专利名称：一种检测ccr5-δ32基因突变的方法及引物的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，具体的是通过设计一组特异性引物，建立一种利用PC R扩增产物的条带数目判断CCR5-A 32基因突变类型的方法。
背景技术：
病毒特异的⑶4+T细胞是针对HIV免疫应答的重要组成部分，也是HIV-I感染过程的首要靶点。但是仅有CD4分子并不能介导HIV-I的侵入，同时还需要一种或几种辅助受体。趋化因子是一类具有趋化活性的小分子细胞因子，它的功能在于使细胞表面具有跨膜G蛋白偶联受体的细胞聚集在一起，参与体内的免疫平衡作用。1996年证实，趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV-I感染的辅助受体(corec印tor)。几乎所有的HIV-1病毒株都是利用其中的CCR5或CXCR4受体，或同时利用两种辅助受体侵入细胞。研究表明，CCR5和 CXCR4的N末端和第二胞外区对于它们与HIV-lgpl20的结合起着关键的作用。CCR5是细胞内β趋化因子(RANTES、MIP-I α和MIP-β)的受体，具有调控T细胞和单核细胞/巨嗜细胞系的迁移、增殖与免疫的功能，主要表达于记忆性的静止期T淋巴细胞、单核细胞、未成熟的树突状细胞等的细胞膜上。它的分子量为40. 6kDa,由352个氨基酸残基组成，结构上可分为胞外N末端，3个胞外环(ELl-3)，3个胞内环(ILl-3)，7个跨膜α螺旋和胞内C末端。在CCR5基因中存在的多个突变体能够有效抵抗HIV的病毒感染以及延缓病情的恶化。目前已在此基因的编码区和启动子区域发现了多种有意义的突变，尤其以对基因编码区突变体CCR5-A 32的研究最为广泛，CCR5-A 32是指CCR5基因的32个碱基缺失的突变，即在CCR5等位基因编码区域第185位氨基酸密码子以后发生了 32个碱基缺失(位于CCR5基因的3317 3348)，导致读码框架错位，缺失了与G蛋白信号通路相关的胞外第三环结构，从而使CCR5蛋白无法正常穿膜表达于细胞膜上，进而使HIV-lgpl20不能与 CCR5-A 32有效结合，使HIV-I病毒不能进入宿主细胞。人群调查和实验研究结果表明， CCR5- Δ 32缺失的个体拥有正常的免疫功能和炎症反应，并且对HIV-I的感染表现出显著的抵御能力。CCR5-Δ 32造血干细胞移植是治疗HIV感染的基因治疗新方案我们在2005年发表的有关利用CCR5突变治疗HIV感染和AIDS的论文中，对这一新的基因疗法有如下描述“就艾滋病患者而言，在治疗上，可将其视为再生障碍性贫血或白血病患者看待，通过移植对HIV具有一定抗性的CCR5- Δ 32基因型骨髓，达到重建其免疫力的目的。由于异体造血干细胞移植存在两大弱点，即器官移植的排斥反应和CCR5-A32基因型骨髓来源的匮乏。因此，就HIV感染者而言，通过对其自身造血干细胞进行CCR5体外致突变，可在更大范围内受益于HIV感染者。” [1]2010年德国学者的临床研究部分证实了 CCR5-Δ 32异体基因型骨髓移植在HIV感染治疗中重要作用[2-3]。虽然CCR5-Δ 32基因型异体骨髓移植的疗效尤其是这一新疗法对晚期AIDS的疗效还需更多病理和更长时间的验证，但《血液》杂志所报道的个案，仍表明基于CCR5- Δ 32基因型的干细胞移植疗法在HIV感染治疗中所具有的里程碑式意义。利用干细胞移植治疗HIV感染，首先需要确定干细胞CCR5基因型，是否发生 CCR5- Δ 32基因突变。从技术角度来看，通过检测扩增片段长度来检测CCR5基因是否发生32个核苷酸缺失相对于DNA直接测序要来的简单的多。目前，限制性片段长度多态性 (RFLP)技术是检测扩增片段长度的常用手段。限制性片段长度多态性(RFLP)技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。这样就导致了用限制性内切酶酶切该DNA序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结果产生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切酶切割不同物种DNA序列时，产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段。后将这些片段电泳、转膜、变性，与标记过的探针进行杂交，洗膜，即可分析其多态性结果。但是RFLP技术也有一些明显的缺陷，如技术复杂，周期长，费用高；检测中需放射性物质，限制了广泛应用；检测多态性水平过分依赖限制性内切酶，使多态性降低；DNA量大，分析速度慢。本方法通过PCR引物设计，建立了一种检测CCR5-A 32基因型的方法。通过观察最终得到几条扩增产物来判断CCR5基因是否发生CCR5- Δ 32基因突变和CCR5- Δ 32基因型 最终只得到一种扩增产物代表CCR5- Δ 32纯和突变，得到两种扩增产物表示样本为CCR5野生型，得到三种扩增产物代表样本为CCR5- Δ 32杂合突变。该方法和DNA测序和RFLP相比， 有快速、准确、方法简单、成本低的优点，有利用临床使用和推广。参考文献[1]L. L. Chen, J. Zhang, H. L. Gao, D. F. Liao, K. Li, The relationship between CCR5 and HIV-I disease. J University of South China(Medical Edition). 33, 166(2005).[2]K. Allers, G. Hutter, J. Hofmann, C. Loddenkemper, K. Rieger, E. Thiel, T. Schneider, Evidence for the cure of HIV infection by CCR5 Δ 32/ Δ 32 stem cell transplantation. Blood. 117,279(2011).[3] R. J. Landovitz , J. S. Currier, Clinical practice. Postexposure prophylaxis for HIV infection. N. Engl. J. Med. 18,1768(2009).
