专利名称：人类特发性基底节钙化致病基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人体变异的基因，即人类特发性基底节钙化(IBGC)致病基因SLC20A2。本发明还涉及这种变异基因及其编码的蛋白在检测和作为治疗IBGC疾病的药物靶点中的作用和意义。
背景技术：
特发性脑基底节I丐化(IdiopathicBasal Ganglia Calcification, IBGC)俗称Fahr病，是一种先天性神经系统锥体外系疾病，大脑X-射线电子计算机断层扫描(CT)发现率为1-2% [1_2]。大多数IBGC家系表现为常染色体显性遗传方式，也有常染色体隐性遗传和性染色体连锁遗传的报道。IBGC症在CT上表现为大脑双侧对称性基底节钙化。常见钙化部位的发生顺序是苍白球、尾状核、壳核、丘脑、额顶叶脑回底部、齿状核、小脑皮层、脑干中央部及侧脑室周围，在CT上可表现为卵圆形和或八字形高密度影，常为对称性。患者运动能力逐渐受损或丧失，智力和意识表现痴呆、癫痫、精神障碍等，目前尚未有针对性药物治疗该病。其发病机制不清楚，对其进行分子遗传学研究有望克隆其致病基因，为寻找药靶、开发相关药物及治疗该病奠定基础。目前该病定位3个致病位点14ql3 (IBGCl)、2q37(IBGC2)和8p21. 1-qll. 23(IBGC3)，其中IBGC3位点是我们定位的。该病的致病基因尚未克隆，因此对IBGC致病基因进行系统研究，将对大脑基底节钙化的诊断、开发针对性的药物及治疗具有十分重要理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的在于提供IBGC致病基因，定位出该疾病的基因突变位点，以及利用该疾病的基因突变位点检测人体中是否存在该基因突变的方法。同时提供IBGC致病基因编码的蛋白质序列及其突变导致的细胞磷吸收下降，为阐明该病的致病机制提供了基础，为进一步治疗该病提供了设计药物的靶点。本发明真对收集并鉴定的一个IBGC大家系进行微卫星标记的连锁分析，排除了与IBGCl和IBGC2的连锁关系，但将该家系的致病基因定位于IBGC3位点，进一步连锁缩短了 IBGC3位点即将8p21. 1-qll. 23 (25Mb物理图距，12. 29cM遗传图距)缩短在.8pl2-qll. 23(19. 5Mb物理图距，6. 40cM遗传图距)染色体区段。本发明对定位于8pl2-qll. 23区域内特发性基底节钙化的41个候选基因进行双向测序，在第一个家系中发现SLC20A2基因一个点突变；在第二、三个家系中，发现该基因三个新点突变，第二个家系先征者存在两个点突变，一个突变来自父亲，第二个突变来自母亲。随后在巴西和西班牙IBGC家系中发现该基因四个新的突变包括两个缺失突变和两个点突变。上述的八个突变分别在各自家系中所有患者的DNA样品上均得到验证，在家系正常成员、508例正常汉族人群和96例欧洲人群中不存在上述突变，排除了单个核苷酸多态性的可能性。同时发现这些突变造成所编码的氨基酸缺失、移码和改变，由此，本发明提供了 8种如SEQ ID NO 2~9所示的变异的人类SLC20A2基因，其特征分别在于，所述SLC20A2基因编码区第124-126缺失3个碱基(鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤即GTG)、第362位胞嘧啶被鸟嘌呤替换(C > G)、1409位胞嘧啶碱基缺失(delC)、1492位鸟嘌呤碱基被腺嘌呤替换(G > A)、第1723位鸟嘌呤碱基被腺嘌呤替换(G > A)、第1784位胞嘧啶碱基被胸腺嘧啶替换(C > T)、第1802位胞嘧啶碱基被鸟嘌呤或胸腺嘧啶替换(C >G/T)。正常的人类SLC20A2基因的核苷酸序列如SEQ ID ΝΟ:1所示。