专利名称：一种改进的生产β-甘露聚糖酶的方法
技术领域：
本技术属于生物技术领域，提供了一种改进的生产β-甘露聚糖酶的方法，以及β -甘露聚糖酶水解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的应用。
背景技术：
植物细胞壁包含2种主要的多糖纤维素和半纤维素。由β -1,4-D-糖苷键连接的半纤维素主要由甘露聚糖组成。甘露聚糖大部分存在于初级植物细胞壁中，在次级细胞壁中含量较少。全世界每年产生大量含有甘露聚糖的农业废弃物。在东南亚，每年产生数百万吨含有甘露聚糖的棕榈仁饼。在南美洲，咖啡产业和椰子油产业产生数百万吨的咖啡废物和椰子饼。棕榈仁饼、椰子饼由于富含甘露聚糖等抗营养因子，只能作为低级的反刍动物饲料。β -甘露聚糖酶是一类能够水解含β-1，4-甘露糖甘键的甘露寡糖和甘露多糖 (包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等)的内切水解酶。甘露聚糖酶处理过的棕榈仁饼和椰子饼已经显示出良好的饲料价值，可以在畜禽饲料中使用。另外，甘露聚糖酶在造纸业和去污剂行业已经有良好的作用。当用包含甘露聚糖的生物材料生产生物燃料成为现实以后，甘露聚糖酶会越来越重要。毕赤酵母是一种甲基营养性酵母，能在普通培养基中产生较高细胞密度。它优良的表达系统可以产生大量的酶和蛋白质，比如,葡聚糖酶、木聚糖酶、鞣酸酶、植酸酶和甘露聚糖酶。现有技术中，生产甘露聚糖酶的技术如下PCT W0/1999/024588公布了一个来源于番茄的具有编码β-甘露聚糖内切酶的cDNA克隆体，用启动子过度表达这个基因可以加快果实的成熟。PCT W0/1993/024622公布了一个编码甘露聚糖内切酶的木霉的DNA序列，并将其导入到酵母或者真菌，诱导产生甘露聚糖内切酶，也是一种分离编码甘露聚糖内切酶基因的方法。PCT W0/2006/126589公布了蜗牛，尤其是太平洋鲍鱼，产生的一种甘露聚糖酶的特性，以及适用于水产领域大量生产酶制剂的技术。PCT W0/2008/062317公布了咖啡豆产生的β-甘露聚糖酶、编码该蛋白的多核苷酸、表达系统以及含有该多核苷酸的宿主细胞。PCT W0/2001/098462和美国专利6，984，406公布了一株可产生在中性和酸性培养基中表现高酶活的甘露聚糖酶的芽孢杆菌菌株。甘露聚糖酶在饲料中用作添加剂，在半纤维素的分解中有很好的作用。PCT W0/2004/113538公布了一个地衣芽孢杆菌WL-12的编码甘露聚糖酶的新基因，一个携带这个基因的重组质粒以及一个包含重组质粒的大肠杆菌转化体。甘露聚糖酶把半乳甘露糖降解为甘露糖、甘露二糖和甘露三糖，酶在中性PH值和适当温度条件下具有较高的活性，这个条件是动物生理条件相近。PCT W0/2003/012110 和美国专利 7,112,429 公布了 Acidothermuscellulolyticus产生的耐热甘露聚糖酶。此项发明进一步公布了制造ManA重组型的方式以及酶制剂在食品加工和食品添加剂中的应用。PCT W0/1994/025576公布了棘孢曲霉CBS. 101. 43.产生的能表现甘露聚糖酶活的酶，认为这种酶用于降解或者改良植物或藻类细胞壁材料。PCT W0/2008/009673揭示了一个野生型里氏木霉产生的甘露聚糖酶的突变体及其核酸和氨基酸序列，该突变体插入、删除和/或替代了一段氨基酸，具有更高的热稳定性、蛋白水解稳定性、比活性、低PH条件下的稳定性。PCT W0/2000/077155,W0/1999/009126,ff0/2000/042146,and W0/1999/009128 公布了一个包含甘露聚糖酶的配方，提高对于食品、化妆品脏污以及增白剂可能更好的清洁性能。PCT W0/1995/014809公布了用甘露聚糖酶制备漂白纤维素纸浆的工艺。