发明内容
本发明的目的是提供一组特异性PCR引物和通过检测扩增产物条带数目判断 CCR5-A 32基因型的方法，该方法有快速、准确、方法简单、成本低的优点，有利用临床使用和推广。基于上述目的，本发明采用以下技术方案步骤1.用常规方法提取样本基因组DNA。步骤2.设计并合成三条特异性引物用于检测CCR5- Δ 32的基因型，所检测的CCR5 基因型包括CCR5野生型、CCR5- Δ 32纯和突变型、CCR5- Δ 32杂合突变型，所述的CCR5- Δ 32基因指CCR5野生型基因的第3317 3348位缺失，缺失的32个连续核苷酸序列为SEQ ID
No. 4。三条特异性包括两条正向引物和一条反向引物，其中正向引物SEQ ID No 1和正向引物SEQ ID No :2和反向引物SEQ ID NO :3，序列如下:Sldel SEQ ID No :13， -TCACTTGGGTGGTGGCTG-5，S2del SEQ ID No :23， -ATTTTCCATACAGTCAGTATCAATT-5’As3del SEQ ID No :33， -GCAGGACCAGCCCCAAGA-5’CCR5野生型基因的第3317 3348位缺失，缺失的32个连续核苷酸SEQ ID No. 4, 序列为CAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACATT。其中，正向引物SEQ ID No. 1和反引物序列SEQ ID NO :3扩增区域为CCR5基因第3213 3377位核苷酸，包括了的CCR5-A32基因突变型32个碱基缺失的突变区；CCR5 基因野生型，杂合突变型，纯合突变型的样本的扩增产物长度分别为(野生型)； 133bp (纯和突变型)；165bp和133bp两种(杂合型)。正向引物SEQ ID NO 2的3，末端与CCR5基因第3317 3327位11个碱基互补配对，位于我们所检测的可能发生32个碱基缺失(CCR5基因的第3317 3348位)的突变区域内。正向引物SEQ ID NO :2与反向引物SEQ ID No :3扩增区域为CCR5基因第3303 3377位。在三种基因型中扩增的产物情况为野生型及杂合突变型可扩增出75bp大小的目的产物，而纯合突变型则扩增不出产物。步骤3.用步骤2中三条引物，以样本基因组DNA为模板，进行多重PCR扩增，由于样本CCR5基因型的不同，可出现三种情况情况一样本为CCR5野生型用正向引物SEQ ID No :1和反向引物SEQ ID NO :3扩增形成目的产物核苷酸序列长度为16^p，产物完整的包括了我们检测的32个碱基序列；用正向引物SEQ ID No 2和反向引物SEQ ID NO :3形成扩增目的产物的核苷酸序列长度为75bp。情况二 样本为CCR5- Δ 32纯和突变型用正向引物SEQ ID No :1和反向引物SEQ ID NO :3扩增形成目的产物核苷酸长度为13!3bp，产物缺失了我们检测的32个碱基序列；而正向引物SEQ ID No 2无法与模板互补杂交。情况三样本为CCR5- Δ 32杂合突变型用正向引物SEQ ID Νο:1和反向引物SEQ ID NO :3，分别以野生型CCR5和 CCR5-A32等位基因为模板，扩增形成两种产物，其中野生型CCR5等位基因扩增形成长度为的产物，CCR5-A32等位基因扩增形成13!3bp的产物；用正向引物SEQ ID No 2和反向引物SEQ ID NO 3以野生型CCR5等位基因为模板，形成75bp核苷酸序列的扩增产物；CCR5-A32等位基因无法与正向引物SEQ ID No 2 互补杂交。其中，步骤3所述，每25μ L多重PCR反应体系包括12. 5μ L的2X Tagmix，三条特异性PCR引物SEQ ID No. 1、2、3分别为10 μ M，20 μ M，10 μ M，模板40ng，其余为水。其中，步骤3所述，多重PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性10S，68°C退火10S，72°C延伸09S，共10个循环每个循环退火温度递减一度；然后95°C变性10S，50°C退火 09S，720C 06S,共；35 个循环；最后 72°C 5min。