一种表达腺病毒的细胞株及高效制备腺病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，特别涉及一种表达腺病毒的细胞株及高效制备腺病毒 的方法。
【背景技术】
[0002] 腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳呈规则的20面体结 构。腺病毒家族（Adenoviridae)的成员可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括 来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。因为腺病毒 可将自身的基因组递送到细胞核中，宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、外源基因装载 容量大等优点，所以腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者，已广泛地被应用于基 础研宄和临床试验中。
[0003] 病毒载体作为新一代的转基因载体，在生物医药产业各环节都有广泛的应用前 景，具体表现在：
[0004] (1)病毒载体是研宄基因功能的必备工具。
[0005] (2)病毒载体是基因靶向治疗的利器。
[0006] (3)病毒载体是药物研发和筛选方案实施的强有力助力器。
[0007] 虽然有着广阔的应用前景，但由于其技术难度大，成本高，时空表达难以有效控制 等特点，使得病毒载体技术在生命科学领域的应用受到一定阻力。
[0008]目前根据需要已经开发三代腺病毒载体：E1区或者E1&E3缺失的载体被称作第一 代腺病毒载体；E2区或者E2&E4缺失的载体被称作第二代腺病毒载体；依赖于辅助病毒的 腺病毒载体（Helper-D印endent Ad，HD-Ad)通常也称作无偿腺病毒或者高容量载体被划分 为第三代腺病毒载体。
[0009]目前已有的腺病毒载体系统有三种：
[0010] 1、经典的双质粒共转染法（同源重组）
[0011] 原理是同源重组。在腺病毒左臂区域（通常缺失E1基因区）插入目的基因表达 盒构成腺病毒穿梭质粒，与带有腺病毒全基因组（通常缺失E1基因区）的大质粒共同转染 携带E1基因区的细胞如293细胞，两种质粒在293细胞内通过同源重组形成重组腺病毒基 因组，并包装成病毒颗粒。主要缺点是重组效率比较低。
[0012] 2、AdEasyTM 包装系统
[0013] AdEasyTM包装系统主要的特点是利用原核重组酶在大肠杆菌中完成外源基因插 入腺病毒基因组的过程，获得环状的重组腺病毒基因组，并且具有在细菌中复制的必需元 件。将重组腺病毒基因组酶切线性化后转染293细胞，避免了双质粒共转染得到重组腺病 毒难度大的风险。由于获得重组腺病毒质粒有明显的筛选方法，操作步骤也比较好掌握，因 此这个系统一出现就受到极大的欢迎。
[0014] 3、AdMax 包装系统
[0015] AdMax包装系统是通过Cre/loxP获得重组病毒，与目前使用最普及的AdEasy系 统相比，有一定的优势：AdMax系统只需要2~4周就能完成从质粒构建到重组出毒，因在 真核细胞内重组出毒，保持了对腺病毒的生存压力，有助于重组腺病毒的基因组的完整性； 而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34%，且在原核细胞（BJ5183)中完成病毒基因组重 组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会 受到影响。
【发明内容】
[0016] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种高效制备腺 病毒的技术。
[0017] 本发明的第一方面，提供了一种分离的细胞或细胞系，所述细胞高表达PVT1基 因。
[0018] 进一步地，所述"高表达"是指与野生型的细胞相比，高表达PVT1基因的细胞中 PVT1基因表达水平至少高出30%，较佳地至少高出50%，最佳地至少高出100%。
[0019] 进一步地，高表达PVT1基因的所述细胞中包含外源的PVT1基因。所述"外源的 PVT1基因"可以是，（a)在细胞中转染含有PVT1基因的载体；或者（b)将PVT1基因整合到 细胞的基因组中。
[0020] 进一步地，所述高表达PVT1基因的细胞中还包含腺病毒载体。
[0021] 进一步地，所述含有PVT1基因的载体以pHBLV-CMVIE-IRES-puro质粒为骨架。 pHBLV-CMVIE-IRES-puro 质粒序列如 SEQ ID N0. :4 所示。
[0022] 进一步地，所述腺病毒载体为pHBAd-U6_GFP质粒。
[0023] 优选地，所述细胞或细胞系为293A细胞或细胞系。
[0024] 优选的，所述PVT1基因的序列如SEQ ID N0. : 1所示。
[0025] 本发明的第二方面，提供了一种高效制备腺病毒的方法，包括步骤：
[0026] (1)制备高表达PVT1基因的细胞系；
[0027] (2)用高表达PVT1的细胞扩增腺病毒。
[0028] 进一步地，步骤（1)中所述细胞系为293A细胞系。
[0029] 优选地，步骤（1)中所述制备高表达PVT1基因的细胞系的方法包括步骤：
[0030] a)构建PVT1慢病毒载体；
[0031] b)慢病毒包装；
[0032] c)将包装好的慢病毒感染293A细胞。
[0033] 优选地，步骤a)中使用pHBLV-CMVIE-IRES-puro质粒构建PVT1慢病毒载体 pHBLV-CMVIE-IRES-puro-PVTl〇
[0034] 更优选地，使用构建载体过程中扩增PVT1基因所使用的引物序列为：
[0035] ACACGAATTCCTCAAGATGGCTGTGCCTGTCAGC(SEQ ID N0. :2);和
[0036] ACACGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTCTTAGTAGAAAAAGAA(SEQ ID N0. :3)。
[0037] 优选地，步骤b)中，病毒包装系统包括质粒pspax2、pMD2G和PVT1慢病毒载体。 pspax2质粒序列如SEQ ID N0. :5所示。pMD2G质粒序列如SEQ ID N0. :6所示。