本发明提供了 8种如SEQ ID NO :45_52所示的变异的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质序列，其特征分别在于，SLC20A2蛋白的氨基酸序列分别是第42位Val缺失(p. V42del)、第 121 位的 Ser 变为 Cys (p. S121C)、从 470 位的 Pro 移码(p. P470Lf sX37) 37个氨基酸终止、第498的Gly突变为Arg (p. G498R)、第575位Glu突变为Lys (p. E575K)、第595位的Thr突变为Met (p. T595M)及第601位的Ser突变为Trp或Leu (p. S601W/L)。正常的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 44所示。本发明还提供了一种检测来源于人体的生物样本中是否存在所述基因的突变方法，其步骤(1)从所述样本中提取和纯化基因材料；(2)对所述基因材料进行聚合酶链扩增(PCR)反应，获取PCR产物； (3)对所述PCR产物进行核苷酸序列测定，与SEQ ID NO : I序列比对，以确定所述生物样本中是否含有SLC20A2基因突变。优选地，所述生物样本为体液，该体液包括但不限于血液、血浆、羊水、淋巴液等。优选地，所述体液为血液。优选地，在上述PCR反应中使用的引物对为SEQ ID NO :10和11 ;12和13 ;22和23 ;26和27 ;28和29。本领域技术人员还可以使用SEQ ID NO :14和15 ;16和17 ;18和19 ；20和21 ；24和25的引物对扩增相应核苷酸序列。本发明还提供了检测来源人体的生物样本中是否存在上述八种突变的方法，其步骤包括1)从所述样本中提取和纯化基因材料；(2)对所述基因材料进行聚合酶链扩增(PCR)反应，获取PCR产物；(3)对所述PCR产物进行限制性内切酶酶切；(4)对所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察和拍照电泳图，与表2相关酶切产物大小比对，以确定所述生物样本中是否含有SLC20A2基因上述八种突变。优选地，所述体液为血液或羊水。优选地，在上述PCR反应中使用的引物对为SEQ ID NO :30和31 ;32和33;34和35 ；36 和 37 ；38 和 39 ；40 和 41 ；42 和 43。优选地，上述PCR产物中使用的6种限制性内切酶Hpa I、EcoR I、Bam HI、HindIII、Sph I 和 Sac I。本发明还提供了变异的人类SLC20A2基因功能改变，如附图6所示，该基因编码的蛋白是分布在细胞膜上钠磷共转体，对细胞维持磷的内稳态非常重要，SLC20A2基因突变导致该共转体功能下降，从而导致细胞对磷的吸收下降(见实施例4)，打破了这种内稳态，使细胞外积累大量的无机磷以至于与基质中钙结合形成磷酸钙颗粒，长期积累而导致基底节钙化。因此人类SLC20A2变异基因可以作为药物的靶点，开发相关药物治疗人类大脑基底节钙化提供了科学依据。根据发明人提供的SLC20A2基因序列变异的位点，应用本发明提供的检测来源于人体的生物样本中是否存在所述基因的突变方法，对七个特发性基底节钙化家系所有个体进行突变检测。结果发现八个突变包括两个缺失突变和六个点突变，而家系正常成员、508例正常汉族个体和96例欧洲个体中不存在上述突变。证明本发明提供的方法能够精确诊断由SLC20A2基因突变导致的IBGC疾病。同时对该基因突变所编码的蛋白质进行功能分析，发现SLC20A2突变会导致细胞对磷的吸收下降，从而导致人的基底节钙化。一方面为颅内钙化患者是否是该基因突变导致的提供病因诊断依据；另一方面在无临床表现人群中进行该基因突变筛查，提供优生优育指导；第三，为治疗该类基底节钙化疾病提供药物靶点。