步骤4.用琼脂糖凝胶电泳分离检测步骤3中的扩增产物，观测产物条带数目，判断样本的CCR5的基因型(1)得到2条带，两种产物的核苷酸序列长度为165bp和75bp，表示基因样本为野生型CCR5基因型；(2)得到1条带，产物核苷酸序列长度为13!3bp，表示基因样本为纯和突变的 CCR5- Δ 32基因型；(3)得到3条带，三种产物核苷酸序列长度分别为16^p、133bp和75bp，表示基因样本为杂合突变的CCR5- Δ 32基因型。本发明的主要优点在于快速、准确、方法简单、成本低的优点，有利用临床使用和推广。
图1实施例一中CCR5野生型人全血基因组DNA测序图谱；图2实施例一中CCR5- Δ 32质粒DNA测序图谱；图3实施例二中CCR5- Δ 32纯和突变型(_/_)、CC R5野生型(+/+)和混合样本 (+/-)的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式下面结和附图和实施例对本发明作进一步描述实施例一、制备CCR5- Δ 32质粒DNA实验步骤如下1)用常规方法提取人全血样本基因组DNA，DNA测序证明样本为CCR5野生型，测序结果如图1所示。2)设计并制备用于制备CCR5-A32缺失性模板的引物对A与引物对B ；其中，引物对A包括正向引物TlCCR5mut和反向引物T2CCR5mut，序列如下正向引物TlCCR5mut 3，-GGAAATACAATGTGTCAACT-5，反向引物T2CCR5mut 3，-TGACTATCTTTACTGTATGGAAAATGAGAG-5，其中，引物对B包括正向引物T3CCR5mut和反向引物T4CCR5mut，序列如下正向引物T3CCR5mut 3，-TTTTCCATACAGTAAAGATAGTCATCTTGG-5，
反向引物 T4CCR5mut 3，-GCAGCAGTGCGTCATCCCAA-5，其中，引物对A扩增CCR5基因下游目的片段，为CCR5基因第3049-3359(缺失 3317 3348位的32个碱基)位核苷酸序列；引物对B扩增的CCR5基因上游目的片段，为CCR5基因第3304 3634(缺失 3317 3348位的32个碱基)核苷酸序列；设计时引物对A的反向引物3’端与引物对B的正向引物5’端有M个碱基互补配对。3)分别用引物对A和B，以样本基因组DNA为模板，PCR扩增，得到CCR5基因下游目的片段和上游目的片段；
其PCR扩增体系为12. 5μ L的2X Tag mix (Biomega，上海)，正向引物10 μ M，反向引物10 μ Μ，基因组40ng，加水至总体积25 μ L。其PCR扩增反应条件95°C预变性5min，95°C变性20S，50°C退火20S，72°C延伸 30S，总共30个循环，最后720C IOmin04)将经过凝胶纯化的CCR5基因上游目的片段和下游目的片段加入反应管中，进行PCR扩增。PCR反应体系12. 5 μ L的2Χ Tag mix (Biomega,上海)，上游目的片段40ng，下游目的片段40ng,正向引物TlCCR5mut 10 μ M，反向引物T4CCR5mut 10 μ M，加水至总体积 25 μ L0PCR反应条件95预变性5min，95°C变性20S，50°C退火20S，72°C延伸30S，总共30 个循环，最后72°C IOmin。首先，下游目的片段的与上游目的片段的单链末端M个碱基互补配对，互为引物并指导延伸，形成缺失我们所检测的CCR5基因第3317 3348位32个连续核苷酸序列的 CCR5- Δ 32缺失性核苷酸序列。然后，用TlCCR5mut，T4CCR5mut两条外围引物，以CCR5- Δ 32缺失性核苷酸序列为模板，进行PCR扩增，获得大量CCR5- Δ 32纯和突变的产物。5)构建CCR5- Δ 32质粒DNA 将CCR5- Δ 32纯和突变的产物经纯化后，Τ_Α质粒载体相连，转化，并挑选阳性菌落，DNA测序鉴定。结果证明产物为CCR5-A32纯和突变型，如图2所示。实施例二、用三条特异性引物检测CCR5野生型样本、CCR5-A 32纯和突变型样本和混合样本的基因型。