[0038] 优选地，所述 PVT1 慢病毒载体为 pHBLV-CMVIE-IRES-puro-PVTl。
[0039] 优选地，步骤b)中，慢病毒包装细胞为293T细胞。
[0040] 优选地，步骤b)中，慢病毒包装过程为：
[0041] 培养 293T 细胞，胰酶消化后，加入 pspax2、pMD2G 和 pHBLV-CMVIE-IRES-puro-PVTl 组成脂转体系，转染12-24h后收集病毒。
[0042] 优选地，步骤c)中，将包装好的慢病毒感染293A细胞得高表达PVT1的细胞系。
[0043] 进一步地，步骤2)中，用高表达PVT1的细胞扩增腺病毒的方法包括步骤：
[0044] a)转染
[0045] 将重组腺病毒载体质粒转染步骤1)中获得的高表达PVT1基因的细胞系；
[0046] b)收毒
[0047] 转染后，采用反复冻融的方式收集病毒；
[0048] c)扩增
[0049] 用上一步骤收集的病毒，继续感染高表达PVT1基因的细胞系，进行扩增。
[0050] 优选地，步骤a)中，腺病毒载体质粒为pHBAd-U6-GFP。pHBAd-U6-GFP质粒序列如 SEQ ID N0. :7 所示。
[0051] 优选地，步骤a)中，转染体系包括：重组腺病毒载体质粒pHBAd-U6-GFP、骨架质粒 pHBAd-BHG、和 Lipofiter?脂质体。pHBAd-BHG 质粒序列如 SEQ ID N0. :8 所示。
[0052] 优选地，步骤c)中，至少扩增两次。
[0053] 技术效果
[0054] 使用本发明的技术方案进行腺病毒的包装，总病毒颗粒数提高了约60%，感染性 滴度提高了约10倍，说明本发明的技术方案特别适用于对腺病毒的高效制备。
[0055] 以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0056] 图 1 显示了 pHBLV-CMVIE-IRES-puro 载体图谱。
[0057] 图2显示了PVT1基因的PCR扩增结果。
[0058] 图3A显示了 PVT1慢病毒载体构建后的PCR电泳结果；图3B显示了 PVT1慢病毒 载体酶切鉴定的结果。
[0059] 图4显示了包装好的慢病毒感染293A细胞及WB验证的结果。图4A为对照病毒 (左图）和过表达PVT1目的病毒感染293A细胞（右图），显示病毒成功包装并感染293A 细胞。图4B为PVT1慢病毒感染293A细胞后wb鉴定结果。
[0060] 图5显示了重组腺病毒载体pHBAd-U6-GFP质粒图谱。
【具体实施方式】
[0061] AdMax包装系统中，腺病毒的重组和包装是将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒 与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293A细胞，利用Cre/loxP系统的作用实 现重组，产生重组腺病毒。那么293A细胞的状态和功能对于腺病毒的产毒效率，起到了非 常关键的作用。此发明中，本发明人通过对293A细胞中的PVT1基因的表达水平进行调控， 使得腺病毒的产毒效率得到极大的提升。
[0062]PVT1 基因
[0063] 本发明中优选地PVT1基因序列信息如下：
【主权项】
1. 一种分离的细胞或细胞系，其特征在于，所述细胞高表达PVTl基因。
2. 如权利要求1所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述高表达PVTl基因的细胞中包 含外源的PVTl基因；优选地，所述"外源的PVTl基因"可以是，（a)在细胞中转染含有PVTl 基因的载体；或者（b)将PVTl基因整合到细胞的基因组中。
3. 如权利要求1所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述细胞或细胞系为293A细胞或 细胞系。
4. 如权利要求1所述的细胞或细胞系，其特征在于，高表达PVTl基因的所述细胞中还 包含腺病毒载体。
5. 如权利要求1所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述HAS2基因序列如SEQID NO. : 1所示。
6. -种高效制备腺病毒的方法，其特征在于，包括步骤： (1) 制备高表达PVTl基因的细胞系； (2) 用高表达PVTl的细胞扩增腺病毒。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述细胞系为293A细胞系。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述制备高表达PVTl基因的细 胞系的方法包括步骤： a) 构建PVTl慢病毒载体； b) 慢病毒包装； c) 将包装好的慢病毒感染293A细胞。
9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，构建PVTl慢病毒载体过程中扩增PVTl基因 所使用的引物序列如SEQIDNO. :2和SEQIDNO. :3所示。
10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中，用高表达PVTl的细胞扩增腺病 毒的方法包括步骤： a) 转染 将重组腺病毒载体质粒转染步骤1)中获得的高表达PVTl基因的细胞系； b) 收毒 转染后，采用反复冻融的方式收集病毒； c) 扩增 用上一步骤收集的病毒，继续感染高表达PVTl基因的细胞系，进行扩增。
【专利摘要】本发明公开了一种高效表达腺病毒的细胞、及制备腺病毒的方法，经过发明人深入的研究，意外地发现，通过对293A细胞中的PVT1基因的表达水平进行调控，能够使得腺病毒的产毒效率得到极大的提升。使用本发明的技术方案进行腺病毒的包装，总病毒颗粒数提高了约60％，感染性滴度提高了约10倍，说明本发明的技术方案特别适用于对腺病毒的高效制备。
【IPC分类】C12N7-00, C12R1-93, C12N5-10
【公开号】CN104789532
【申请号】CN201510144095
【发明人】蔡晓龙, 陈意雄, 邹杰, 王丽莎, 朱鹏飞, 李明明, 杨龙飞, 许曼蒂, 万颖, 曹青, 卞正雅, 韦唯
【申请人】汉恒生物科技（上海）有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月30日