专利名称：猪卵丘干细胞的分离方法
猪卵丘干细胞的分离方法本发明涉及动物干细胞的分离方法，尤其涉及一种猪卵丘干细胞的分离方法。 [背景技术]干细胞(Stem Cell)是一种尚未充分分化和成熟的细胞，在诱导环境条件下具有形成各种组织器官组成细胞的潜在功能，被医学界称之为“万能细胞”。干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域。干细胞及其衍生组织器官的广泛临床应用，将产生一种全新的医疗技术，也就是再造人体正常的甚至年轻的组织器官，从而使人类能够用上自己的或他人的干细胞或由干细胞所衍生出的新的组织器官，来替换自身病变的或衰老的组织器官。干细胞的研究将为临床医学提供更为广阔的应用前景。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程等各种生物技术的快速发展，按照一定的目的，在体外人工分离、培养干细胞已成为可能，利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，这将成为干细胞应用的主要方向。当前，干细胞和再生医学的研究已成为生命科学中最为引人注目的领域，其理论的日臻完善和技术的迅猛发展必将在疾病治疗和生物医药等领域产生划时代的成果，是对传统医疗手段和医疗观念的一场重大革命。干细胞作为起源细胞，具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞，是形成哺乳类各组织器官的祖宗细胞。干细胞在形态上通常具有共性，呈现出圆形或椭圆形形态，干细胞的体积较小，细胞核相对较高大。干细胞按其来源可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞(Embryonic Stem cell, ES细胞)来自早期受精卵囊胚的内细胞团， ES细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化形成动物机体组织和器官的所有组成细胞，甚至包括生殖细胞精子和卵子。因此，研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的热点。但是由于ES细胞来源于早期囊胚的内细胞团，当胚胎在子宫内着床后囊胚的内细胞团将发育成为一个生命个体。因此，ES细胞的分离与一个生命个体的诞生存在两者不可兼得的矛盾。另外，ES细胞诱导分化形成的细胞由于免疫排斥现象不能直接应用到患者体内。成体干细胞作为干细胞家族中的一种细胞类型，来源于动物机体的许多组织或器官。成体干细胞经过诱导分化后形成机体紧缺的细胞、组织或器官用于修复或替换受损的细胞、组织或器官，由于自身成体干细胞同动物机体基因型完全一致，干细胞移植可以有效避免免疫排斥现象。成体干细胞在动物机体的生长发育过程中作为细胞储备发挥着关键的调节作用，维持组织或器官的动态平衡。目前，造血干细胞作为成体干细胞已成功应用于临床医学。造血干细胞是体内各种血细胞的唯一种子细胞来源，它主要存在于骨髓、外周血、 脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。造血干细胞存在于造血系统，对于白血病患者因造血系统的严重疾病，自身的造血干细胞受到破坏，分离培养出来源于其他组织或器官的成体干细胞具有着重要的使用价值和现实意义。目前人们已从皮肤、脂肪、神经、血液等组织中成功地分离出成体干细胞，其中造血干细胞已成功地应用于人类临床。但是到目前为止还未见从动物机体的卵巢中分离出干细胞的报道。 [发明内容]本发明要解决的技术问题是提供一种猪卵丘干细胞的分离方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种猪卵丘干细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤(1)猪卵丘细胞的采集从青年母猪卵巢表面抽取直径36mm卵泡，挑选卵丘细胞包裹2层以上致密且胞质均勻的卵丘卵母细胞复合物，用TCM-199卵母细胞成熟液洗涤3遍，然后将每70-80个卵丘卵母细胞复合物移入24孔培养板中进行培养，每孔400 μ 1TCM-199卵母细胞成熟液，成熟液上面覆盖石蜡油，在39°C、5% C02、100%湿度的培养箱中培养42士2h;成熟培养后的卵丘卵母细胞复合物用lmg/ml透明质酸酶消化脱去卵母细胞周围的卵丘细胞，收集卵丘细胞用于猪卵丘干细胞的分离培养；(2)猪卵丘干细胞的分离与培养取采集到的猪卵丘细胞，经PBS液离心洗涤后，添加高糖的DMEM培养液于37°C条件下进行培养，待培养的纤维状卵丘细胞中间出现圆形细胞形成的细胞集落后，更换为含 4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液继续培养，胰酶消化圆形细胞集落，接种消化的细胞于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM 培养液继续培养，细胞每天半量换液，2-3d传代一次。