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PCT W0/2001/062951 and W0/2001/064932公布了一个用乳化剂和甘露聚糖酶复合处理椰子柏生产改性椰子柏的工艺。通过这种方法，可以有效、经济的释放甘露聚糖。PCT W0/2001/064830公布了一个含有纤维素内切酶、木聚糖酶、β -甘露聚糖酶和/或α-淀粉酶的复合酶制剂处理方木中酿酒单宁酸的工艺。PCT W0/2003/062409公布了一个针对动物饲料的至少含有2种耐热酶的配方，
这2种酶是从葡聚糖内切酶，木聚糖酶，植酸酶，蛋白酶，半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，聚糖酶，a_半乳糖苷酶中筛选出来的。首选的木聚糖酶从曲霉，芽孢杆菌属，腐质霉属，茶毒菌属和木霉属分离获得。PCT W0/1996/036569公布了 I个阻止或者去除表面生物膜的配方，其中至少含有甘露聚糖酶，选择性地和糖酶、蛋白酶、脂肪酶以及糖蛋白酶中的至少一种组合。PCT W0/2001/075084公布了从咖啡中获得的至少可以编码一种酶的DNA片段，这个酶可以水解由直链或支链甘露聚糖通过1，4_糖苷键连接组成的多糖。PCT W0/1994/020667公布了一种用酶预处理木材原材料的工艺，本处理可以减少机械打浆的能耗，提高纤维的性能，所用的酶为纤维二糖水解酶和甘露聚糖酶。PCT W01998/020750公布了甘露聚糖酶制剂在提高饲料植物蛋白原料价值的应用。PCT W0/1997/041739公布了在低能饲料中添加半纤维素酶(如甘露聚糖酶)提高单胃动物能量利用率的方法。PCT W0/2005/003319 and PCT W0/2007/095398 公布了甘露聚糖酶活性的多肽。美国专利7，148，399公布了从咖啡中获得的至少可以编码一种酶的DNA片段，这个酶可以水解由直链或支链甘露聚糖通过I，4-糖苷键连接组成的多糖。美国专利6，566，114公布了由芽孢杆菌1633基因编码的新的甘露聚糖酶。该甘露聚糖酶为碱性，可用作清洗剂成分，以及用在压裂液中用于压裂地层，用于改良植物材料，以及用于处理纤维织物。美国专利6，060，299公布了一个枯草芽孢杆菌168多核苷酸分子编码产生的新甘露聚糖酶。该甘露聚糖酶为碱性，可用作清洗剂成分，用于改良植物材料，以及用于处理纤维织物。美国专利4，895，800描述了克隆载体；毕赤酵母中甲醇诱导启动子的使用以及变性蛋白的表达。有关在毕赤酵母中蛋白表达平台的信息，比如，启动子、转化方法等，在美国专利 4，683，293 ;4，808，537 ;4，812，405 ;4，818，700 ;4，837，148 ;4，855，231 ;4，857，467 ；4，879，231 ;4，882，279 ;4，885，242 ;4，929，555 ;5，002，876 5，004，688 5，032，516 ；5，122，465 ;5，135，868 ;5，166，329 中可以见到。
发明内容
首先，本发明提供了一种β -甘露聚糖酶的高产方法。包括以下步骤(I) 一种合成的甘露聚糖酶基因与DNA载体中的启动子结合，产生一个表达框；(2)将DNA载体接种到一个酵母细胞中，接种的酵母是巴斯德毕赤酵母，属于毕赤酵母属；(3)小规模培养条件下，通过测定β_甘露聚糖酶活性筛选出高表达菌株；(4)在500L的生物反应器中，筛选高表达甘露聚糖酶的菌株，高表达甘露聚糖酶的菌株产生4305U/mL的β -甘露聚糖酶酶活。 表达框由一个指示β -甘露聚糖酶分泌到细胞外培养液中的信号肽组成。首选的信号肽是α -因子，β -甘露聚糖酶成熟肽被插入到完整α -因子编码序列的下方，并且表达框与外膜蛋白进行了结合，因而可以使表达的β_甘露聚糖酶分泌到细胞外，这有利于酶的获得和活性的提高。其中β_甘露聚糖酶基因含有Seq IDl序列的主要部分，Seq IDl的多核苷酸序列号见序列表所不。β -甘露聚糖酶基因是一种含有与SeqIDl有至少85%同源性片段的多核苷酸。