专利名称：可用于大规模生产的重组腺病毒伴随病毒生产方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术发明领域，涉及重组腺病毒伴随病毒的生产方法及获得的产品的用途，尤其是在基因治疗和转基因动物领域的用途。本发明是中国专利98101753.3(申请号)和98120033.8(申请号)的延续。
基因传递系统(gene delivery system)是基因治疗研究和应用的核心技术，包括病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体主要包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。其中腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus，AAV)载体因其安全、稳定、既可感染分裂细胞又可感染不分裂细胞、感染效率高、可长期表达外源基因等优点而受到关注。
AAV病毒是一种非致病性的微小病毒，基因组为4680nt的单链DNA。AAV病毒的生活周期有潜伏性感染和裂解性感染两种方式。AAV病毒的裂解性复制需要有辅助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)的参与。在没有辅助病毒存在时，AAV病毒以前病毒方式整合在宿主细胞染色体中。AAV基因组的末端分别有145nt的ITR序列，该序列是AAV病毒必需的顺式作用元件，在AAV病毒基因组的拯救、复制、包装和整合等功能中具有重要作用。两个ITR之间为反式作用的rep和cap基因，对AAV病毒DNA的复制和病毒颗粒的产生是必不可少的。Rep基因编码4种蛋白Rep78，Rep68，Rep52，Rep40，与AAV病毒的复制、整合、拯救等功能有关。Cap基因编码3种外壳蛋白，VP1，VP2，VP3，构成AAV的20面体外壳。
Samulski RJ等(Cloning of adeno-associated virus into pBR322rescue of intact virus from therecombinant plasmid in human cells，Proc.Natl Acad.Sci USA，792077-2031，1982)将完整的双链AAV DNA克隆于pBR322质粒中，发现位于质粒中的AAV前病毒基因组亦具有感染性。因此将外源基因表达单位置于AAV病毒的两个ITR之间，而rep和cap基因及辅助病毒的功能则由其它方式反式提供，在细胞中可获得含有外源基因的重组腺病毒伴随病毒(recombinantadeno-associated virus，rAAV)。
经典的rAAV产生方法是用双质粒共转染293细胞以及辅助病毒如5型腺病毒(Ad5)感染。双质粒中一个是重组AAV载体质粒，另一个为含有AAV rep/cap基因的辅助质粒。由于这种方法操作较复杂，影响rAAV产生的因素多，难以获得高滴度的rAAV，不易于扩大生产规模，因此许多研究者致力于改进rAAV的产生方法。这些改进包括以下几类1)将rep/cap基因转导到细胞株中，建成一种包装细胞系。其中的rep/cap的表达受其自身的启动子控制，或换成其它组成型或可诱导启动子。2)将AAV ITRs和其间的外源基因表达单位DNA插入腺病毒基因组中，构建成一种嵌合型重组腺病毒。3)将AAV ITRs和其间的外源基因表达单位DNA置于自主复制的EBV病毒载体中，转导至细胞中，建成一种携带具有自主复制能力的重组AAV载体质粒的细胞株。4)将rep/cap基因插入腺病毒基因组中，构建成一种具有完全辅助功能的重组腺病毒。然而许多实验证明，这种思路难以实现。可能是由于rep蛋白对腺病毒的强烈抑制作用使得含有rep/cap基因的重组腺病毒无法产生。5)用HSV病毒扩增子携带rep/cap基因，产生具有完全辅助功能的HSV混合病毒。
尽管在rAAV产生方法上的各种改进都不同程度地提高了rAAV病毒的产量或简化了其制备方法，然而这些方法仍然没有很好地解决rAAV病毒的规模化高效生产问题。目前要制备足够人体试验用量的rAAV病毒成本(包括时间成本和资金成本)仍然极高。因此发明一种可用于大规模高效生产rAAV病毒的方法十分必要。
本发明的目的在于提出一种可用于大规模制备的高效重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体的生产方法，即“一株载体细胞/一株辅助病毒”的生产方法。该方法具有产量高、操作简便、易于进行规模化和工艺化生产的特点。本发明可用来进行重组AAV病毒的大量生产，生产的重组AAV病毒可用于各种疾病的基因治疗。
