影响。
[0020](3i)头孢霉素(Cef)浓度对抑菌和西洋参发状根诱导率的影响头孢霉素(Cef)的浓度选择为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L,除菌基质选择为MS基本固体培养基。综合比较抑菌效果、污染率、获得发根数三项指标，考察头孢霉素(Cef)的最优浓度。
[0021](4)西洋参发状根的获得与鉴定:
[0022](4a)西洋参发根的获得:
[0023]①外植体预培养:西洋参实生苗消毒后，将其叶片切成l.0cmXl.0cm的小块，叶柄、和茎段切成1.0cm长的段，西洋参一年、二年生根流水冲洗去表面浮土，经升汞消毒后蒸馏水3~5遍冲洗干净，视材料厚度切成0.2~0.5cm薄片，将以上所有材料接MS+NAA2mg/L培养基中黑暗条件下培养48h用于侵染。
[0024]②侵染与共培养:在超净无菌工作台上，将预培养的外植体材料，转移到装有准备好菌液的三角瓶中，封口后放在120r/min，黑暗条件下的摇床上感染10~30min，感染后的外植体用无菌滤纸吸干材料表面菌液，接种到MS固体培养基中，于黑暗、25°C条件下共培养 48h。
[0025]③除菌培养:将共培养后的感染外植体材料用无菌水冲洗3遍，无菌滤纸吸干外植体材料表面的无菌水，将其转接到含有头孢霉素(Cef) 500mg/L的MS固体培养基上培养。于黑暗、25°C条件下除菌培养。
[0026](4b)西洋参愈伤与一年、二年生根发状根的诱导:用微量移液枪吸取活化的发根农杆菌菌株8 u L滴到已接到MS固体培养基的西洋参愈伤组织切面与西洋参根切片上。操作过程中避免菌液滴到MS固体培养基上，把滴加菌液的材料放在25°C，黑暗条件下的培养箱中培养。15天后除去褐化死亡的材料，将其余的材料转移到新鲜的MS固体培养基上继续
培养。`
[0027](4c)PCR分子检测:侵染获得的西洋参发状根在形态上与正常西洋参根相比较体现出明显的差异，比如西洋参发状根可在无激素的MS培养基上迅速生长，多根毛、多分枝、无向地性等优点。并且发状根在液体培养基中生长速度很快，大于西洋参愈伤组织悬浮培养物或者未转化的根培养物，这些表型可以为判定西洋参发状根提供了形态学上的依据。通过PCR方法对Ri质粒TfDNA的rolC基因检测将进一步提供分子生物学的依据。
[0028]①引物设计及合成:
[0029]设计引物I和引物2:
[0030]引物1:5' -GATATATGCCAAATTTACACTAG-3'；
[0031]引物2:5' -GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3'；
[0032]利用以上两个引物通过PCR扩增到T-DNA上rolC基因片段，预期长度是564bp，引物是由北京鼎国生物有限公司合成。
[0033]②CTAB法提取西洋参发状根总DNA ；
[0034]③提取发根农杆菌的Ri质粒；
[0035]④PCR循环参数:
[0036]
【权利要求】
1.一种西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)外植体处理:⑴西洋参种子萌发及处理:经过沙藏层积处理，已经裂口的种子，播种到栽培盘中，遮荫培养，待播种I~2周苗长出后，用0.1 %升汞消毒6min，无菌水清洗4~5次；将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，接于MS固体培养基上预培养用作转化的起始材料；(II)西洋参一年、二年生根的处理:将西洋参一年、二年生根表面用清水清洗干净后，流水冲洗3~4h,用0.1 %升萊消毒IOmin~20min后,无菌水洗5遍,切成0.2cm厚的薄片放在MS固体培养基上待用； (2)菌种保存、活化及培养:发根农杆菌的长期保存方法是将农杆菌菌种溶于甘油中，于_20°C条件下保存；短期保存的方法是将发根农杆菌接种于YEB固体培养基上培养，当长出菌斑后，于4°C冰箱中保存；无菌条件下，用接种针挑取保存的菌液，于YEB固体平板上划线，28°C置于黑暗条件下培养，直到长出明显的单菌落；然后挑取一个单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，120r/min、28°C、暗条件下培养24h，此时YEB液体培养基由接种前的透明的红棕色变成浑浊的淡黄色，证明细菌已正常长出；取ImL已活化的菌液加入50mL的YEB液体培养基中，120r/min，28°C暗条件下培养，活化菌液达到生长对数期时，此时的菌液就可以作为感染用； (3)西洋参发状根诱导条件的优化: (3a)不同菌种对西洋参发状根诱导率的影响:选择发根农杆菌R1601、8196、A4、rolA四个菌种经平板活化培养后接入YEB液体培养基中，待其菌液生长浓度达到0D_=0.6时用于侵染用；2~3周苗龄的西洋参实生苗，选择生长良好幼嫩的，将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，在无25 ± 1 °C摇床100~120r/min侵染10~30min，无菌条件下取出；灭菌滤纸吸干材料表面菌液，接于MS培养基上，考察不同菌种对西洋参发状根诱导率的影响； (3b)菌液浓度对西洋参发状根诱导率的影响:制备好的R1601菌液用YEB液稀释至OD600值为0.2,0.4,0.6,0.8和1.0，将西洋参实生苗外植体投入不同浓度的菌液中浸染15~30min, 