末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置及末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离方法
【专利摘要】一种末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其具备金属过滤器，所述金属过滤器具有能够捕捉体液中的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞的凹坑和形成于该凹坑中且能够使末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞以外的体液细胞通过的孔。
【专利说明】末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置及末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及用于分离体液中的末梢循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell;以下也称为“CTC”)或稀少细胞的、具备特定的多孔性金属过滤器(以下也仅称为“CTC分离过滤器”)的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置(以下也仅称为“CTC分离装置”)。
[0003]本发明还涉及从体液中分离末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞的方法，其包括使用上述装置从癌症患者的血液等体液中分离CTC或稀少细胞。
【背景技术】
[0004]在癌症患者的血液中循环的肿瘤细胞或癌细胞被称为CTC。CTC被认为是转移癌的原因之一，暗示CTC检测可能对转移癌的早期诊断有效。但是，CTC为稀少细胞之一，在血中非常少，例如，每18?10 9个血细胞成分中约为I个，因此，提出了若干种CTC的分离方法。例如，分离方法中已知有:利用固定有抗EpCAM(上皮细胞粘附分子)抗体的磁性粒子或在柱状结构等的树脂表面上结合有捕捉抗体的微流体装置的方法；以及利用CTC与血细胞的尺寸的差异、使用过滤器进行分离的方法等(Isolat1n of rare circulatingtumour cells in cancer patients by microchip technology.Sunitha Nagrath 等Nature, 2007，450:1235-1239)、(日本特开 2011-163830 号公报、日本特开 2013-42689 号公报、日本特开2005-10177号公报、日本特表2007-525642号公报、日本特开2009-106936号公报)。
[0005]在利用过滤器的CTC分离方法中，使用过滤器的材质由聚对二甲苯(parylene)(美国专利申请第20110111412A1号)、聚碳酸醋(F.Farace等，Br.J.Cancer, 2011，105:847-853)等聚合物、硅、金属(日本特开2013-42689号公报)等构成且在其表面上具有多个7?10 μ m的孔的微过滤器。从原理上而言，过滤器具有使血液细胞通过而将CTC捕捉到过滤器上的孔尺寸。
[0006]在日本特开2013-42689号公报记载的金属过滤器中，作为优选的金属，从金、银、铜、销、鹤、镲、络、不锈钢或它们的合金中选择，另外，优选贯通孔的短边的长度为5.0?15.0 μ m，平均孔隙率为0.1?50%，过滤器的厚度为3?100 μ m。在其实施例中，使用镍过滤器(平均孔隙率:1.4%、孔的大小:8Χ30 μπκ孔的形状:圆角长方形)，回收掺入在血液中的人类小细胞肺癌细胞系。在该实验中，记载了癌细胞回收率为74.9±10.5%，残留白细胞数为697±84。
【发明内容】
[0007]发明所要解决的问题
[0008]上述的【背景技术】中所记载的、使用过滤器的尺寸选择性CTC浓缩装置与磁珠方式相比，具有简便、低成本等优点。但是，由于需要对作为样本的血液进行溶血的预处理、或者使用泵作为过滤的驱动力，因此，会对CTC造成细胞应激，或者，由于细胞的固定、流路的封闭性而难以进行活细胞的单细胞分离。
[0009]考虑到上述事实，本发明的目的在于实现存活的CTC或稀少细胞的高效回收，而且能够实现简便、轻柔的单活细胞分离。
[0010]用于解决问题的方法
[0011]本发明包含以下特征。
[0012][I] 一种末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其具备金属过滤器，所述金属过滤器具有能够捕捉体液中的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞的凹坑、和形成于该凹坑中且能够使所述末梢循环肿瘤细胞或所述稀少细胞以外的体液细胞通过的孔。
[0013][2]如[I]所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中，所述金属过滤器的材质为钯或钯镍合金。
[0014][3]如[I]或[2]所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中，所述凹坑的直径为20?30 μ m，所述凹坑的深度为5?15 μ m。
[0015][4]如[I]?[3]中任一项所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中，所述孔的直径为7?10 μ m。
[0016][5]如[I]?[4]中任一项所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中，所述凹坑和所述孔的孔密度为I X 14个/cm2?2 X 10 5个/cm2。
[0017][6]如[I]?[5]中任一项所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中，所述金属过滤器的厚度为10?40 μ m。
