专利名称：一种高效诱导喜树离体叶片不定芽再生的培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术。
背景技术：
喜树是我国南方特有树种，因其体内不同部位均含有喜树碱而闻名。近年来在抗肿瘤的天然产物中喜树碱已经成为一种非常重要的化合物(Comins et al.，1994)。目前两类喜树碱的衍生物已经被批准用于临床治疗癌症，其它几种正在用于临床实验(Thomas et al.，2004)。喜树因其药用价值越来越得到科学工作者的重视。Liu and Adams(1998)的研究结果表明，不同地理种源喜树碱含量存在明显差异，喜树碱含量高的种源和喜树碱含量低的种源相比能高出3.5倍多。目前喜树处于濒危状态而且喜树碱的提取要消耗大量喜树资源，因此急需培育出喜树碱含量高的喜树种源进行大量繁殖以满足市场上对喜树碱的需要(Liu and Li，2001)。由于树木的周期比较长，传统的育种方法无法在短期内解决这一问题，而遗传转化为林木的遗传改良开辟了新的渠道(Estruch，1997)。因此通过遗传转化的方法提高喜树碱含量将非常具有吸引力并能弥补喜树自然资源的缺乏。
由于农杆菌介导的遗传转化具有简单、快速和高效的特点，而且得到的转基因植物通常是单拷贝的，因而在大多数植物中得到了广泛的应用(Hansen and Wright，1999；Wu et al.，2003)。不定芽再生是根癌农杆菌介导的遗传转化中一个非常关键的环节(Pérez-Tornero et al，2000)。然而在喜树的组织培养方面，以腋芽和顶芽为外植体的组织培养研究已见报道(Jain and Nessler，1996；Liu and Li，2001)，然而这两个再生系统不适合农杆菌介导的遗传转化。在农杆菌介导的遗传转化过程中，叶片是比较理想和有效的受体(Horsch et al，1985)。目前还没有见到以喜树叶片为外植体的组织培养系统的报道。因此我们建立了以喜树叶片为外植体的组织培养系统，目的是为喜树次生代谢基因工程打下良好基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合于喜树叶片组织培养的培养基，建立高效和可重复的喜树组织培养再生系统。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是由硝酸铵、硫酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、二水氯化钙、四水硝酸钙、七水硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、一水硫酸锰、七水硫酸锌、二水钼酸钠、五水硫酸铜、烟酸、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、肌醇组成WPM培养基的基础上还增加了植物激素6-BA(6-苄基氨基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)及琼脂与蔗糖。
所述的培养基配方包括a.愈伤组织诱导培养基WPM+6-BA1.0mg/l+NAA0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6.0g/lb.不定芽再生和增殖培养基WPM+6-BA0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂6.0/lc.不定芽生根培养基WPM+IBA0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂6.0g/l其中，WPM培养基的配方为硫酸钾(K2SO4)990mg/l、硝酸铵(NH4NO3)400mg/l、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)390mg/l、二水氯化钙(CaCl2·2H2O)96mg/l、四水硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)556mg/l、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/l、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)37.3mg/l、七水硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg/l、硼酸(H3BO3)6.2mg/l、四水硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/l、七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/l、五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/l、二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l。
本发明的优点是该培养基对喜树离体叶片愈伤组织诱导率高，愈伤组织不定芽发生频率高，可以在较短的时间内得到大量的再生苗，建立优良的再生体系，为根癌农杆菌介导的遗传转化提供保障。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细的描述。
该培养基的组成成分是由硝酸铵、硫酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、二水氯化钙、四水硝酸钙、七水硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、一水硫酸锰、七水硫酸锌、二水钼酸钠、五水硫酸铜、烟酸、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、肌醇组成WPM培养基的基础上还增加了植物激素6-BA(6-苄基氨基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)及琼脂与蔗糖。
培养基配方包括a.愈伤组织诱导培养基WPM+6-BA1.0mg/l+NAA0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6.0g/lb.不定芽再生和增殖培养基WPM+6-BA0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂6.0g/lc.不定芽生根培养基WPM+IBA0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂6.0g/l其中，WPM培养基配方为硫酸钾(K2SO4)990mg/l、硝酸铵(NH4NO3)400mg/l、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)390mg/l、二水氯化钙(CaCl2·2H2O)96mg/l、四水硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)556mg/l、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/l、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)37.3mg/l、七水硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg/l、硼酸(H3BO3)6.2mg/l、四水硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/l、七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/l、五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/l、二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l。