CCR5野生型样本人全血样本基因组DNA，经DNA测序为CCR5野生型。CCR5- Δ 32纯和突变型样本实施例一制备所得CCR5- Δ 32质粒DNA。混合样本CCR5_ Δ 32质粒DNA与CCR5野生型基因组DNA按等拷贝数混合模拟 CCR5- Δ 32杂合型样本。实验步骤如下1)设计并制备针对CCR5-A32的基因突变设计的三条特异性PCR引物，引物序列如下Sldel SEQ ID No:lTCACTTGGGTGGTGGCTGS2del SEQ ID No 2ATTTTCCATACAGTCAGTATCAATTAs3del SEQ ID No 3GCAGGACCAGCCCCAAGA2)用三条特异性引物，分别以CCR5野生型DNA样本、CCR5- Δ 32纯和突变型DNA 和混合样本为模板，进行多重PCR扩增。多重PCR反应体系为12. 5μ L的2Χ Tag mix (Biomega，上海)，三条特异性引物各10 μ M，模板40ng,加水至总体积25 μ L。多重PCR 反应条件95°C 5min 预变性，95°C 10S，68°C退火 10S，72°C延伸 09S，共 10个循环每个循环退火温度递减一度。然后95°C变性10S，50°C退火09S，72°C延伸06S，共 ；35个循环。最后72°C延伸5min。3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，CCR5- Δ 32纯和突变型(_/_)、CCR5野生型(+/+)、混合样本(+/_)分别对应1条带，2条带，3条带，结果如图3所示。
权利要求
1.一组检测CCR5基因突变的引物，其特征在于，包括针对CCR5-A32的基因突变设计的三条特异性PCR引物，三条引物的核苷酸序列为SEQ ID No. 1、2、3。
2.一种检测CCR5基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1)从样品中提取基因组DNA ；步骤2、按权利要求1合成针对CCR5- Δ 32的基因突变设计的三条特异性PCR引物；步骤3)用三条特异性PCR引物，以基因组DNA为模板，进行多重PCR扩增；步骤4)用琼脂糖凝胶电泳分离步骤幻中的扩增产物，观测产物条带数目，判断样本的 CCR5的基因型(1)观测到2条带，样本为CCR5野生型；(2)观测到1条带，样本为CCR5-A32纯和突变基因型；(3)观测到3条带，样本为CCR5-A32杂合突变基因型。
3.按权利要求2所述一种检测CCR5基因突变的方法，其特征在于，纯合突变型、纯合野生型和杂合突变型经三条特异性引物PCR扩增，电泳分离扩增产物，分别形成1条带，2条带，3条带。
4.按权利要求2所述一种检测CCR5基因突变的方法，其特征在于，基因型与条带数量关系是指不同基因型的确认由PCR扩增产物的条带数量的多少来决定，而不必须依赖PCR 扩增产物的长短或碱基对的个数。
5.按权利要求2所述一种检测CCR5基因突变的方法，其特征在于，步骤3)中，每25μ L 多重PCR反应体系包括12. 5μ L的2Χ Tag mix，三条特异性PCR引物SEQ ID No. 1、2、3分别为10 μ M，20 μ Μ, 10 μ Μ,模板40ng,其余为水。
全文摘要
本发明提供一种检测CCR5-Δ32基因突变的方法及用于该方法的引物，具体涉及通过设计一组引物，以样本基因组DNA为模板，利用电泳分离PCR扩增所得产物所得条带数目判断CCR5-Δ32基因突变类型，其特征在于1)设计并制备一组检测CCR5基因突变的引物，所述引物包括针对CCR5-Δ32的基因突变设计的三条特异性PCR引物，引物具有SEQ ID No.1、2、3的核苷酸序列。2)通过观测PCR扩增产物电泳后的条带数目，判断样本的CCR5-Δ32的基因型。
文档编号C12Q1/68GK102321737SQ20111020604
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者何农跃, 姬云, 张佳, 李凯, 李萍, 王伟大, 王庆琳, 肖莉 申请人:苏州大学