启动子是一个诱导型启动子，易受酒精诱导，作为巴斯德毕赤酵母的AOXl启动子最易受甲醇诱导。其次，本发明提供了一个改进的水解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的方法，水解后的产物为适合液体生物燃料生产和动物饲用的游离糖。用β_甘露聚糖酶对甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的水解方法包括以下步骤(I)对含有甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等的底物进行预处理。(2)将含有β_甘露聚糖酶的酶混合物的缓冲液和预处理后的底物进行培养。预处理可以增加底物与酶的接触机会；反应时需向体系中添加一定量的缓冲液，并调节pH在4. 5-6. 5之间，最好为5. 5，然后再向预处理底物中添加低浓度的Mn2+、Co2+和Fe2+的盐溶液，离子浓度大约在O. l-10mmol/L之间。酶的混合物含有甘露聚糖酶。水解的底物是富含甘露聚糖的棕榈柏和椰子柏等。
图I :不同金属离子和化学试剂对甘露聚糖酶的影响。a代表与对照组相比差异显著(P < O. 05)。图2 :生物反应器培养基中甘露聚糖酶的积累。2-9泳道分别表示甲醇诱导后24、36、48、50、64、76、96和108小时后收集的样品。每一个泳道加入4μ I的培养基上清液。M泳道是Bio-Rad蛋白标记(Catalog#161-0373)。I号泳道是诱导之前的培养基上清液。图3A :甘露聚糖酶的最适pH值。被测pH值的变化范围是I. 5-10.0，在其中确定最适pH。图3B :不同pH值条件下甘露聚糖酶的稳定性。在pHl. 0-10. O的缓冲液中培养I小时后的残余酶活。
图4A :甘露聚糖酶的最适温度。在20_80°C的温度范围内测定酶的活性，确定最适温度。图4B :甘露聚糖酶的热稳定性。在30°C、40°C、5(TC、6(rC和70°C温度下培养150分钟后的残余酶活。
具体实施例方式实施例I : β -甘露聚糖酶基因的化学合成基因序列通过DNA Star程序分析，预测化学合成了一个编码分子量为35. SkDa含有355个氨基酸的甘露聚糖酶前体蛋白基因，这个前体蛋白能在Glyl8和Alal9之间被切开，产生一个分子量为35.8kDa的由317个氨基酸组成的成熟蛋白。在NCBI数据库中对甘露聚糖酶进行blast序列比对，结果显示在氨基酸水平上与黑曲霉C513. 88的假定蛋白·Anl5g07760有98 %的相似度，而与硫色曲霉、棘孢曲霉和里氏木霉中的同源蛋白分别只有6. 6%,9. 3%,8. 7%相同。实施例2 :表达甘露聚糖酶基因的巴斯德毕赤酵母转化株的构建为构建巴斯德毕赤酵母表达载体，利用引物 5’CCGGAATTCGCTTCCAACCAGACTCTGTCCTAT 和 5’ATATGCGGCCGCTTAAGCCCCCTCCCAGTTCAGAGC扩增编码甘露聚糖酶成熟肽(根据预测从Gly18到Ala335)的DNA序列。用限制性内切酶EcoRI和NotI将PCR产物酶解，并将酶解产物插入到pPIC9的相应位点，形成P-甘露聚糖酶。按照毕赤酵母表达试剂盒的说明书制备巴斯德毕赤酵母电转感受态细胞，并将质粒DNA通过电泳方式转入已制备好的感受态细胞(Invitrogen，USA)。利用BglII将10 μ gP-甘露聚糖酶酶切使之线性化(New England Biolabs, USA)。比较MD板上形成的菌落在ImL BMMY (来自3mL BMGY次代培养细胞)培养基中的甘露聚糖酶活性。1000多个转化株中有54个表现出β -甘露聚糖酶活性，再从这54株中筛选甘露聚糖酶酶活最高的菌株在500L的生物反应器中进行大规模的酶生产。实施例3 : β -甘露聚糖酶活性测定β -甘露聚糖酶活性通过DNS法测定。首先，酶液用O. lmol/L醋酸钠缓冲液(pH