以下将通过实施例和附图对本发明作进一步的说明。 图I为家系2中IBGC先证者(a和b)和先证者父亲(C)及母亲(d)的脑CT图，a_b表明先证者的颅内广泛钙化-双侧大脑半球(额叶、顶叶、颞叶和枕叶)皮质、基底节、丘脑下部和双侧小脑；其父亲(C)双侧豆状核、尾状核和丘脑下部钙化；而其母亲(d)仅仅左侧苍白球轻度钙化。图2为IBGC家系I (a)和家系2 (b)的系谱，箭头代表先证者。图3为IBGC家系I和2致病基因在8号染色体的定位区域。图4为SLC20A2基因8个突变序列SEQ ID NO :2_9与正常序列SEQ ID N0:1在突变位点的对比示意图，箭头表示突变发生开始位置或突变位置a，突变发生在编码区第124-126缺失3个碱基(鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤即GTG) ；b,突变发生在第362位胞嘧啶被鸟嘌呤替换；c，突变发生在1409位胞嘧啶碱基缺失(delC) ;d，突变发生在第1492位鸟嘌呤碱基被腺嘌呤替换(G > A) ;e，突变发生在第1723位鸟嘌呤碱基被腺嘌呤替换(G >A) ;f，突变发生在第1784位胞嘧啶碱基被胸腺嘧啶替换(C > T) ;g，h，突变发生在第1802位胞嘧啶碱基被鸟嘌呤或胸腺嘧啶替换(C > G/T)。图5为家系I (图a)和家系2 (图b)突变验证图。示相关突变与该家系疾病共分离。图6发明人发现IBGC致病基因的8个突变转染CHO细胞对磷吸收的影响图。示这些突变体与野生型(32磷吸收设为100)相比32磷吸收值。图7为具体实施方式
中的PCR反应程序(a)和单链扩增PCR反应程序(b)。
具体实施例方式实施例I : IBGC3致病位点的精细定位I、家系收集与鉴定发明人通过对先征者及其家庭进行医学检查和临床诊断，采集了第二个常染色体显性IBGC家系(四代8名患者，先证者的脑CT如图1，对称性基底节钙盐沉积，血清中生化检查各项指标正常，符合IBGC的临床特征。系谱图如图2b)的外周血样本。2、基因组DNA提取使用美国Promega公司的Wizard Genomic DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。
3、IBGC致病位点连锁分析首先对已报道的3个IBGC定位位点区域的微卫星标记进行连锁分析，排除了该家系致病基因与IBGCl和IBGC2区域的连锁。初步将第二个IBGC家系的致病基因定位在IBGC3位点，对连锁位点的染色体上下游区域，从LMS V2. 5-MD5和Genethon连锁图谱(Dib等1996)微卫星标记中，选用含较高信息量的微卫星标记，由上海基康生物技术公司合成引物并加荧光标记，对致病基因所在位点进行精细定位，根据交换发生的位置，确定致病基因在染色体上的精确位置。进一步的精细定位将IBGC3位点即8p21. 1-qll. 23 (25Mb 物理图距，12. 29cM 遗传图距)缩短在 8pl2-qll. 23(18. 5Mb 物理图距，6. 40cM遗传图距)染色体区段(图3)。基因的染色体定位技术在分子遗传学领域对于本领域的研究人员而言是已知的技术，本发明是利用该技术发现可能导致人类疾病的变异基因。实施例2 =IBGC致病基因的克隆I、候选基因的筛选
发明人根据基底节钙化的病理机制和基因结构与功能特点，优先选择大脑表达以及与神经系统异常相关的基因作为候选基因，发明人在已定位的IBGC区段(8pl2-qll. 23)内选择 41 个候选基因 UNC5D，ZNF703, KCNUl，ERLIN2，PROSC, RABlIFIPl，EIF4EBP1，ASH2L，LSMl，BAG4, DDHD2, PPAPDC1B, WHSC1L1, LETM2, ADAM9, ADAM2, ZMAT4, G0LGA7, AGPAT6,NKX6-3, ANKl，PLAT, IKBKB, DKK4, UDAC3, SLC20A2, CHRNB3, CHRNA6, POLB, THAPI, SGK196,HGSNAT, MCM4, EFCABI, SNAI2, CEBPD, UBE2V2, SNTGl, PXDffL, PCMTDl 和 ST18。2、基因组DNA提取使用美国Promega公司的Wizard Genomic DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。3、对候选基因进行测序发明人根据外显子特异的PCR扩增引物用Primerf软件设计(如表I所示)，并由上海桑尼生物有限公司合成这些引物，对样本目标片段进行PCR体外扩增，扩增片段包含了 SLC20A2基因编码区所有外显子、外显子-内含子交界处序列，序列来源为EnsembleGenome Browser，扩增片段大小如表I所示。