制备rAAV病毒的传统方法是用双质粒共转染293细胞及用辅助病毒(5型腺病毒)感染细胞。其中双质粒包括重组AAV载体质粒如pAB11和含有AAV rep/cap基因的辅助质粒如pAd8。这种方法由于要对细胞进行转染，因此具有转染效率低或不稳定、操作复杂、不易于扩大规模和工艺化的缺点。虽然经过改进，用磷酸钙共沉淀方法可使293细胞的转染效率达到或接近100％，但转染方法难以用于大量的细胞及对293细胞本身的要求(代次低于50代，细胞呈扁平状，倍增时间为36hr～48hr)限制了用该方法获得大批量的rAAV病毒。
针对目前在rAAV生产中影响因素多、操作复杂、不利于规模化生产、从而难以获得高产量的rAAV病毒的弊病，本发明提出了“一株载体细胞/一株辅助病毒”的生产策略用携带了AAV病毒rep/cap基因的重组HSV-1病毒(HSV1-rc)感染稳定整合了重组AAV载体DNA的生产细胞株，从病变的细胞中可获得大量的rAAV病毒。HSV1-rc病毒可同时提供rAAV包装所必需的辅助病毒HSV-1及反式作用蛋白Rep及外壳蛋白，这两种功能通常是由野生型辅助病毒如Ad5或HSV-1及含有rep/cap基因的辅助质粒如pAd8提供。被包装进入重组AAV病毒颗粒中的重组AAV基因组DNA(单链)来源于重组AAV载体细胞株。重组AAV载体细胞基因组中稳定整合了一个或多个拷贝的重组AAV载体DNA，其中包含AAV病毒的两个ITR序列及位于其间的治疗基因表达单位。治疗基因表达单位由真核表达启动子(如HCMV IE启动子、SV40启动子、β珠蛋白基因启动子、可诱导启动子、各种组织特异性启动子等)、治疗基因、mRNA加尾信号组成，长度不超过5.0kb。
用rHSV-rc病毒感染载体细胞株时，HSV1-rc病毒进入细胞后其DNA大量复制并最终产生子代病毒。HSV1-rc病毒DNA复制时携带的rep/cap基因亦同步复制，从而产生高拷贝的rep/cap基因。rep基因编码产生4种Rep蛋白(Rep78，Rep68，Rep52，Rep40)，使重组AAV载体DNA从细胞基因组上拯救出来并大量复制最终成为单链被包装到AAV壳粒中；cap基因编码3种外壳蛋白VP1，VP2，VP3，在细胞核内组装成壳粒。
本发明产生rAAV病毒的过程与野生型AAV病毒在HSV-1为辅助病毒的情况下裂解性感染和增殖的过程十分相似，不同之处在于野生型的AAV病毒基因组的ITRs之间是rep/cap基因，辅助病毒是野生型的HSV-1；而本发明将rep/cap基因插入到辅助病毒HSV-1的基因组中，获得具有完全辅助功能的重组HSV-1病毒rHSV1-rc；AAV的ITRs及其间的治疗基因表达单位则由载体细胞株提供。用rHSV1-rc感染从载体细胞克隆中筛选出来的rAAV病毒产量高的单克隆细胞株，在一定的条件下可获得与野生型HSV-1辅助野生型AAV产生效率相近的rAAV病毒产生效率，用BHK细胞作为生产细胞时rAAV病毒产生率可达104～5particles rAAV/cell。
rAAV病毒的大量生产分4个步骤进行a)HSV1-rc病毒的大量生产。由于该病毒具有复制能力，很容易在BHK细胞或其它敏感细胞上大量培养，被感染的细胞将发生明显病变，在上清和细胞中都存在大量的有感染性的HSV1-rc病毒。上清中HSV1-rc病毒滴度可达到107pfu/ml；冻融法裂解细胞可得到108pfu/ml HSV1-rc病毒。对获得的病毒液经过低速离心除去细胞碎片就可用于下一步；b)大量培养载体细胞株。可采用转瓶培养、细胞发酵罐培养及其它高密度培养细胞的设备和方法；c)用HSV1-rc感染大量培养的载体细胞株。细胞发生完全病变后，裂解细胞得到的细胞裂解液，其中即含有大量的rAAV病毒。d)rAAV病毒的分离纯化。
本发明涉及携带AAV病毒rep/cap基因的重组HSV-1病毒HSV1-rc的制备及携带重组AAV载体的生产细胞株的建立。HSV1-rc病毒的制备方法和用途在中国专利98120033.8(申请号)中已有论述。HSV1-rc的产生是在对HSV1病毒全基因组分成5个大片段(其末端序列依次有部分重叠)插入其中的一套粘性质粒(Set C粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)进行操作的基础上实现的。首先，用体外重组DNA技术将AAV-2病毒的rep/cap基因插入其中一个粘粒的HSV-1基因组中，例如插入cos6的HSV1 UL2基因中构建成cos6-rcΔUL2；插入cos56的HSV1 UL44基因中构建成cos56-rcΔUL44。亦可将rep/cap基因插入HSV-1基因组的其它位置。上述过程在大肠杆菌中实现。将插入了rep/cap的重组粘粒DNA与相应的其余4个粘粒DNA一起用PacI酶切(切下粘粒骨架部分)，用酚/氯仿抽提纯化酶切的DNA，用脂质体方法或其它转染方法将其转染至BHK-21细胞或其它对HSV1病毒感染敏感的细胞中，5～7天后可观察到细胞出现病变和蚀斑，表明5个HSV1片段在细胞中发生同源重组产生了重组HSV1。分别挑取单个蚀斑进行检测，包括用PCR方法检测其中rep基因和cap基因片段，并检测其包装rAAV的功能。检测结果为阳性的即为插入了rep/cap基因的重组HSV1病毒(HSV1-rc)。对获得的HSV1-rc进行两次空斑纯化，以保证其纯一性。