各种培养基配置时除添加以上成分外，PH值要调整为5.8，分装后在121℃，1.1kg/cm2的压力下灭菌20分钟。
应用以上培养基，用喜树无菌苗叶片接种在该发明的培养基上，半个月时可以诱导出愈伤组织，一个月时可以产生不定芽。不定芽长到1cm左右时接种到生根培养基，进行生根培养。在生根培养基上生长3周左右即可进行移栽。
本发明用喜树(Camptotheca acuminata)无菌苗的叶片进行培养，取得成功，叶片外植体来源于腋芽再生获得的无菌苗，腋芽再生的基本培养基为B5培养基，具体操作如下B5培养基配方为由硝酸钾(KNO3)2500mg/l、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)250mg/l、二水氯化钙(CaCl2·2H2O)150mg/l、硫酸铵((NH4)2SO4)134mg/l、一水磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)150mg/l、七水硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg/l、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)37.3mg/l、碘化钾(KI)0.75mg/l、硼酸(H3BO3)3.0mg/l、一水硫酸锰(MnSO4·H2O)10mg/l、七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)2mg/l、二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/l、五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/l、六水氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/l、烟酸1mg/l、肌醇100mg/l、盐酸硫胺10mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l。
腋芽再生无菌苗叶片的获得以温室3年生的喜树腋芽为材料，腋芽在70％的乙醇中灭菌30s，5％次氯酸钠中灭菌5分钟，接着无菌水漂洗3遍后进行接种。
腋芽再生的培养基成分如下不定芽诱导培养基B5+BA1.0mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6.0g/l不定芽继代和增殖培养基B5+BA0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂6.0g/l喜树的腋芽在诱导培养基上培养半个月左右，每个腋芽可产生3-4个不定芽。将得到的不定芽在继代增殖培养基上培养一个月左右，其叶片就可用于再生培养。
将通过上述途径获得的叶片边缘剪去，将叶片向轴面朝下接种于叶片愈伤组织诱导培养基，半个月时可诱导出愈伤组织，将愈伤组织转接到不定芽再生和增殖培养基继续培养半个月时，便可诱导出不定芽。接着挑选生长健壮、发育正常、苗高1cm左右的不定芽转接到生根培养基进行生根培养。不定芽在生根培养培养基上培养3周左右，即可进行移栽。将根系发育健壮的喜树再生苗从培养基中取出，用自然水冲洗掉根部的培养基，移栽到沙子和泥炭土1∶1的基质中，移栽前两周，用塑料薄膜作成拱棚罩住再生苗，以防止水分散失，造成小苗枯萎。以后逐渐打开塑料薄膜，在温室进行正常培养，移栽成活率可达95％以上。
附注1.WPM及B5培养基为植物组织培养的公知培养基。
权利要求
1.一种高效诱导喜树离体叶片不定芽再生的培养基，配方包括a.愈伤组织诱导培养基WPM+6-BA1.0mg/l+NAA0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6.0g/lb.不定芽再生和增殖培养基WPM+6-BA0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂6.0g/lc.不定芽生根培养基WPM+IBA0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂6.0g/l其中，WPM培养基配方为硫酸钾(K2SO4)990mg/l、硝酸铵(NH4NO3)400mg/l、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)390mg/l、二水氯化钙(CaCl2·2H2O)96mg/l、四水硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)556mg/l、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/l、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)37.3mg/l、七水硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg/l、硼酸(H3BO3)6.2mg/l、四水硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/l、七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/l、五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/l、二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l。
全文摘要
一种高效诱导喜树离体叶片不定芽再生的培养基，由硝酸铵、硫酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、二水氯化钙、四水硝酸钙、七水硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、一水硫酸锰、七水硫酸锌、二水钼酸钠、五水硫酸铜、烟酸、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、肌醇组成WPM培养基的基础上还增加了植物激素6－BA(6－苄基氨基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)及琼脂与蔗糖。本发明中的培养基使喜树离体叶片愈伤组织诱导率高，愈伤组织不定芽发生频率高，可达70％，而且每片叶片不定芽发生数目多，平均为11个。这种培养基使喜树离体叶片不定芽发生的再生系统具有高频性和可重复性，为喜树次生代谢基因工程打下了良好的基础。
文档编号C12N5/04GK1644682SQ200410044119
公开日2005年7月27日 申请日期2004年12月13日 优先权日2004年12月13日
发明者祖元刚, 王慧梅, 王文杰, 董凤丽, 于景华, 杨逢建 申请人:东北林业大学, 祖元刚