测序选择家系先征者以及一名正常个体同时进行，使用ABI公司商品化的试剂盒，在全自动测序仪上完成，所有扩增片段的都会进行双向测序，测序结果与Ensemble Genome Browser数据库中SLC20A2基因的正常序列比对分析。成功地克隆了 IBGC致病基因SLC20A2，正是由于该基因发生了突变导致了 IBGC疾病的发生。第一个家系中，突变发生在第8外显子编码区(c. 1492G>A/p.G498R)(图4d);第二、三个家系中，突变发生在第11个外显子编码区(同一个位的碱基发生不同的突变)(c. 1802C> G/p. S601W ；c. 1802C > T/p. S601L)(图4g和h);第二个家系先征者存在两个突变，一个突变来自父亲(c. 1802C > G/p. S601W)，第二个突变来自母亲(c. 362C > G/p. S121C，图4b)。随后在巴西和西班牙IBGC家系中发现该基因四个突变分别是c. 124-126delGTG/p. V42del (图 4a)，c. 1409delC/p. 470Lfs37X(图 4c)，c. 1723G > A/p. E575K(图 4e)，c. 1784C > T/p. T595M(图4f)。上述的八个突变分别在各自家系中所有患者的DNA样品上均得到验证，在508例正常汉族人群和96例欧洲人群中不存在上述突变，排除了单个核苷酸多态性的可能性。八个突变序列和正常人的序列比对示意图如图4所示。表I IBGC家系SLC20A2基因编码区所有外显子测序引物
权利要求
1.一种变异的人类SLC20A2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO :2至9中任一序列所示。
2.权利要求I所述的变异的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQID NO 45至52中任一序列所示。
3.权利要求I所述的变异的人类SLC20A2基因在制备人类特发性基底节钙化疾病基因诊断芯片中的应用。
4.权利要求2所述的变异的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质作为治疗人类特发性基底节钙化疾病的药物靶点。
5.—种体外检测SLC20A2基因突变的试剂盒，含有以下10对引物中的一对或几对或全部
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有Taq酶、缓冲液和dNTP。
7.—种体外检测SLC20A2基因突变的试剂盒，含有以下7对引物中的一对或几对或全部
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还含有Taq酶、缓冲液和dNTP。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，还含有限制性内切酶HpaI.EcoRI、Bam HKHind III、Sph I 和 Sac I0
全文摘要
本发明提供了一组变异的人类SLC20A2基因，并揭示了该变异的人类SLC20A2基因为特发性脑基底节钙化疾病的致病基因。利用该变异的人类SLC20A2基因，可以对特发性基底节钙化疾病进行诊断和患病风险评价。本发明还提供了由所述的变异的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质，该蛋白质可作为治疗该类基底节钙化的药物靶点。此外，本发明还提供了用于特发性基底节钙化疾病诊断的试剂盒，以及变异的人类SLC20A2基因在制备人类特发性基底节钙化疾病基因诊断芯片中的应用。
文档编号C12Q1/68GK102888406SQ201110207219
公开日2013年1月23日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者刘静宇, 张学, 王程, 李雨雷, 石磊, 任杰 申请人:武汉淘智生命科技有限公司