携带重组AAV载体的生产细胞株即载体细胞株的建立将含有重组AAV载体DNA(AAVITRs及其间的治疗基因表达单位)的质粒用脂质体方法或其它转染方法导入细胞中，再经过新霉素类似物G418选择培养获得抗性细胞克隆。分别挑取单克隆细胞并扩大培养，筛选出在HSV1-rc感染下能产生高滴度rAAV病毒的稳定传代细胞株，大量冻存备用。选择基因neo可在重组AAV载体质粒上，位于AAV ITRs之间或在其之外的质粒骨架上；neo也可以在另一个质粒如pSV2neo上，用其与重组AAV载体质粒共转染细胞。
本发明的方法中BHK-21细胞是一种良好的rAAV生产细胞株。其它细胞如293细胞、KB细胞、HeLa细胞也可用来产生rAAV。
本发明产生的rAAV病毒中可携带各种目的基因。这些rAAV病毒可用于遗传病、肿瘤、心血管病、感染性疾病的基因治疗。
本发明所具有的优点本发明提供的方法可用于rAAV病毒的大规模生产。本发明采用的“一种载体细胞株/一种辅助病毒”的策略，克服了传统方法及各种改进方法中的操作复杂、影响因素多或难以放大生产等弊病，极大地简化了影响rAAV产生的因素和生产过程。其中的载体细胞株和全功能辅助病毒HSV1-rc及均具有稳定传代和扩增的特性，有利于生产放大。rAAV病毒产生过程中，AAV病毒的rep/cap基因可随辅助病毒HSV1-rc的复制而复制成高拷贝，模拟了野生型AAV病毒复制的过程，有利于产生高滴度的rAAV。本发明涉及的微生物菌种本发明涉及HSV1-rc制备中应用的微生物菌种包括DH5α/cos6-rcΔUL2和DH5α/cos56-rcΔUL44，这两株菌株于1998年9月24日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，登记入册编号分别为CGMCC No.0361-1和CGMCC No.0360-2。
实施例以下列举的实施例对本发明的可用于大规模生产的腺病毒伴随病毒生产方法及用途作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。实施例1 携带报告基因GFP的重组AAV载体质粒的构建1) pSNAV-1/GFP的构建GFP(绿色荧光蛋白)基因来源于pGreen Lantern-1(GIBCO BRL，#10642-015)。通用型AAV载体质粒pSNAV-1为本室构建(中国专利申请号 )。
用NotI酶切pGreen Lantern-1质粒DNA，回收GFP片段，插入pcDNA2.1质粒(Invitrogen公司)的相应位点中，构建成pcDNA2.1/GFP(+/-)。将GFP转录方向与T7启动子方向相反的重组质粒命名为pcDNA2.1/GFP(-)。用EcoR I和Xho I双酶切pcDNA2.1/GFP(-)，回收GFP片段，插入pSNAV-1的EcoRI和SalI位点中，构建成pSNAV-1/GFP。该质粒依次包括以下元件ITR-CMV-GFP-SV40 polyA-ITR-SV40启动子-neo-polyA-ampR-E.coli ori.。2) pSNAV-2/GFP的构建GFP(绿色荧光蛋白)基因来源于pGreen Lantern-1(GIBCO BRL，#10642-015)。通用型AAV载体质粒pSNAV-2为本室构建(中国专利申请号 )。
用KpnI和XhoI双酶切pcDNA2.1/GFP(-)，回收GFP片段，插入pSNAV-2的KpnI和Sal I位点中，构建成pSNAV-2/GFP。该质粒依次包括以下元件ITR-CMV-GFP-SV40 polyA-SV40启动子-neo-polyA-ITR-ampR-E.coli ori.。
该质粒与pSNAV-1/GFP的主要不同之处在于，在pSNAV-1/GFP中，neo基因的表达单位位于两个ITR序列之内；而pSNAV-2/GFP中，neo基因的表达单位位于两个ITR序列的之外。实施例2 AAV-GFP病毒载体细胞株的建立分别用pSNAV-1/GFP和pSNAV-2/GFP质粒转染BHK细胞经选择培养得到两株AAV-GFP病毒载体细胞株BHK/pSNAV-1/GFP和BHK/pSNAV-2/GFP。