5.5)稀释至1000到5000倍之间，然后取500 μ L酶液与500 μ L含I %刺槐豆胶的预处理后的甘露聚糖底物溶液(用相同的缓冲液稀释)混合。在50°C温度下反应5分钟，然后加入3mL DNS终止反应并煮沸5分钟。用甘露糖标准品在540nm处的吸光度来计算释放的还原糖的数量。在温度为50°C、pH5. 5条件下，以每分钟生成I μ mo I甘露糖所需要的酶量定义为一个甘露聚糖酶活性单位。用BCA蛋白测定试剂盒测定培养基中的总蛋白含量来求出比活性。实施例4 :重组的巴斯德毕赤酵母菌体的高密度培养在500L生物反应器中采用分批补料方式培养巴斯德毕赤酵母生产甘露聚糖酶。每小时注入大约3ml/L甲醇溶液来诱导蛋白表达。每隔12小时对培养液进行取样，测定上清液中β_甘露聚糖酶酶活、蛋白水平和细胞数量。β_甘露聚糖酶的积累量通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶活性检测方法测定。甘露聚糖酶表示为一组分子量在大约70到IOOkDa之间的蛋白。蛋白表达的峰值在第8-9天出现(图2)。诱导结束时，在温度为50°C下，在含有lmmol/L Mn2+的醋酸钠缓冲溶液中测定β -甘露聚糖酶活性，活性为4305U/mL。通过BCA蛋白测定法检测培养基滤出液中蛋白含量约为4g/L，转换成比活力为1075U/mg。实施例5 :重组后的β -甘露聚糖酶的性质通过在一系列缓冲溶液中进行LBG水解反应来确定β -甘露聚糖酶的最适pH值，缓冲液包括例如0. lmol/L甘氨酸-盐酸盐(pH I. 5-3. O)，O. lmol/L醋酸钠(pH
3.5-6.0)，O. lmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 6.0-8. 5),0. lmol/L甘氨酸-氢氧化钠(pH 8. 5-10)，所有的测定均在50°C反应5分钟。结果见图3A。用上述方法在50°C下培养I小时来测定在不同缓冲液pH条件下酶的稳定性。在标准条件下检测残留的酶活性。结果见图3B。在20_100°C范围内检测酶的活性，确定酶的最适反应温度。酶在30，40，50，60或 70°C下培养1-150分钟后(在O. lmol/L醋酸钠缓冲溶液中)，在标准条件下测定剩余的酶活性来比较酶的热稳定性。结果见图4A和4B。实施例6 :不同的金属离子对甘露聚糖酶酶活的影响通过在酶液中添加lmmol/L的硫酸钾、氯化钠、硫酸钴、氯化铯、硫酸铜、硫酸镁、硫酸铁、氯化锰、硫酸锌和硝酸银，测定不同的金属离子对酶活性的影响。添加lmmol/L的Mn2+和Co2+使甘露聚糖酶活性分别增加75%和44%。结果见表I。实施例7 :甘露聚糖酶的专一性甘露聚糖酶液用0. lmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH5. 5)稀释2000倍，取500 μ I酶与500 μ I预处理后的底物溶液混合，预处理后的底物溶液(包括1% LGB、淀粉、滤纸和CMC)在缓冲液中100°C下加热I小时。水解反应在温度为50°C条件下反应5分钟，然后加入3mLDNS试剂煮沸5分钟终止反应。用甘露糖标准品在540nm处的吸光度来内计算释放的还原糖的量，当淀粉、滤纸或CMC作为底物时未检测到活性。这证明甘露聚糖酶是一个专一性水解甘露聚糖的酶。实施例8 :甘露聚糖底物的预处理将IgLGB缓慢添加到IOOmLO. lmol/L醋酸钠缓冲溶液中(pH5. 5)，在100°C不断搅拌条件下持续加热60分钟。底物在4°C存放2周才能使用。实施例9 : β -甘露聚糖酶的酶学性质通过检测不同pH、反应温度和金属离子条件下的酶活，分析了甘露聚糖酶的最适水解条件。从图3A中可以看出，酶活的pH范围在4. 5-6. O之间，最适pH为5. 5。pH在
