专利名称：一种筛选/检测乳杆菌的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌的检测技术，特别涉及一种乳杆菌的检测技术。
背景技术：
乳杆菌属(Lactobacillus)是一类公认安全(Generally regarded—as—safe， GRAS)的微生物，具有改善肠道环境，增强宿主免疫力等功能，是对人体有益的益生菌 (Probiotics)。目前，乳杆菌不仅在食品和饲料工业上被广泛的应用，而且通过基因工程， 正在被开发为疫苗投送载体、微生态纠正剂、全酶制剂等，是当前的研究热点之一。在四川泡菜、奶酪、腊肠、青贮饲料、韩国泡菜等传统发酵食品中都存在大量的乳杆菌，四川泡菜与韩国泡菜、日本泡菜齐名，是世界公认的健康发酵蔬菜制品。为了改善泡菜风味，收集微生物资源，从四川泡菜中已经分离到了植物乳杆菌(L. plantarum)、短乳杆菌(L. brevis)、干酪乳杆菌(Lcasei)、嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)等乳杆菌。四川泡菜种类繁多，品牌林立，还有较多乳杆菌有待分离和鉴定。然而，传统的分离鉴定方法需对细胞形态、大小、排列、运动性、菌落形态等形态特征，营养要求、酶、代谢产物、对药物的敏感性等生理生化特征鉴定等指标进行检测，不仅工作量十分浩大，且对技术熟练度要求较高，难以快速筛选出乳杆菌。通过测定16s rDNA/RNA 序列的方式鉴定乳杆菌的方法虽然较为快速，但是对待检样本中任一菌类均进行DNA测序以判定其是否为乳杆菌，耗费的成本太高，不具有实际应用价值。Dubernet S.等人设计一对引物，扩增16S rDNA序列3'端到23S rDNA序列之间的区域，根据电泳是否出现250bp条带，可确定23种菌是否是乳杆菌，但是该文献中引物特异性太强，仅能用于检出该文献记载的23种乳杆菌，不能检测出其他乳杆菌以及乳杆菌新种。亟需一种快速的初步筛选乳杆菌的方法，将所有乳杆菌从待检样本含有的大量微生物中筛选出来，以便进一步研究。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的筛选/检测试剂盒和方法。首先，本发明提供了一种快速筛选/检测乳杆菌的试剂盒，它包含序列如SEQ ID NO 1 2所示的引物对1，扩增来自乳杆菌的基因。还提供了一种快速筛选/检测乳杆菌的方法，它包括如下步骤a,分离单菌落从待检样本中分离得到菌株单菌落；b，基因扩增以步骤a所得菌体基因组DNA为模板，用前述试剂盒进行基因扩增；C，结果检测对扩增结果进行检测。本发明用菌落PCR技术检测待测菌株是否为乳杆菌，操作简单、效率高。其中，所述步骤a采用在MRS培养基上划线分离得到单菌落；其中，所述步骤b基因扩增方法为菌落PCR扩增方法。菌落PCR方法将样品处理跳过DNA抽提这一步骤，直接以菌体热、冻解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，不仅节约时间，增加设备利用率，也降低实验成本。最后，还提供了 SEQ ID NO :1 2所示的寡核苷酸序列的用途，其用于扩增或检测来自乳杆菌的基因。用本发明提供的试剂盒可从含有大量微生物的待检样本中快速筛选出所有乳杆菌，便于进一步筛选鉴定未知乳杆菌，节约时间，节省成本，有较强的应用价值。
图1乳杆菌16S rDNA保守区与近缘细菌相应序列的比对2引物特异性实验结果图3泡菜中乳杆菌的PCR扩增检出结果
具体实施例方式实验材料从四川省的成都市、自贡市、德阳市、乐山市、眉山地区和资阳地区的居民家中收集自制的泡菜样品共16份。短乳杆菌(L.brevis ATCC 367)和嗜酸乳杆菌(L. acidophilus ATCC 4356) ^ 自中科院微生物研究所菌种保藏库。植物乳杆菌(L. plantarum CICC 6002)、瑞士乳杆菌(L. helveticus CICC 22826)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(L. delbrueckii subsp. bulgaricus CICC 6064)购自中国工业微生物菌种保藏中心。干酪乳杆菌(L. casei ATCC 393)购自美国菌种保藏中心(ATCC)。乳酸乳球菌(Lactococcus lactics MG 1363)由重庆医科大学张德纯教授赠送。表皮葡萄球菌Staphylococcus印idermidis)、类肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)禾口枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),购自中国工业微生物菌种保藏中心。乳杆菌菌株均用MRS培养基(MRS培养基配方为葡萄糖20g，酪蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，酵母粉5g，乙酸钠5g，柠檬酸二胺2g，磷酸氢二钾2g，吐温801g，七水硫酸镁 0. lg，硫酸锰0.05g，加ddH20至1L)。在37°C培养Mh，其它菌株使用肉汤培养基在37°C培养18h。PCR试剂盒(Ex Taq)购自大连宝生物公司(TaKaRa)，胶回收试剂盒购自Omega公司(Bio-iTek USA)。实施例1引物设计如表1所示，根据NCBI的Genome数据库中14种乳杆菌基因组序列，寻找乳杆菌保守序列，将该保守序列与乳杆菌同属乳杆菌科的片球菌(Pediococcus)，与乳杆菌同属乳杆菌目的肠球菌(Enterococcus)、乳球菌(Lactococcus)禾口明串珠菌(Leuconostoc),以及与乳杆菌同属芽胞杆菌纲的芽胞杆菌(Bacillus)和葡萄球菌Staphylococcus)相应序列比对，设计乳杆菌特异性引物。表1已测序的14种乳杆菌和5种近缘菌种列表
权利要求
1.一种快速筛选/检测乳杆菌的试剂盒，其特征在于包含序列如SEQ ID N0:1 2 所示的引物对1，扩增来自乳杆菌的基因。
2.一种快速筛选/检测乳杆菌的方法，其特征在于包括如下步骤a，分离单菌落从待检样本中分离得到菌株单菌落；b，基因扩增以步骤a所得菌体基因组DNA为模板，用权利要求1所述试剂盒进行基因扩增；c，结果检测对扩增结果进行检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤a采用在MRS培养基上划线分离得到菌株单菌落。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤b基因扩增方法为菌落PCR扩增方法。
5.SEQ ID NO :1 2所示的寡核苷酸序列的用途，其特征在于其用于扩增或检测来自乳杆菌的基因。
全文摘要
一种快速筛选/检测乳杆菌的试剂盒，它包含序列如SEQ ID NO1～2所示的引物对1，扩增来自乳杆菌的基因，还涉及一种快速筛选/检测乳杆菌的方法。本发明提供的试剂盒可从含有大量微生物的待检样本中快速筛选出乳杆菌，便于进一步筛选鉴定未知乳杆菌。节约时间，节省成本，有较强的应用价值。
文档编号C12R1/225GK102251041SQ201110205040
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者余小平, 彭云, 杨四佳, 杨维华, 殷建华, 潘渠, 王广科 申请人:成都医学院