专利名称：鸭瘟疱疹病毒转移载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种鸭瘟疱疹病毒转移载体以及它的制备方法。
背景技术：
在我国，鸭、鹅是重要的经济禽类。近几年来，养鸭、养鹅在我国的某些地区发展迅速，将成为继养鸡业后第二个实现资源配置和利润合理化的产业。目前，传染病仍然是危害鸭、鹅养殖业健康、持续发展的重要因素之一，加强对鸭、鹅传染病的防治显得尤为重要。鸭瘟是由鸭瘟疱疹病毒引起的鸭、鹅的急性、败血性传染病，以成年鸭、鹅常见，发病率、死亡率高，在我国被列入动物二类传染病。目前国内外防治鸭、鹅传染病仍使用传统的疫苗进行预防接种，与其它疾病的防治手段相比，相对落后。
随着DNA重组技术的发展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速发展，其中重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗的研究热点。重组病毒活载体疫苗是以病毒作为载体，在真核细胞中表达外源基因，它在病毒病的防治等方面展现了广阔的前景，其中以疱疹病毒作为病毒载体的研究近年来十分活跃。与传统疫苗相比，重组病毒活载体疫苗具有使用安全、免疫力持久、接近动物自然感染的方式，多价苗还可以达到一针预防多病的目的。
发明内容本发明的目的在于提供一种鸭瘟疱疹病毒转移载体及其制备方法。
本发明的产品是是利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因，在获得以上3个基因序列的基础上，利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列，将其亚克隆入克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC-TK2.9，将lacZ基因表达盒插入载体pUC-TK2.9中的TK基因内，构建成的鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
本发明产品中的(1)鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼序列的大小为8481个碱基，即8481bp，包含鸭瘟疱疹病毒完整的UL24基因、TK基因、gH基因和UL25、UL21基因的部分序列；鸭瘟疱疹病毒UL24基因大小为1230bp，编码409个氨基酸；TK基因大小为1077bp，编码358个氨基酸；gH基因大小为2505bp，编码834个氨基酸。
本发明产品的核酸序列为
AGGCCCCGTTCGTATTGCAAAGCTACCGCATCATGTGTCGTTAGTACCTCTTGAATAGGTACAGATATAGTCTTAGACCTGTTTTGCAATTCGACCGCAATGAGTCGCAAAAGGGCAGCCTGGGCTCTATTCGTTGACACGTCTAAGACATGGCGTGTAGCATTTTGTGTTTTTATGTTACGTGCATCCAAACAAAGAGCTACGAGACCAGGAAACATCTGTGTTATCTCAGTTTGCGGATCAGCTGCATATAATGAAGCCATATAACGCTCGCAAAGGAACGCGAAATTGCGATTATCGCTTTTCATGGTTTGGGCCCCCGCGGCCCCGCCATTGGACGCGCCGCGATTTAAGCGATCAGATGGTACTGCACCTGGCAACAACGTTCCGATCTGAAAATTATTACACATGCGATCCGCATAGACATTCGTATTCCATAATAATTTTCGCATGAGTATCAGTGATGTTATGGTATTTATAGTGGCGCGTAGCTGAGTTATATCCTCCATAAGAAATAGAGGTTGGGCTCTCCCAAATACGGCCCCGGCAGCTTTATTTACCTCATCTACATAAGCTCGTTGACTCTTATCAACATCCCTCGCAAGTCCATCTGGGGCGGCTACGCCAGGAGACAGCGGCAACACACCATGTTTTATAAGCATAGCTAGAACACAATGACCAGAAAGGGCAATTCGTTCCCCACTTCTGGGTTGGATGGCAAACTGACCCTTAGGTAATCTATCCATATCAAACCTATAACACAAGCGACCGCAATCGGAGGCGAGACGTTCTATAAAATTATCCAAATAAGCAGGTAGCTGCTCCACCATTCCTATAGCACTAGACGCGTAGTTAAATGGTTGGCATTTAGTCTTGGCAGATGTAATCCTGTGATGTAGCTGTAGGCATAATATCGCGCACTCTAGAGCTGTATAATGACGGACTCTTAAATACAAGCGCCCAGTGGCCTGTAGTGATACTATAGCAGTAGTCATAAACGTTTTGGACTGCCGTCCATCGCGCTGGTCTAACCGTTTGGACACAACAGGCCACTCAGTAATCAAACCGTCTTGGAGAGCTTTATACCAAGTACCGAATAATACACCCCAACCAGAAGCCGAAGAGCCACCACGTGTTGAATAAATAATAGTTAACAAGTCTGTACTCAAATTAGTGTCATAGCGCAATGGTGTATCGTTCTTAACTATCTGTACTTCGCGCCTTTCATCATTAGAATCACTTGTTTCTCCCAATTTATCCCCATCGCCGTCTTGTCGGCTACGTTCATATGATCCATCGATCTCATCAGCCGGCGTCCGTCGCTTCTGCCATAGCAGCAGCATTCTCCAAATCTGCGATTACTGCTGTTACAGATTTTACTTGCTCTTCTATAGGTTTTAAACGCATTTCTAATTCGGCTGATATACAGTTATTCTTGATGCTTAAATGATCCAACGCCGCCGATGCCGCAGTATTCCGTTGTTGTAATATACGTAATCTCTGTATCGCTGTTTCTTCTTCATGGCGATTTGCCTGCGATTTTGTCCAGTAGTGCGCTGGCCAATTCGGTGTTATAAAATTCCTAGAATCTGATATGTAGCCCGCGGAGCTATGTCCTTTGCACATATCAAGTGGGGAGAAAAAGAATCTTTCCATTGTTGATTATACAAGCCGATAGTTTTAAGAAATCCAATACACTTCTAATCGACAGACCCTCGCACAGCTAGTAACAAAAACCGTTGTCAAACAATTCTTTTTAAACACTCGCGACCAGAACTCCCGCCCATAATAATCAACACTGCCAGACAATAGGATGGTAATATGCGTTTCTGTAATAATGCACTAGTGTTTAGTTGGTCTGAATATGGATGCTACAAATCGCAATACTCCACCGCCTATTTGTGTCTCTGTATCGCTACAATTAATATCACTGTCTGATGCGACGCCATGCTTGCCATCATAACCGTATTCTCCATTAATACCATCTATATTCGTTTTGGGTTCTTCAGTATTGTTTAGTCCTGTATTTGTCTGTGGTGTAACCAACTGCCCATAACCCCATAGTCGCAATAGTCGTACGCTATGGATCCCAGTTGCATTGCCGTGTGGTATGTTCTCGCCTGCCGCAGAACTCGTCCCGACGCCTGGCGAAAATTCTTCCCACCAGCGTTTTTTCGCAAGACTGGAAGAATTTTCGCTGGGTGTACGAGCACATGTCGGGTTCATAATGGCATCATCGATGTCGTCTTTGTCGACAATTTTGCACGCATCTTTACTGTATAATTCGGACTCCAATTGAACATACTGGCTACATATACATTTAGCCTTCCGGCGCTTACCTTTGGTAGGTATATGATATTCTGATAAACCTGCAATAGAGGCTGATAATGCCGCAAAGTTGGAGGATACGCGCCGATGAGCAAATCGTGTAATTCGGAGTATGTCCAGACCGCGCTGGGCTACAAATACTAGCAACGGACATATTAAAAATTGACTGCATCCAGGGGGCATGATACGTTCCAACAAGATGGCCGATTCCATCAATTGTCTAATTCCAGTCCATGTTTGCTGTTGTTTACTTCCTGTTGTCATATTTTTTACAAACTTGCAAGTCTTGAGTTCCAAAATAATACATATGACATCTGCAGTTTCTGCCTCGCCTGTCTTAATCATGCATATGCAATCTGGGCGGCGCCTTCCTAAGTTGACTTCAAAAGTCAGCCTCACATCAAATGCAGTTTTAAGTGTCTGCAAAGACAGAGTGTGTTCGAATAGCCGCACAATCAGTTTACTGGGCGATCCACCATTTGAACGAAATTTGTTCAAATCGTTAGCCAGGGCGCCATAAAAACGATTGTGGCAGCGCACTCCAGCTTTGAGGCGACGTGCGACTGAACCGGACGTGTTGGCATCGGTTCGTCTCTTGGATCCTGCTACGCGTCTACAAGGCCGCTGTTCCGCGTTCTTAAGTGCGGCTGTCGTCGCTGCGCCAATACATTTCCGATCAAATGTCACTGCGCGACTCTTGCGAACGCTTAATCCGGCGCGCTTTTTCTGTACCTTCGATGCCATTATGCCTCGTCCGCGTATACCTAGACGGGCCGTATGGAACTGGCAAAACCACAACTGGCAAACTGTTGTCGGAGGATACCCTTGCAGCCACTCTTTATGTTGCCGAGCCAATGGCGTATTGGAGAAATCATTTTGAAGATGTAATAAAGGGCGTATACGAAACACAGGAAAGAAAAGCTCGAGGTGACATAGCAACAACTGACGCAAAAGCAATTACGGCTGCTCTTCAACTGCAATTTTTCGCACCATACAGTTCCTTTCATACATATGCATCGACGTTATTTGGAGTCGAAGCGCCAGAAAGAACACCACCAGATATTACGCTCATAACTGATCGGCACCCGACCGCCGCATGTCTTTGCTTCCCAGCAGCTCGTTTTGTAGTGGGGGATATGAGCCTTAATACTCTATTGGCTATGATATCCCTAATTCCTCGCGAACCCCATGGTGGAAATATAGTAATAATGGATTTGAATGAAGATGAGCATCTTGAACGATTGAGAGCTCGCCAACGTCCTGGCGAAGCAATTGACGTACGCTTCTTGCGCGTATTACATAATATATATAAGATGTTTGTTA
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TATCAGTGCGTATTGCCGTCTTCATTAAATCATTAGTCGTATAAATTTCTGCGATTATTGAAGCGAGACGCGCTATACGTTGTAATTGAATAGACTGGTGTTCCTGGGCCGTGTCCAGGAGATCGGTAGCCATTTCAAATAACGTTTCTGCATCATCCATCACCGAATCATCTTCATCTGTTGCAACGCGCAACTGTTTGACGCGCGTTGATAATATAGCGACGGAAGATGCCCAGATTATGCAAGATTCGCGAAAAAGTCTATTTGTCGTATCTACTAGCAAATGTATATCTCTGGGCGGTTCTGGAAACGATTCCGAGTCCGCGCTTAGACTTACGCATAAATGCTCTATGATTGGGTAACAATTTGGATAGCCGCCTTTACACAATATATACTGAACCAGCGCAAACTTTTGTGCGCTAGAAACTGAACGTCCCATGGAATAACCAACGAATAGTTCCCCAATGTTGCCAAAAGATGCTTCTATTGCATCGCCAATTCTAGCTCTAGCGTCATTAAATTCGGGTTCGAGACCAAACCAAGTACTAATATCCTGAGAGACTACATCCCCAATCCTACAAAATACGGTCCAAAGGGCCCCAAGCGATCGCGTAGGTTTGAAATTACCGGCACCATATTCCCATATATTAAGCACAGCGGGAATGTATTTTACTTGCACAAATGAACTGACAGTAGTTTTGCGTGCGCCGCGACGTGAATGTTTTCGAGAATGAAGTGTGGTGGTAATGTCGCAGTCATCATTCGTGTTTAACGTTCCCTCCCCAGAGCCGCGATGTCGCTCGCCATGTCCATGCTTTACCAATACTGTTCCGAAGGAGCGCTTGCCAGTAATTATTACATCTGTTTGTTTTGTTTCTTCTCGTACTCCCCTACGTCGAACGGCTATGCGATCAAATAGTCCATCGACCATAGCGGCAAGTGACTGCGGCAATGATGTAAGACGCGCCTGCATGAGCGCAAATGCATTCCTATTTGGTTCGTAAATAAAACCAGAACTTGCATTAGTAATAATTGGTACATCATATAATTTGATAACTTGATAGTTCGAAAATATATGACCCGTTGATAATATCAGGCCTGACGATATTTCGAGTGAACCATATACTCAGCGATACACTGGTCGCGAACTTCAACCTCAAGCGCCCCGCACAAACGAAGTAAGC本发明鸭瘟疱疹病毒转移载体pUC-TK2.9-lacZ是利用基因工程技术，利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因，在获得以上3个基因序列的基础上，利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列，将其亚克隆入克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC-TK2.9，将lacZ基因表达盒插入载体pUC-TK2.9中的TK基因内，构建鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
