专利名称：一种青霉菌源壳聚糖酶基因及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种青霉菌源壳聚糖酶基因及其克隆表达方法。
背景技术：
纤维素、几丁质、壳聚糖是自然界含量最为丰富的多糖，蕴含着巨大的糖类资源， 它们均由吡喃葡萄糖经β_1，4糖苷键连接而成，不同点在于2号碳上所连接的官能团。其中壳聚糖是由D-葡萄糖胺残基构成，可由几丁质经部分或者完全脱乙酰化获得，在自然界中，真菌、昆虫等体内含量丰富。科学界十分关注壳聚糖及其水解物，因为它们具有许多重要和有开发潜力的生物学功能，比如杀菌、抗癌等，有些功能已经被实际应用于农业、食品和医药产业。壳聚糖酶是自然界存在的一类能够催化水解壳聚糖β_1，4糖苷键的酶类，其存在范围广泛，从细菌到真菌，甚至病毒乃至植物，都曾发现有壳聚糖酶。根据氨基酸序列分析，壳聚糖酶分为5号、7号、8号、46号、75号和80号共六个家族(http://www. cazy. org/ Glycoside-Hydrolases, html)，不同家族的酶对底物的特异性有所不同。目前为止，只有少数真菌菌株被发现能产生壳聚糖酶，其克隆和表达的研究也较少。相对于物化方法水解几丁质和壳聚糖，酶法水解具有节能、环保、高效、安全、低成本等无可比拟的优势，能够为几丁质和壳聚糖为原料的食品、制药等行业提供优质产品。该课题其关键就在于高效壳聚糖酶基因的克隆和表达，也是工业化生产的技术基础。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种从产生壳聚糖酶的天然霉菌中克隆壳聚糖酶基因的方法，开辟一条新的、快捷的获取壳聚糖酶基因的途径。本发明的另一目的是利用该方法克隆到一个全新的壳聚糖酶基因，并将获得的壳聚糖酶基因用于重组菌株的构建并实现异源表达，最终实现工业化生产壳聚糖酶。本发明所述的方法包括如下步骤(1)、将已知的霉菌壳聚糖酶基因进行序列比对，找到核心保守序列；O)、设计简并引物；(3)、以霉菌株基因组为模板，利用简并引物通过PCR法扩增霉菌源壳聚糖酶部分基因片段；G)、利用获得的部分基因序列，设计巢式引物，通过反向PCR法获取全长壳聚糖
酶基因。壳聚糖酶分为5号、7号、8号、46号、75号和80号共六个家族，可以通过氨基酸序列分析找到核心保守序列。而本发明获取壳聚糖酶基因的对象是研究较少的青霉菌 (Penicillium sp)，基因结构与已知的其他来源的壳聚糖酶基因有较大不同，能够发现新型高效的壳聚糖酶。本发明用只含壳聚糖作为唯一碳源的特殊选择性培养基获得青霉菌株，并抽提其DNA基因组。比对已知的霉菌来源的壳聚糖酶基因，找出核心保守序列NMDID⑶与YGIWGD， 设计带有酶切位点的简并引物。或者也可以直接在软件Block Maker (http:// bioinformatics. weizmann. ac. il/blocks/blockmkr/www/make_blocks. html)中进行比对和寻找保守区域，然后利用软件 C0DEH0P (http//bioinformatics. weizmann. ac. il/ blocks/codehop. html)寻找可能的简并引物。依据引物的基本原则和要求简并度尽可能小、Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大、上下游引物的Tm值尽可能相近等，选择适宜的兼并引物。根据上述原则，发明人设计了一对简并引物DFP (5‘-GCGGATCCAAYATGGAYATHGAYTG YGA-3，)和 DRP (5，-GCGAAGCTTRTCDCCCCADATNCCRTA-3，)，以青霉菌株基因组 DNA 为模板进行PCR。对扩增得到的部分基因片段进行测序，然后根据获得的基因片段的序列设计巢式引物FP1(5-CCA GAG CAC GTT GGC ATC AA-3)、FP2(5，_GGT CTG CAA CAA CAA GCT CAT C_3，) 和 RP1(5-ACC ATA GTC GGA CTT GAC CT_3)、RP2(5，-GAG TCG ATG CCG TCT TGA TC-3，)。 分别以I3StLBamHLEcoRI和HindIII酶切消化基因组DNA并自身环化，以形成的环形DNA 为模板，利用FPl与RPl引物进行反向PCR，再以所得产物作为模板，利用引物FP2和RP2进行巢式PCR，对壳聚糖酶基因上下游序列进行扩增，所得产物连接到载体进行测序、拼接，获得壳聚糖酶全长基因序列。根据测序结果并和现有壳聚糖酶基因进行比对，发现本发明获得了一种新型的壳聚糖酶基因，其DNA序列和氨基酸分别如kq ID No. 1和kq ID No. 2所示，分析表明其基因无内含子。与已公布壳聚糖酶序列(B8M2R4)同源性为83%。在不影响壳聚糖酶蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有壳聚糖酶活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象， 因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。