2.5-4. 5和6. 0-7. 5时，酶活快速降低。pH在4. 0-8. 5之间时酶也非常稳定，培养Ih后有大于65%的酶活。pH在4以下和9以上时，酶的稳定性大幅度下降(图3B)。酶活的最适温度约为50°C (图4A)。当温度升高到55°C时，酶极不稳定，达到80°C时几乎完全失活。不同温度下酶稳定性的详细变化如图4B。温度为50°C时，酶的半衰期为为65分钟，当温度升高到60°C和70°C时，酶活的半衰期分别只有20和15分钟。酶在与室温相近的温度下可以保持较高的活性。40°C时酶的活性大约为50°C时的70%。实施例10 :本发明生产甘露聚糖酶的优越性到目前为止，本发明是首先采用化学合成的基因表达产生甘露聚糖酶。这个基因的表达水平(3. 6g/L)是硫色曲霉(262mg/L)的14倍(Chen, et al，2007)，比以前报道的结果都要高。本发明所得酶活为4305U/ml，比以前报道的350U/ml高12倍(Chen，et al,2007)。重组酶的最适pH大约为5. 5，显著高于以前由黑曲霉固体发酵所产甘露聚糖酶的 最适PH值3，尽管最适温度相似，大约为50°C。本发明所生产的重组β_甘露聚糖酶的在37-40°C条件下具有较高的活性，是适合在低温条件下使用的酶。然而，在它能用作洗涤剂添加剂之前，它对洗涤剂的抵抗力还有待进一步改善。
权利要求
1.一种生产β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤(1)一种合成的β-甘露聚糖酶基因与DNA载体中的启动子结合，产生一个表达框， (2)将DNA载体接种到一个酵母细胞中， (3)小规模培养条件下，通过测定β_甘露聚糖酶活性筛选出高表达菌株， (4)在500L的生物反应器中，筛选高表达β-甘露聚糖酶的菌株
2.根据权利要求I的方法，高表达β-甘露聚糖酶的菌株产生4305U/mL的β -甘露聚糖酶酶活。
3.根据权利要求I的方法，甘露聚糖酶基因含有SeqIDl序列的主要部分，Seq IDI的多核苷酸序列号见图I。
4.根据权利要求I的方法，β-甘露聚糖酶基因是一种含有与Seq IDl有至少85%同源性片段的多核苷酸。
5.根据权利要求I的方法，甲醇是启动子最好的诱导剂。
6.根据权利要求I的方法，接种的酵母属于毕赤酵母属。
7.根据权利要求I的方法，接种的酵母是巴斯德毕赤酵母。
8.根据权利要求I的方法，β_甘露聚糖酶被分泌到胞外培养液中。
9.一种酵母细胞,包含权利要求I中的DNA载体。
10.用甘露聚糖酶对甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的水解方法包括以下步骤 (1)对含有甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等的底物进行预处理。
(2)将含有β_甘露聚糖酶的酶混合物的缓冲液和预处理后的底物进行培养。
11.根据权利要求9的水解方法，缓冲液中含有Mn2+、Fe2+和Co2+金属离子中的一种。
12.根据权利要求9的水解方法，缓冲液的pH在4.5-6. 5之间。
13.根据权利要求9的水解方法，酶混合物含有β-甘露聚糖酶。
全文摘要
本发明涉及一种β-甘露聚糖酶的高产方法，本方法是通过将一个编码为内切β-甘露聚糖酶的多核苷酸被化学合成、克隆以及与a-因子信号肽结合后在胞外表达(受到乙醇氧化酶基因AOX1启动子的控制)等过程。在一个500L的生物反应器中，所选的高表达工程菌株能分泌大约4g/L蛋白至培养液中，高表达菌株能产生约4305U/mL的β-甘露聚糖酶酶活。Co2+和Mn2+能显著增强甘露聚糖的水解活性。产生的β-甘露聚糖酶能高效水解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖。
文档编号C12P19/14GK102888415SQ201110206380
公开日2013年1月23日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者项文胜, 王俊峰, 李尚坤 申请人:江苏奕农生物工程有限公司