本发明的有益效果是介绍一种成功分离培养出猪卵丘细胞干细胞的方法，猪由于在个体大小、生理特征、组织器官大小等方面同人体较为相似，常成为用于研究人类疾病治疗、组织器官移植的理想动物模型，通过对猪卵丘细胞干细胞分离培养方法的介绍将会为来源于人类自身机体的卵丘细胞干细胞分离培养和应用奠定基础，同时也会为利用猪卵丘干细胞作为种子细胞进行遗传操作应用猪的品种培育和改良等工作奠定基础。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例猪卵丘细胞的细胞形态。图2是本发明实施例分离培养的猪卵丘干细胞的细胞集落形态。1试验材料与方法1.1试验材料实验动物为杜长达三元杂交青年母猪；1.2试验方法1. 2. 1猪卵丘细胞的分离从青年母猪卵巢表面抽取直径3_6mm卵泡，挑选卵丘细胞包裹2层以上致密且胞质均勻的卵丘卵母细胞复合物，用TCM-199卵母细胞成熟液洗涤3遍，然后将每70-80个卵丘卵母细胞复合物移入24孔培养板中进行培养，每孔400 μ 1TCM-199卵母细胞成熟液，成熟液上面覆盖石蜡油，在39°C、5% C02、100%湿度的培养箱中培养42士2h。成熟培养后的卵丘卵母细胞复合物用lmg/ml透明质酸酶消化脱去卵母细胞周围的卵丘细胞，收集卵丘细胞用于猪卵丘干细胞的分离培养。1. 2. 2猪卵丘干细胞的分离与培养取收集到的猪卵丘细胞，经PBS液离心洗涤后，添加高糖的DMEM培养液37°C条件下进行培养，待培养的纤维状卵丘细胞中间出现圆形细胞形成的细胞集落后，更换为含 4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液继续培养，胰酶消化圆形细胞集落，接种消化的细胞于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM 培养液继续培养，细胞每天半量换液，2-3d传代一次。1. 2. 3猪卵丘干细胞多能性标记的表达检测猪卵丘干细胞经4%多聚甲醛固定，牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30分钟，添加一抗为兔抗0ct4、山羊抗Nanog、小鼠抗SSEAl按1 200稀释后4°C孵育过夜。PBS洗 3次，CY3红色荧光标记的二抗按1 200稀释后室温避光孵育lh，PBS洗3次，用1 μ g/ml 的DAPI进行细胞核染色Imin后荧光镜下观察结果。1. 2. 4猪卵丘干细胞体外分化能力的检测Dispase消化卵丘干细胞，将消化的细胞集落吹打形成较小的细胞集落，高糖的 DMEM培养液离心洗涤后，接种细胞集落于细菌培养皿中添加高糖的DMEM培养液进行悬浮培养，7d悬浮培养后将形成的细胞团块接种到明胶包被的培养皿中使细胞团块贴壁生长， 细胞团块贴壁生长7d后，4%多聚甲醛固定，牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30分钟，添加一抗为山羊抗神经纤维、山羊抗α-肌动蛋白、山羊抗甲胎蛋白按1 200稀释后4°C孵育过夜。PBS洗3次，CY3红色荧光标记的二抗按1 200稀释后室温避光孵育lh，PBS洗 3次，用1 μ g/ml的DAPI进行细胞核染色Imin后荧光镜下观察结果。2试验结果2. 1猪卵丘干细胞的集落形态收集从猪卵丘卵母细胞复合物中消化脱落的卵丘细胞，在高糖的DMEM培养液中培养Id后，猪卵丘细胞贴壁生长，绝大部分猪卵丘细胞呈现纤维状生长形态(图1)，细胞生长速度缓慢，继续培养4d后，可见少数细胞呈现圆形细胞形态，分裂增殖的圆形细胞逐渐增多形成细胞集落，细胞集落向上隆起形成鸟巢状形态，在细胞集落中圆形细胞的细胞核较大，生长较纤维状卵丘细胞生长速度快。Dispase消化细胞集落后接种到小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，分散的细胞集落在高糖的DMEM培养液中呈现退化现象，细胞不增殖并逐渐退化减少。