25± 1°C摇床100~120r/min,然后取出用无菌滤纸吸干表面的菌液,在共培养基上培养2d后，再转接到MS共培养培养基上，每隔7d换一次培养基； (3c)AS与侵染时间对西洋参发状根诱导率的影响:挑取的单菌落接种于添加AS的50mL YEB液体培养基中活化，AS浓度选为O、100 y mol/L振荡培养，待其光密度值为0.6时将西洋参实生苗的组织段浸入，侵染时间选为10min、15min、20min、25min和30min: (3d)不同外植体对西洋参发状根诱导率的影响:选择外植体为2~3周苗龄西洋参实生苗的叶片、茎段、叶柄和西洋参愈伤组织、一年、二年生西洋参根，选择菌种为发根农杆菌R1601，考察西洋参外植体的选择对发状根诱导率的影响；其中叶片、茎段、叶柄为叶盘法，浸染时间为15~30min，西洋参愈伤组织、西洋参一年、二年生根为滴加法； (3e) NAA浓度对西洋参发状根诱导率的影响:在预培养的MS基本培养基中添加一定量的NAA有益于发状根的诱导；以2~3周西洋参实生苗的叶柄为材料，MS基本培养基中添加NAA的浓度选择分为0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L,比较发状根诱导率以考察NAA最适浓度； (3f)预培养时间对西洋参发状根诱导率的影响:选择MS+NAA2.0mg/L固体培养基为预培养基质，选择2~3周西洋参实生苗的茎段为材料，预培养时间选为0h、12h、24h、48h、72h、96h，以考察预培养时间对西洋参发状根诱导率； (3g) NAA浓度对西洋参发状根诱导率的影响:以2~3周西洋参实生苗的叶柄为材料，MS基本培养基中添加NAA的浓度选择分为0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L，比较发状根诱导率以考察NAA最适浓度； (3h)共培养时间对西洋参发状根诱导率的影响:选择共培养时间为12h、24h、36h、48h，共培养培养基选为MS ;以2~3周西洋参实生苗的茎段为材料，预培养培养基为MS+NAA2.0mg/L时间为48h，菌种为R1601，以考察基质与共培养时间对西洋参发状根诱导率的影响； (3i)头孢霉素(Cef)浓度对抑菌和西洋参发状根诱导率的影响:头孢霉素(Cef)的浓度选择为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L,除菌基质选择为MS基本固体培养基；综合比较抑菌效果、污染率、获得发根数三项指标，考察头孢霉素(Cef)的最优浓度； (4)西洋参发状根的获得与鉴定: (4a)西洋参发根的获得: ①外植体预培养:西洋参实生苗消毒后，将其叶片切成1.0cmX 1.0cm的小块，叶柄、和茎段切成1.0cm长的段，西洋参一年、二年生根流水冲洗去表面浮土，经升汞消毒后蒸馏水3~5遍冲洗干净，视材料厚度切成0.2~0.5cm薄片，将以上所有材料接MS+NAA2mg/L培养基中黑暗条件下培养48h用于侵染； ②侵染与共培养:在超净无菌工作台上，将预培养的外植体材料，转移到装有准备好菌液的三角瓶中，封口后放在120r/min，黑暗条件下的摇床上感染10~30min，感染后的外植体用无菌滤纸吸干材料表面菌液，接种到MS固体培养基中，于黑暗、25°C条件下共培养48h ； ③除菌培养:将共培养后的感染外植体材料用无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干外植体材料表面的无菌水，将其转接到含有头孢霉素(Cef) 500mg/L的MS固体培养基上培养，于黑暗、25°C条件下除菌培养； (4b)西洋参愈伤与一年、二年生根发状根的诱导:用微量移液枪吸取活化的发根农杆菌菌株8 u L滴到已接到MS固体培养基的西洋参愈伤组织切面与西洋参根切片上；操作过程中避免菌液滴到MS固体培养基上，把滴加菌液的材料放在25°C，黑暗条件下的培养箱中培养；15d后除去褐化死亡的材料，将其余的材料转移到新鲜的MS固体培养基上继续培养; (4c) PCR分子检测:通过PCR方法对Ri质粒TfDNA的rolC基因检测将进一步提供分子生物学的依据，具体过程如下: ①引物设计及合成:设计引物I和引物2:
引物 1:5' -GATATATGCCAAATTTACACTAG-3'；
引物 2:5' -GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3,； 利用以上两个引物通过PCR扩增到T-DNA上rolC基因片段，预期长度是564bp ； ②CTAB法提取西洋参发状根总DNA;③提取发根农杆菌的Ri质粒； ④PCR循环参数:
2.根据权利要求1所述的西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，其特征在于:所述步骤(4c)中的CTAB法提取西洋参发状根总DNA的具体过程如下: (1)取280mg经继代培养的西洋参发状根加入10%PVP在液氮中充分研磨至粉末状(约 30s ~Imin)； (2)用药匙小心转移至1.5ml的离心管中，加入65°C预热的660 y 12XCTAB的提取缓冲液，65°C水浴45min,每隔5~IOmin轻轻振荡一次； (3)加入200u L冰浴过的Solution I，涡旋振荡使细胞均匀分布，室温下放置IOmin ； (4)加入400u L新鲜配置好的Solution II,轻轻颠倒混匀,冰浴5min ； (5)加入300ii L Solution III，反复颠倒数次，使溶液在粘稠的菌体裂解物中分散均匀，然后置冰上5min ； (6)12000r/min离心IOmin,小心吸取上清液加入1.5mL离心管中； (7)加入等体积的饱和酚、氯仿，通过剧烈振荡混合有机相和水相，12000r/min离心5min ； (8)取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，混匀，12000rpm，离心IOmin ； (9)用一只剪去前头的枪头，小心将上清液转移到一只新的1.5ml离心管中，并加入两倍体积的-20°C预冷的无水乙醇，即见到丝状沉淀，-20°C下放置30min，12000rpm,离心5min，得到淡黄色沉淀； (10)倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入300Ul超纯水重新溶解，再加A _20°C预冷的无水乙醇600 u 1，沉淀过夜； (11)12000rpm,离心lOmin，得到白色的胶状沉淀，倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入70%乙醇800 u I洗涤沉淀2~3次； (12)吸净残余溶液，置超净工作台吹干(约需10~15min)； (13)加入40~60iU超纯水，溶解沉淀，加入3ill Rnase，室温放置30min后，-20 °C下保存。
3.根据权利要求1所述的西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，其特征在于:所述步骤(4c)中的提取发根农杆菌的Ri质粒的具体过程如下: (1)挑取R1601单菌落于10mlYEB培养基中，28°C，120rpm，过夜培养； (2)吸取8ml培养好的菌液,加入IOml离心管中,4000rpm,离心5min,倾去培养液,加A 2ml预冷的STE，重新悬浮细胞，分别吸取Iml菌悬液，加入1.5ml离心管中，12000rpm离心2min,倾去培养液,获得适量的菌体细胞； (3)加入200ill冰浴过的Solution I，涡旋振荡使细胞均匀分布，室温下放置IOmin ； (4)加入400u I新鲜配置好的Solution II,轻轻颠倒混匀,冰浴5min ；(5)加入300ill Solution III，反复颠倒数次，使溶液在粘稠的菌体裂解物中分散均匀，然后置冰上5min ； (6)12000rpm离心IOmin,小心吸取上清液加入1.5ml离心管中； (7)加入等体积的饱和酚、氯仿，通过剧烈振荡混合有机相和水相，12000rpm离心5min ； (8)小心吸取上清液加入新的1.5ml离心管中，用等体积的氯仿重新抽提一次； (9)小心吸取上清液加入新的1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/LNaAc,冰浴30min, 12000rpm,离心lOmin,倾去上清液,倒置在吸水纸上,使溶液流尽； (10)加入lml70%乙醇洗涤两次，12000rpm离心5min，收集沉淀； (11)倾去洗涤液，倒置于吸水纸上吸干残余的溶液，在超净工作台上吹干； (12)加入50u I TE重悬，备用。
4.根据权利要求1所述的西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，其特征在于:所述步骤(4c)中的琼脂糖凝胶电泳具体过程如下: (1)用胶带封住电泳槽胶模边缘形成一个模具； (2)配制足够的电泳缓冲液(IXT BE)用以装满电泳槽和配制凝胶； (3)准确称取一定量的琼脂粉加到盛有一定量电泳缓冲液的三角瓶中在微波炉中加热至融化，然后小心加入溴乙锭，浓度为0.g/ml，轻轻旋转至混匀凝胶溶液； (4)在模具上加一个合适的梳子形成加样孔，然后倒入适量温热的琼脂糖溶液，室温30min以后,去掉封边胶带,将凝胶放入电泳槽,使电泳缓冲液没过凝胶约Imm ； (5)混合PCR扩增产物样品和0.2倍体积的上样缓冲液； (6)用移液枪和一次性枪头将样品混合液缓慢加入浸没凝胶的加样孔内，分子质量标准品加在样品的左侧； (7)盖上电泳槽盖，接好电极插头，DNA有阴极开始向阳极端泳动，给予I~5V/cm的电压，很快就能观察到溴酚蓝从加样孔进入胶体内； (8)当DNA样品或二甲苯氰FF和溴酚蓝在凝胶中迁移了足够的距离时，关上电源，拔出电极插头和打开电泳槽盖，把凝胶置于凝胶成像系统下拍照。
【文档编号】C12N15/82GK103614411SQ201310545022
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月2日 优先权日:2013年11月2日
【发明者】王 义, 张美萍, 宫秀杰, 谢海云, 孙春玉, 蒋世翠, 王康宇, 杨广顺 申请人:吉林农业大学