采用本发明的方法生产的产品可用于①本产品可用来构建鸭瘟疱疹病毒基因缺失疫苗。
②本产品可用来构建重组活载体疫苗。
本发明的产品优点表现在①所克隆用于构建转移载体的TK基因及其侧翼序列目前在国内外尚未见报道。
②构建的转移载体为构建重组鸭瘟疱疹病毒搭建一物质平台。
③应用此转移载体可以构建多种重组活载体疫苗，预防鸭鹅等相关禽类的多种传染病。
(四)具体实施方案上述已对本发明的产品作了具体地描述，本发明的产品可以采用这样的方法来制备1)设计扩增UL24、TK和gH基因的引物根据鸭瘟疱疹病毒UL25、UL24、TK、gH和UL21基因的保守序列，设计兼并引物。
位于TK基因内的兼并引物DP1和DP2DP15′TCTCGAC(T)GGA(G，C，T)GCA(G，C，T)C(T)AC(T)GG 3′DP25′GCGATTGGA(G)TGG(C，T)CG(T)A(G)TC 3′
位于UL24基因内的兼并引物DP3 5′CGGCACGA(T)C(T)TTC(T)AA(G)C(T)TC 3′位于gH基因内兼并引物DP4 5′ATCATCGTACCA(G)TTAGG 3′位于UL25基因内兼并引物DP5 5′AGGCCCTIT(G)TTCG(A)TAT(C)TG 3′位于UL21基因内兼并引物DP6 5′GCTTAC(T)TTC(T)A(G，C，T)T A(G，C，T)TA(G)C(T)GG A(G，C，T)GG 3′2)通过PCR扩增获得UL24、TK和gH基因的序列利用设计合成的引物，通过5次兼并PCR分别克隆TK基因的保守序列、TK基因的上游侧翼序列FUL24-TK、FUL24-TK的上游序列FUL25-UL24、TK基因的下游侧翼序列FTK-gH和FTK-gH的下游侧翼序列FgH-UL21，将以上5个片段拼接，共得到8481bp的DNA序列，序列分析表明该序列含有完整的UL24、TK和gH基因。
3)PCR扩增TK基因及其侧翼序列(FTK2.9)根据所得DNA序列的结果，设计2条引物上游引物为5′CCGGAATTCATTTGTCTGTGGTGTAAC 3′，下游引物为5′CCCAAGCTTAGTGCTGATGGTAGGAG 3′，使用这两条引物，通过PCR克隆大小为2.9kb的PCR产物FTK2.9。
4)重组载体pUC-TK2.9的构建将FTK2.9通过EcoRI和HindIII酶切位点亚克隆入克隆载体pUC18，形成重组质粒pUC-TK2.9。
5)转移载体pUC-TK2.9-lacZ的构建将载体pUC-TK2.9用HpaI内切酶切开，并且用小牛碱性磷酸酶去磷酸化。用PstI和EcoRI内切酶酶切质粒pSV-β-Galactosidase，切出lacZ表达盒，并且用T4DNA聚合酶将黏性末端补平。将线性化的pUC-TK2.9和lacZ表达盒平端相连接，构建重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
权利要求
1.鸭瘟疱疹病毒转移载体，其特征是它是利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因，在获得以上3个基因序列的基础上，利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列，将其亚克隆入克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC-TK2.9，将lacZ基因表达盒插入载体pUC-TK2.9中的TK基因内，构建成的鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
2.根据权利要求1所述的鸭瘟疱疹病毒转移载体，其特征是(1)鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼序列的大小为8481个碱基，即8481bp，包含鸭瘟疱疹病毒完整的UL24基因、TK基因、gH基因和UL25、UL21基因的部分序列；鸭瘟疱疹病毒UL24基因大小为1230bp，编码409个氨基酸；TK基因大小为1077bp，编码358个氨基酸；gH基因大小为2505bp，编码834个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的鸭瘟疱疹病毒转移载体，其特征是其核酸序列为AGGCCCCGTTCGTATTGCAAAGCTACCGCATCATGTGTCGTTAGTACCTCTTGAATAGGTACAGATATAGTCTTAGACCTGTTTTGCAATTCGACCGCAATGAGTCGCAAAAGGGCAGCCTGGGCTCTATTCGTTGACACGTCTAAGACATGGCGTGTAGCATTTTGTGTTTTTATGTTACGTGCATCCAAACAAAGAGCTACGAGACCAGGAAACATCTGTGTTATCTCAGTTTGCGGATCAGCTGCATATAATGAAGCCATATAACGCTCGCAAAGGAACGCGAAATTGCGATTATCGCTTTTCATGGTTTGGGCCCCCGCGGCCCCGCCATTGGACGCGCCGCGATTTAAGCGATCAGATGGTACTGCACCTGGCAACAACGTTCCGATCTGAAAATTATTACACATGCGATCCGCATAGACATTCGTATTCCATAATAATTTTCGCATGAGTATCAGTGATGTTATGGTATTTATAGTGGCGCGTAGCTGAGTTATATCCTCCATAAGAAATAGAGGTTGGGCTCTCCCAAATACGGCCCCGGCAGCTTTATTTACCTCATCTACATAAGCTCGTTGACTCTTATCAACATCCCTCGCAAGTCCATCTGGGGCGGCTACGCCAGGAGACAGCGGCAACACACCATGTTTTATAAGCATAGCTAGAACACAATGACCAGAAAGGGCAATTCGTTCCCCACTTCTGGGTTGGATGGCAAACTGACCCTTAGGTAATCTATCCATATCAAACCTATAACACAAGCGACCGCAATCGGAGGCGAGACGTTCTATAAAATTATCCAAATAAGCAGGTAGCTGCTCCACCATTCCTATAGCACTAGACGCGTAGTTAAATGGTTGGCATTTAGTCTTGGCAGATGTAATCCTGTGATGTAGCTGTAGGCATAATATCGCGCACTCTAGAGCTGTATAATGACGGACTCTTAAATACAAGCGCCCAGTGGCCTGTAGTGATACTATAGCAGTAGTCATAAACGTTTTGGACTGCCGTCCATCGCGCTGGTCTAACCGTTTGGACACAACAGGCCACTCAGTAATCAAACCGTCTTGGAGAGCTTTATACCAAGTACCGAATAATACACCCCAACCAGAAGCCGAAGAGCCACCACGTGTTGAATAAATAATAGTTAACAAGTCTGTACTCAAATTAGTGTCATAGCGCAATGGTGTATCGTTCTTAACTATCTGTACTTCGCGCCTTTCATCATTAGAATCACTTGTTTCTCCCAATTTATCCCCATCGCCGTCTTGTCGGCTACGTTCATATGATCCATCGATCTCATCAGCCGGCGTCCGTCGCTTCTGCCATAGCAGCAGCATTCTCCAAATCTGCGATTACTGCTGTTACAGATTTTACTTGCTCTTCTATAGGTTTTAAACGCATTTCTAATTCGGCTGATATACAGTTATTCTTGATGCTTAAATGATCCAACGCCGCCGATGCCGCAGTATTCCGTTGTTGTAATATACGTAATCTCTGTATCGCTGTTTCTTCTTCATGGCGATTTGCCTGCGATTTTGTCCAGTAGTGCGCTGGCCAATTCGGTGTTATAAAATTCCTAGAATCTGATATGTAGCCCGCGGAGCTATGTCCTTTGCACATATCAAGTGGGGAGAAAAAGAATCTTTCCATTGTTGATTATACAAGCCGATAGTTTTAAGAAATCCAATACACTTCTAATCGACAGACCCTCGCACAGCTAGTAACAAAAACCGTTGTCAAACAATTCTTTTTAAACACTCGCGACCAGAACTCCCGCCCATAATAATCAACACTGCCAGACAATAGGATGGTAATATGCGTTTCTGTAATAATGCACTAGTGTTTAGTTGGTCTGAATATGGATGCTACAAATCGCAATACTCCACCGCCTATTTGTGTCTCTGTATCGCTACAATTAATATCACTGTCTGATGCGACGCCATGCTTGCCATCATAACCGTATTCTCCATTAATACCATCTATATTCGTTTTGGGTTCTTCAGTATTGTTTAGTCCTGTATTTGTCTGTGGTGTAACCAACTGCCCATAACCCCATAGTCGCAATAGTCGTACGCTATGGATCCCAGTTGCATTGCCGTGTGGTATGTTCTCGCCTGCCGCAGAACTCGTCCCGACGCCTGGCGAAAATTCTTCCCACCAGCGTTTTTTCGCAAGACTGGAAGAATTTTCGCTGGGTGTACGAGCACATGTCGGGTTCATAATGGCATCATCGATGTCGTCTTTGTCGACAATTTTGCACGCATCTTTACTGTATAATTCGGACTCCAATTGAACATACTGGCTACATATACATTTAGCCTTCCGGCGCTTACCTTTGGTAGGTATATGATATTCTGATAAACCTGCAATAGAGGCTGATAATGCCGCAAAGTTGGAGGATACGCGCCGATGAGCAAATCGTGTAATTCGGAGTATGTCCAGACCGCGCTGGGCTACAAATACTAGCAACGGACATATTAAAAATTGACTGCATCCAGGGGGCATGATACGTTCCAACAAGATGGCCGATTCCATCAATTGTCTAATTCCAGTCCATGTTTGCTGTTGTTTACTTCCTGTTGTCATATTTTTTACAAACTTGCAAGTCTTGAGTTCCAAAATAATACATATGACATCTGCAGTTTCTGCCTCGCCTGTCTTAATCATGCATATGCAATCTGGGCGGCGCCTTCCTAAGTTGACTTCAAAAGTCAGCCTCACATCAAATGCAGTTTTAAGTGTCTGCAAAGACAGAGTGTGTTCGAATAGCCGCACAATCAGTTTACTGGGCGATCCACCATTTGAACGAAATTTGTTCAAATCGTTAGCCAGGGCGCCATAAAAACGATTGTGGCAGCGCACTCCAGCTTTGAGGCGACGTGCGACTGAACCGGACGTGTTGGCATCGGTTCGTCTCTTGGATCCTGCTACGCGTCTACAAGGCCGCTGTTCCGCGTTCTTAAGTGCGGCTGTCGTCGCTGCGCCAATACATTTCCGATCAAATGTCACTGCGCGACTCTTGCGAACGCTTAATCCGGCGCGCTTTTTCTGTACCTTCGATGCCATTATGCCTCGTCCGCGTATACCTAGACGGGCCGTATGGAACTGGCAAAACCACAACTGGCAAACTGTTGTCGGAGGATACCCTTGCAGCCACTCTTTATGTTGCCGAGCCAATGGCGTATTGGAGAAATCATTTTGAAGATGTAATAAAGGGCGTATACGAAACACAGGAAAGAAAAGCTCGAGGTGACATAGCAACAACTGACGCAAAAGCAATTACGGCTGCTCTTCAACTGCAATTTTTCGCACCATACAGTTCCTTTCATACATATGCATCGACGTTATTTGGAGTCGAAGCGCCAGAAAGAACACCACCAGATATTACGCTCATAACTGATCGGCACCCGACCGCCGCATGTCTTTGCTTCCCAGCAGCTCGTTTTGTAGTGGGGGATATGAGCCTTAATACTCTATTGGCTATGATATCCCTAATTCCTCGCGAACCCCATGGTGGAAATATAGTAATAATGGATTTGAATGAAGATGAGCATCTTGAACGATTGAGAGCTCGCCAACGTCCTGGCGAAGCAATTGACGTACGCTTCTTGCGCGTATTACATAATATATATAAGATGTTTGTTAATACAATTTGGTATGCCAAACAAGCACCAATAATGTGGGACTGTGATAAATGGGACAAAGATTGGAGCTCGGTCCCAATATTTGATGACGATAGAAAGAAAATGTTAGAAGCGCGTGATTCAGTGCCTATTGTTGGTGGGAAAGAACGGCCAAGTCCATCAACGACTCTCTTGTCACTGTTCAAAGTACCTGAACTATGTGACGAATCATTTAGACTGCGTAAAGTCCATGAATGGAATCTGAGATGCGCATTAATTAAGTTGGCGGATTTGAATGCATATTTTATGGACATAAGTGGCAAGAGCCCCCAAGAGTGTGCCGCTGAAGTACGAGAGGCAACTAACGCGATGGACTTTACGCGCCTATCTTTTACCATGGCCGAGGATCTGGAACAAGCTGTTAACCAATACAATACCGAGATGACAATTAATTGATAAATATATTTGTTTTAAATAAAGCTCTGATGGGCGGTTCTGAAACTATGACGCATATGTGTGTTTATTGCCTGCCACATTTGTAAATGCACGCCTTCGCTACTCCCTATTTGTTTTACTGTTTGGAGACAGTTAGTATATGTTCACGCGAGAATATAATGCGCCATTCCGCCGAGAGGACCTAGGCGAGCTTTCTGGGACCTCACCGCGGAGCTAGTTTTCTCTACGCGGCCGCGGTTCTGTCCCAGGTAAAGCTAACCGGCCAACTTTAGAATGTCGCAGCTTACGGTGCTAATATATACAGTCATAGTTTTTGAGGTTGTAAGTGCGGCGTGGATAGGTGTCGGGGAAGAAGATATGAGTTTAAACTTTACTCATCACGTTATATCGCCAGATGTTCTTCGCCATGCCTTTACAGGAATAGTAACGGACAGTGGACCAACTGGGCGTAGCACATCTACAATTCATGTATCGTCGGTTCTCGGCGCGCCGTACGGAATAAATTCCACCGATCTGAGTAATCTAAAATGGATACATGCAACCACAATATTCTTCTTCGTTACCAACCCCAAAGGAACGAAGTTTACAGGTACTTTGCTATTCGTACCTAGAGAAGCGGGCATAAAATTCAGATCAATTGACTATCCTGACAGCGTTATGCTTGCGTCGCCCAATTTTGCACGTTCTCTAGCATGTTCTGCAACGCCGGATAATTTATCAGAATATGGAAAGATAAAACTTAAAGAACACGTCGACGATATAAAACATGTACGTCCTGTTCGGCCCAAGCCCAGTGGCTCAAATCCTCCAAAGGACATTGCTAAAATTTCATTTTCTGACATACTCCGTCCTTCCGAAGCATTTTTTGATCCCAAAACGC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4.一种鸭瘟疱疹病毒转移载体的制备方法，其特征是1)设计扩增UL24、TK和gH基因的引物根据鸭瘟疱疹病毒UL25、UL24、TK、gH和UL21基因的保守序列，设计兼并引物，位于TK基因内的兼并引物DP1和DP2DP15′TCTCGAC(T)GGA(G，C，T)GCA(G，C，T)C(T)AC(T)GG 3′DP25′GCGATTGGA(G)TGG(C，T)CG(T)A(G)TC 3′位于UL24基因内的兼并引物DP3 5′CGGCACGA(T)C(T)TTC(T)AA(G)C(T)TC 3′位于gH基因内兼并引物DP4 5′ATCATCGTACCA(G)TTAGG 3′位于UL25基因内兼并引物DP5 5′AGGCCCTIT(G)TTCG(A)TAT(C)TG 3′位于UL21基因内兼并引物DP6 5′GCTTAC(T)TTC(T)A(G，C，T)T A(G，C，T)TA(G)C(T)GG A(G，C，T)GG 3′2)通过PCR扩增获得UL24、TK和gH基因的序列利用设计合成的引物，通过5次兼并PCR分别克隆TK基因的保守序列、TK基因的上游侧翼序列FUL24-TK、FUL24-TK的上游序列FUL25-UL24、TK基因的下游侧翼序列FTK-gH和FTK-gH的下游侧翼序列FgH-UL21，将以上5个片段拼接，共得到8481bp的DNA序列，序列分析表明该序列含有完整的UL24、TK和gH基因；3)PCR扩增TK基因及其侧翼序列FTK2.9根据所得DNA序列的结果，设计2条引物上游引物为5′CCGGAATTCATTTGTCTGTGGTGTAAC 3′，下游引物为5′CCCAAGCTTAGTGCTGATGGTAGGAG 3′，使用这两条引物，通过PCR克隆大小为2.9kb的PCR产物FTK2.9；4)重组载体pUC-TK2.9的构建将FTK2.9通过EcoRI和HindIII酶切位点亚克隆入克隆载体pUC18，形成重组质粒pUC-TK2.9；5)转移载体pUC-TK2.9-lacZ的构建将载体pUC-TK2.9用HpaI内切酶切开，并且用小牛碱性磷酸酶去磷酸化，用PstI和EcoRI内切酶酶切质粒pSV-β-Galactosidase，切出lacZ表达盒，并且用T4DNA聚合酶将黏性末端补平，将线性化的pUC-TK2.9和lacZ表达盒平端相连接，构建重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
全文摘要
本发明提供的是一种鸭瘟疱疹病毒转移载体及其克隆方法。它是利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因，在获得以上3个基因序列的基础上，利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列，将其亚克隆入克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC－TK2.9，将1acZ基因表达盒插入载体pUC－TK2.9中的TK基因内，构建成的鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC－TK2.9－1acZ。本产品可用来构建鸭瘟疱疹病毒基因缺失疫苗。可用来构建重组活载体疫苗。
文档编号C12N15/869GK1635121SQ20041004410
公开日2005年7月6日 申请日期2004年12月8日 优先权日2004年12月8日
发明者王君伟, 韩先杰, 马波 申请人:东北农业大学