在含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液中细胞集落生长迅速，细胞状态较好，细胞集落突出饲养层表面比较明显，形成典型的鸟巢状形态(图2)，细胞集落每2-3d传代一次，每次按1 4进行消化传代，经过多次消化传代细胞集落仍然表现出稳定的生长性能，一致的细胞集落形态，冻存和复苏对细胞的生长性能没有明显影响。2. 2猪卵丘干细胞的干细胞标记表达分离培养的猪卵丘干细胞集落在含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖的DMEM 培养液中生长性能稳定，经过4%多聚甲醛固定及免疫细胞化学染色检测分析之后显示，猪卵丘干细胞表达干细胞特异性标记0ct4、Nanog和SSEA1，其中0ct4和Nanog在猪卵丘干细胞中为核表达，检测结果与干细胞特异性标记和核特异性染料DAPI的结果相一致。SSEAl 表达在猪卵丘干细胞的细胞膜表面，在猪卵丘干细胞集落中呈现细胞差异性表达，即在细胞集落中部分细胞SSEAl膜蛋白表达为强阳性，部分细胞SSEAl膜蛋白表达为弱阳性，这是在目前所报道的干细胞集落中唯一一种性能独特的干细胞集落，在其它类型的干细胞集落中SSEAl膜蛋白表达呈现均一一致性，结果显示出猪卵丘干细胞基因表达的独特性。2. 3猪卵丘干细胞体外三胚层的分化猪卵丘干细胞集落在含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖的DMEM培养液生长性能稳定，制作的拟胚体经过7d悬浮培养和7d贴壁培养，4%多聚甲醛固定及免疫细胞化学染色检测分析后显示，猪卵丘干细胞在体外能够自发向机体内三个胚层细胞进行分化，在猪卵丘干细胞拟胚体中，部分细胞分化形成外胚层神经细胞，表现为神经细胞特异性抗体神经纤维表达检测为阳性，部分细胞分化形成中胚层肌肉细胞，表现为肌肉细胞特异性抗体α-肌动蛋白表达检测为阳性，并且诱导分化诞生的肌肉细胞形成环形的括约肌形态。 在拟胚体中部分细胞则分化表达内胚层肝脏细胞特异性标记甲胎蛋白，分析检测证实猪卵丘干细胞具有向机体三个胚层分化的能力，呈现出干细胞特有的特征。
权利要求
1. 一种猪卵丘干细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤(1)猪卵丘细胞的采集从青年母猪卵巢表面抽取直径3-6mm卵泡，挑选卵丘细胞包裹2层以上致密且胞质均勻的卵丘卵母细胞复合物，用TCM-199卵母细胞成熟液洗涤3遍，然后将每70-80个卵丘卵母细胞复合物移入24孔培养板中进行培养，每孔400 μ 1TCM-199卵母细胞成熟液，成熟液上面覆盖石蜡油，在39°C、5 % C02、100 %湿度的培养箱中培养42 士 2h ；成熟培养后的卵丘卵母细胞复合物用lmg/ml透明质酸酶消化脱去卵母细胞周围的卵丘细胞，收集卵丘细胞用于猪卵丘干细胞的分离培养；(2)猪卵丘干细胞的分离与培养取采集到的猪卵丘细胞，经PBS液离心洗涤后，添加高糖的DMEM培养液于37°C条件下进行培养，待培养的纤维状卵丘细胞中间出现圆形细胞形成的细胞集落后，更换为含4yg/ ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液继续培养，胰酶消化圆形细胞集落，接种消化的细胞于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液继续培养，细胞每天半量换液，2-3d传代一次。
全文摘要
本发明公开了一种猪卵丘干细胞的分离方法。其方法是抽取青年母猪卵丘卵母细胞复合物，卵母细胞体外成熟培养后，消化脱离卵丘细胞，收集消化的卵丘细胞进行培养，待有细胞集落出现并形成较大的细胞集落后，消化传代接种到饲养层上，在含有细胞因子的培养液中进行培养，分离培养的卵丘干细胞具有鸟巢状细胞生长形态，细胞圆形、核较大，细胞表达干细胞特有的标记Oct4、Nanog、SSEA1，体外分化能够形成来源于三个胚层的神经细胞、肌肉细胞和肝脏细胞，结果显示从猪卵丘细胞中分离培养了卵丘干细胞。
文档编号C12N5/074GK102268404SQ201110204169
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者丁建平, 任春环, 刘亚, 刘洪瑜, 张子军, 张运海, 方富贵, 曹鸿国, 李运生, 杨盼, 章孝荣, 蒲勇, 陶勇 申请人:安徽农业大学