专利名称：一种稳定表达山羊miR-103的腺病毒载体的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种载体构建方法，具体而言涉及一种稳定表达山羊miR-103的腺病毒载体的构建方法及其应用。
背景技术：
MiRNA的成熟经历了 miRNA、pre-miRNA和pri-miRNA miRNA三种形式，三种形式均可构建其的表达载体，但是具有茎环结构的pre-miRNA比miRNA更稳定，pre-miRNA两侧的序列参与其的加工和成熟。另外，腺病毒载体具有转染效率高、感染细胞范围广、病毒滴度高等优点，可感染处于细胞周期中的静止期和分裂期细胞。构建重组腺病毒载体并在 293细胞中包装成熟病毒颗粒是应用腺病毒作为媒介表达目标基因的前提。绿色荧光蛋白 (GFP)是试验中广泛应用的一种蛋白指示剂，可作为观察测定病毒感染和外源基因表达水平。本研究选用的腺病毒系统是以Ad5血清型E1 /E3缺陷型腺病毒DNA为骨架， 穿梭载体PAdTrack-CMV携带有报告基因绿色荧光蛋白GFP，较易进行观察。首先克隆 pri-miR-103,并构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-pri-miR-103，然后将穿梭载体与腺病毒骨架pAdEasy-Ι载体在大肠杆菌BJ5183 (重组酶缺陷型大肠杆菌)中同源重组，获得稳定表达miR-103的重组腺病毒载体Ad-pri-miR-103，为进一步在细胞水平上研究miR-103对乳腺脂肪酸代谢的调控作用提供试验材料。过表达miR-103，可能引起乳腺脂肪酸代谢相关基因的表达量变化，进而改变脂肪酸的组成及含量，为提高山羊乳及其产品的营养价值提供一个新的切入点。
发明内容
为了构建腺病毒载体，本发明采用如下的技术方案本发明一方面涉及一种山羊miR-103的腺病毒载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤合成上、下游引物，以山羊miR-103DNA模板进行PCR扩增，其中所述上游引物为 5’ -CGC GATCGGTACCAA CAGAACATTTTGAG,下游引物 5，-CACGTGGGCTAAGCTTG CATATACAC CTACTACAT (下划线部分为酶切位点)；将pri-miR-103扩增产物与pAdTrack_CMV穿梭质粒同时进行Kpn I/Hind III双酶切；加入连接酶进行连接反应。在本发明的一个优选实施方式中，PCR扩增的循环为20-50，优选为30_40。在本发明的一个优选实施方式中，PCR扩增之后包括采用的琼脂糖凝胶电泳检测并回收产物的步骤。在本发明的一个优选实施方式中，其特征包括对病毒载体进行酶切线性化，优选用Riie I酶切线性化。本发明还涉及采用上述方法构建得到的腺病毒载体。本发明另外一方面还涉及所构建的腺病毒载体在基因重组中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于将PAdEasy-I病毒骨架先转化入大肠杆菌，再用线性化的载体进行同源重组。将克隆pri-miR-103-l(pre-miR-103及侧翼序列)至病毒的穿梭载体，保证了 pre-miR-103的加工和成熟，增加了 miR-103表达的稳定性。另外，将pAdEasy-Ι病毒骨架先转化入大肠杆菌BJ5183，再用线性化的穿梭载体pAdTrack-CMV-pri-miR-103转化BJ5183 进行同源重组，降低了假阳性的比例，提高了重组效率。
图1. pri-miR-103的PCR扩增产物凝胶电泳结果；图2.连接酶连接后质粒经Kpn I和Hind III酶切产物凝胶电泳结果，片段较小的电泳产物为 pri-miR-103-l，长 300bp ；图3.重组腺病毒pAd-pri-miR-103-l的凝胶电泳结果。
具体实施例方式1. 1. 1 山羊 pri-miR-103 的克隆上、下游引物分别引入Kpnl和Hind III酶切位点，以山羊pri_miR-103DNA模板进行 PCR 反应:94°C,3min ；94°C，20s ；60°C, 30s ；72°C，30s ；34 个循环；72°C，5min。的琼
脂糖凝胶电泳检测并回收产物。产物送测序。
权利要求
1.一种山羊miR-103的腺病毒载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤合成上、 下游引物，以山羊DNA模板进行PCR扩增，其中所述上游引物为5，-CGC GATCGGTACCAA CAGAACATTTTGAG,下游引物 5，-CACGTGGGCTAAGCTTGCATATACAC CTACTACAT ；将 pri-miR-103 扩增产物与pAdTrack-CMV穿梭质粒同时进行Kpn I/Hind III双酶切；加入连接酶进行连接反应。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于PCR扩增的循环为20-50，优选为 30-40。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，PCR扩增之后包括采用的琼脂糖凝胶电泳检测并回收产物的步骤。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征包括对病毒载体进行酶切线性化，优选用 Pme I酶切线性化。
5.权利要求1-4任意一项所述的方法构建得到的腺病毒载体。
6.权利要求5所述的腺病毒载体在基因重组中的应用。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于将pAdEasy-Ι病毒骨架先转化入大肠杆菌，再用线性化的载体进行同源重组。
全文摘要
本发明公开了一种山羊miR-103的腺病毒载体的构建方法及其应用，其特征在于包括如下步骤合成上、下游引物，以山羊miR-103DNA模板进行PCR扩增，其中所述上游引物为5’-CGC GATCGGTACCAACAGAACATTTTGAG，下游引物5’-CACGTGGGCTAAGCTTG CATATACAC CTACTACAT；将pri-miR-103扩增产物与pAdTrack-CMV穿梭质粒同时进行Kpn I/HindⅢ双酶切；加入连接酶进行连接反应。该方法增加了miR-103表达的稳定性，再同源重组时能够降低了假阳性的比例，提高了重组效率。
文档编号C12N15/66GK102286516SQ201110207230
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月25日 优先权日2011年7月25日
发明者余康, 张犁苹, 朱江江, 林先滋, 罗军, 赵旺生 申请人:西北农林科技大学