因而，优选的，可根据公知常识和逻辑推理，通过对壳聚糖酶蛋白生物学活性结构域外的氨基酸位点进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸从而获得基本保留壳聚糖酶生物学活性的蛋白突变体，优选的为对壳聚糖酶氨基酸位点进行点突变从而获得基本保留壳聚糖酶生物学活性的蛋白突变体。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响壳聚糖酶基因表达的条件下，可对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还保护对SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留壳聚糖酶蛋白生物学活性的DNA分子。利用基因克隆技术，可将克隆到的壳聚糖酶基因接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组壳聚糖酶。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E. coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)等，优选采用原核表达系统 E. coli ο
合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体。一个优选的例子是将本发明克隆到的壳聚糖酶基因采用设计插入的NdeI和B10I重组位点连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，并转入大肠杆菌BL21(DE!3)菌株中，用0. Immol/ L IPTG进行诱导表达。然后通过镍柱亲和层析获得了有活性的壳聚糖酶。本发明提供了一种从霉菌中克隆新型壳聚糖酶基因，并进行异源表达的方法，所用的仪器、试剂均为市场上常见种类，且均可采用试剂盒进行操作，能够大量节省基因克隆和表达所需的时间。并且酶学研究表明获得的壳聚糖酶具有较高的活性。本发明的方法有效可靠，建立了一套行之有效的新型壳聚糖基因克隆方法，最终实现工业化生产壳聚糖酶， 为后续的工业应用提供成本低廉的壳聚糖酶起始材料。
图1为制备新型壳聚糖基因的流程图。
具体实施例方式实施例1青霉菌的获得利用以壳聚糖为单一碳源的培养基(NaNO3 0. 2%, K2HPO4 0. 1%, MgSO4 0. 05%, KCl 0. 05%,FeSO4 0. 001%，胶体壳聚糖0. 5%，pH5. 0)培养筛选得到能表达产生壳聚糖酶的普通青霉菌(Penicillium sp)。实施例2壳聚糖酶基因的克隆提取实施例1的青霉菌体DNA后，通过反向PCR(I-PCR)获得壳聚糖酶基因。首先通过霉菌的壳聚糖酶高度保守序列设计兼并引物DFP (5’ -GCGGATCCAAYATGGAYATHGAYTG YGA-3，)和 DRP (5，-GCGAAGCTTRTCDCCCCADATNCCRTA-3，)，以青霉菌的基因组 DNA 为模板进行PCR，程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火lmin，72°C恒温2min，30次循环，最后72°C延伸lOmin。获得的片段进行测序，然后根据获得的序列进一步设计巢式引物 FPl(5-CCA GAG CAC GTT GGC ATC AA-3), FP2(5’ -GGT CTG CAA CAA CAA GCT CAT C_3’ ) 和 RP1(5-ACC ATA GTC GGA CTT GAC CT_3)、RP2(5，-GAG TCG ATG CCG TCT TGA TC-3，)。 然后以I3St I、BamHI,、EcoRI和HindIII分别酶切消化基因组DNA，并进行自身连接，以形成环形的DNA为模板，利用巢式引物进行I-PCR，得到壳聚糖酶基因上下游序列，最后获得壳聚糖酶基因全序列。实施例3壳聚糖酶表达载体的构建根据实施例中基因注释得到的壳聚糖酶全长编码序列(SEQ ID NO. 1)，设计能扩增出完整编码阅读框的引物，构建表达载体。青霉菌DNA为模板，扩增壳聚糖酶全长基因。在保证阅读框正确的前提下重组至表达载体pET28a中，再将重组载体转化至大肠杆菌 DH5a感受态细胞中(转化方法为CaCl2法或电转化法)，以抗生素标记法筛选(本例中为卡那霉素抗性)阳性的重组菌pET28a-CSn/DH5 a。挑取单菌落的工程菌pET28a-CSn/DH5 a 于5ml含30 μ g/ml卡那霉素的LB培养基中振摇培养37°C过夜，提取重组质粒后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，以抗生素标记法筛选(本例中为卡那霉素抗性)阳性的重组高效表达菌pET28a-csn/BL21。