BHK细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液37℃培养。将pSNAV-1/GFP和pSNAV-2/GFP质粒分别用脂质体lipofectamine(GIBCO BRL)转染BHK细胞，24hr后消化，12～5传代。加G418 800μg/ml选择培养。10天后可形成明显抗性细胞克隆。在倒置荧光显微镜下观察细胞克隆，挑取有绿色荧光的单细胞克隆各20个分别扩大培养并分别冻存保种。用全功能辅助病毒HSV1-rc感染各株克隆化细胞，检测发现各株细胞都不同程度地产生重组AAV-GFP病毒。分别测定重组AAV-GFP病毒的滴度。挑选出重组AAV病毒滴度高的细胞株作为AAV-GFP病毒载体细胞株。由载体细胞株BHK/pSNAV-1/GFP包装出来的重组AAV病毒颗粒中的基因组DNA(单链)长约1600nt，由两端ITR和其间的CMV-GFP-SV40 polyA组成。而由载体细胞株BHK/pSNAV-2/GFP包装出来的重组AAV病毒颗粒中的基因组DNA(单链)长约3700nt，由两端ITR和其间的CMV-intron-GFP-SV40 polyA-SV40 promoter-neo-polyA组成。实施例3 制备重组AAV-GFP病毒用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液37℃培养细胞。将5×106载体细胞BHK/pSNAV-1/GFP接种于15-cm培养板中，37℃ 5％CO2培养箱培养48hr。加全功能辅助病毒HSV1-rc 1ml(moi＝0.5～1)，吸附1hr。加含2％胎牛血清的RPMI1640培养液至30ml/培养板。37℃培养36～48hr。收集培养上清和细胞，反复冻融4次裂解细胞，用1500rpm离心10min，取上清，56℃灭活辅助病毒。用硫酸铵盐析法浓缩rAAV-GFP病毒，氯化铯梯度离心纯化。对PBS缓冲液透析除盐。保存于4℃或加5％甘油或蔗糖保存于-70℃。
权利要求
本发明属于生物技术发明领域，特别涉及用于基因治疗的重组腺病毒相关病毒载体(rAAV)的制备和用途。1.本发明的特征是采用“一株细胞/一株病毒”的方法制备rAAV病毒。
2.用“一株载体细胞/一株全功能辅助病毒”的方法制备rAAV病毒，包括(a)重组AAV载体细胞株的建立；(b)全功能辅助病毒的产生和制备；(c)用全功能辅助病毒感染载体细胞株，产生rAAV病毒。
3.通过将重组AAV载体质粒导入哺乳动物细胞并经过抗性选择培养获得稳定传代的重组AAV载体细胞株。
4.载体细胞株中含有稳定整合在染色体中的AAV ITRs及治疗基因表达单位。
5.将AAV病毒rep/cap基因插入单纯疱疹病毒基因组中构成全功能辅助病毒。
6.生产的rAAV病毒携带目的基因用于遗传病、肿瘤、心血管病、感染性疾病的基因治疗。
7.根据权利要求4，载体细胞来源于BHK细胞。
8.根据权利要求4，载体细胞来源于KB细胞、293细胞、HeLa细胞。
9.根据权利要求4，抗生素抗性基因由重组AAV载体质粒提供。
10.根据权利要求4，抗性基因由另一个质粒提供。
11.根据权利要求4，抗性基因为neo基因。
12.根据权利要求4，抗性基因为hph基因。
13.根据权利要求6，AAV病毒rep/cap基因插入I型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组中。
14.根据权利要求6，AAV病毒rep/cap基因插入II型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组中。
15.根据权利要求6，AAV病毒rep/cap基因插入I单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组的UL2和/或UL44中。
16.根据权利要求6，AAV病毒rep/cap基因插入单纯疱疹病毒载基因组的任何位点中。
全文摘要
本发明提出一种“一株载体细胞/一株辅助病毒”生产重组AAV病毒的方法。其中载体细胞株是将含有外源基因表达单位的重组AAV载体质粒导入哺乳动物细胞,经抗性筛选获得的整合了可拯救的重组AAV DNA的稳定传代的细胞株。辅助病毒是携带AAVrep/cap基因的重组HSV－1病毒。用这种全功能辅助病毒感染载体细胞株即可产生大量有感染性的重组AAV病毒。本发明可用于重组AAV病毒的规模化高效生产。
文档编号A61P43/00GK1252441SQ99119039
公开日2000年5月10日 申请日期1999年9月10日 优先权日1999年9月10日
发明者吴小兵, 伍志坚, 侯云德 申请人:病毒基因工程国家重点实验室