实施例4 重组壳聚糖酶的表达和纯化挑取单菌落的工程菌pET28a-CSn/BL21于5ml含30 μ g/ml卡那霉素的LB培养基中振摇培养37°C过夜，按1 100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含30 μ g/ml卡那霉素)中培养约3小时，至0D_达0. 5后，加入IPTG至终浓度0. lmmol/L,于30°C继续分别培养3小时。取Iml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液，悬浮细菌沉淀，沸水浴中煮 5分钟，12000rpm离心lmin，上清加入12% SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达所需蛋白的工程菌。按上述方法诱导表达所需蛋白的工程菌后，将细菌离心沉淀，按每IOOml菌加入 8ml Binding Buffer，超声破碎后，15000rpm离心30分钟后取上清，加入^il Ni-NTA树脂 (Invitrogen)，30°C振摇结合30分钟，静置沉淀，弃上清，沉淀用IOml Wash Buffer洗涤2 次后，上2ml层析柱，然后用Elution Buffer洗脱目的蛋白，以Iml为单位分管收集，合并酶活最高的几管。洗脱的上清添加50%的甘油后保存于-80°C，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。实施例4 重组壳聚糖酶性质的测定纯化的壳聚糖酶其最适反应温度为48°C、最适反应pH 4.0，并在？!1 3_8，以及 40°C以下的温度条件下是稳定的，该酶适宜的底物为壳聚糖与胶体壳聚糖。
权利要求
1.一种壳聚糖酶蛋白，是具有如下(1)或( 特征的蛋白质 (1)、其氨基酸序列与kq ID NO. 2所示序列一致；O)、将kq ID NO. 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/ 或添加且具有壳聚糖酶活性的由(1)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述壳聚糖酶蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示； 或为对SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留壳聚糖酶蛋白生物学活性的DNA分子。
3.携带有权利要求2所述DNA分子的载体。
4.一种宿主系统，其由权利要求3所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。
5.根据权利要求4所述的宿主系统，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主系统，其为大肠杆菌E.coli。
7.—种从生产壳聚糖酶的菌株中克隆壳聚糖酶基因的方法，包括如下步骤(1)将已知的霉菌壳聚糖酶基因进行序列比对，找到核心保守序列；(2)设计简并引物；(3)以霉菌株基因组为模板，利用简并引物通过PCR法扩增霉菌源壳聚糖酶部分基因片段；(4)利用获得的部分基因序列，设计巢式引物，通过反向PCR法获取全长壳聚糖酶基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中核心保守序列为NMDIDCD 和YGI腳。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤⑵中简并引物为DFP(5’-GCG GATCCAAYATGGAYATHGAYTGYGA-3，)和 DRP(5， -GCGAAGCTTRTCDCCCCADATNCCRTA-3，)。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中巢式引物为FP1(5-CCA GAG CAC GTT GGC ATC AA-3) ,FP2(5' -GGT CTG CAA CAA CAA GCT CAT C_3’)、RP1(5_ACC ATA GTC GGA CTT GAC CT—3)和 RP2(5，-GAG TCG ATG CCG TCT TGA TC—3，)。
全文摘要
本发明公开了一种青霉壳聚糖酶基因克隆及其表达方法。本发明利用单一碳源的特殊培养基进行筛选，获得产壳聚糖酶的青霉菌，采用独特的简并引物进行青霉菌壳聚糖酶基因的片段扩增，然后通过反向PCR的方法获得了全长基因，经确认所得的新型酶基因不含内含子。将该基因克隆到合适表达载体，在大肠杆菌中实现异源表达，酶学研究表明获得的壳聚糖酶基因具有较高的活性。本发明的方法有效可靠，建立了一套行之有效的新型壳聚糖酶基因克隆方法，并最终实现大量的诱导表达，为后续的工业化生产提供成本低廉的壳聚糖酶起始材料。
文档编号C12N1/19GK102250858SQ20111020598
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者吴敏, 张文武, 朱旭芬 申请人:浙江大学