[0018][7]如[I]?[6]中任一项所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中，具有用于安装所述金属过滤器的过滤器盒。
[0019][8] 一种末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离方法，其中，将选自癌症患者的血液、腹水或腹腔清洗液中的体液注入到[I]?[7]中任一项所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置中，利用所述金属过滤器的所述凹坑捕捉该体液中的所述末梢循环肿瘤细胞或所述稀少细胞后，在存活的状态下回收。
[0020][9]如[8]所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离方法，其中，进一步包括对所述末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞进行特异性染色。
[0021][10]如[8]或[9]所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离方法，其中，包括对所述体液进行稀释或预处理。
[0022][11]如[10]所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离方法，其中，所述预处理包括:将所述体液与含有磁性纳米粒子的阳离子性核糖体混合，使所述体液中的所述末梢循环肿瘤细胞或所述稀少细胞和白细胞中摄入所述磁性纳米粒子后，注入到通入所述金属过滤器的流路中，利用配置在所述金属过滤器前方的磁石将未摄入磁性纳米粒子的红细胞等细胞从该体液中除去。
[0023]发明效果
[0024]根据本发明，能够实现存活的CTC或稀少细胞的高效回收，而且能够实现简便、轻柔的单活细胞分离。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1A是在含有金属过滤器小片的培养基中将MKN-45细胞培养3天来考察金属过滤器的细胞毒性。其示出了对照、钯(Pd)-镍(Ni)合金(80:20)过滤器存在下和镍(Ni)过滤器存在下的细胞增殖曲线。Pd-Ni过滤器存在下的MKN-45细胞显示出与对照基本相同的增殖速度(低细胞毒性)。Pd-Ni过滤器与Ni过滤器相比，细胞毒性明显低。
[0026]图1B是在含有金属过滤器小片的培养基中将MKN-45细胞培养3天并观察细胞的形态。其示出了第3天的细胞的形态。Ni过滤器存在下的MKN-45细胞与对照、Pd-Ni过滤器存在下相比，形态变圆，局部还观察到凋亡的细胞。
[0027]图2A是3D Pd-Ni过滤器的SEM图像。凹坑的直径30 μπκ凹坑的深度10 μπκ孔的直径8 μπκ孔密度99178/cm2(超高孔密度)、交错格子排列。
[0028]图2B是3D Pd-Ni过滤器的SEM图像。凹坑的直径30 μπκ凹坑的深度10 μπκ孔的直径8 μπκ孔密度71656/cm2(高孔密度)、交错格子排列。
[0029]图2C是2D Pd-Ni过滤器过滤器的SEM图像。凹坑的直径30 μπκ凹坑的深度I μπκ孔的直径8 μπκ孔密度40000/cm2、格子排列。
[0030]图2D是市售的聚碳酸醋过滤器(孔径8 μπκ Whatman公司)的SEM图像。
[0031]图2E是示意性地表示图2A所示的金属过滤器的截面图。
[0032]图3A是装置的外观的模式图。装置例如宽度为15cm、进深为12cm、高度为22cm。
[0033]图3B是装置的构成部件的模式图。
[0034]图3C是示意性地表示将各单元组装而成的装置的主视图。
[0035]图4A是在凹坑中捕捉到癌细胞(箭头)的3D过滤器的SEM图像(右图为左图的放大图)。
[0036]图4B是将在10倍稀释的正常人血液2mL中混合500个培养癌细胞(COLM5-EGFP)并用PBS稀释10倍的试样使用3D Pd-Ni过滤器(凹坑的直径30 μπκ凹坑的深度10 μπκ孔的直径8 μ m、孔密度99178/cm2、交错格子排列)进行过滤，将细胞用PE标记的抗⑶45抗体进行染色。左上为GFP荧光图像(癌细胞检测)，右上为PE标记的抗⑶45抗体的染色图像(白细胞检测)。只观察到少数白细胞，未观察到癌细胞与白细胞存在于同一凹坑内的图像。右下为在过滤器盒上通过手动对操作器(玻璃毛细管)进行操作来对癌细胞进行单细胞分离时的亮视野图像。箭头为操作器。
[0037]图5A是将在正常人血液2.5mL中混合500个培养癌细胞(COLM5-EGFP)并用PBS稀释10倍的试样使用3D Pd-Ni过滤器进行过滤，改变装置的流速来考察癌细胞的回收率
(% )o
[0038]图5B是将在正常人血液2.5mL中混合培养癌细胞(COLM5-EGFP)并用PBS稀释10倍的试样使用3D Pd-Ni过滤器进行过滤，改变癌细胞数来考察癌细胞的回收率(％ )。装置的流速为2ml/分钟。
[0039]图6A是将从皮下移植有培养癌细胞(COLM5-EGFP)的裸鼠体内在移植3个月后采集到的血液使用3D Pd-Ni过滤器进行过滤，观察GFP荧光。左图为GFP荧光图像，右图为相位差显微镜的亮视野图像。箭头为CTC。
[0040]图6B是将从皮下移植有培养癌细胞(COLM5-EGFP)的裸鼠体内在移植I?2个月后和2?3个月后采集到的血液使用3D Pd-Ni过滤器进行过滤，测定CTC数。
[0041]图7A是将胃癌患者的末梢血使用3D Pd-Ni过滤器进行过滤，并将细胞用荧光标记抗体进行染色。左上为Alexa488标记的抗EpCAM抗体的染色图像，右上为PE标记的抗⑶45抗体的染色图像，左下为Hoechst33342的染色图像，右下为亮视野图像。箭头为CTC。
[0042]图7B是将乳腺癌患者的末梢血使用3D Pd-Ni过滤器进行过滤，并将细胞用荧光标记抗体进行染色。左起依次为Alexa488标记的抗EpCAM抗体的染色图像、PE标记的抗⑶45抗体的染色图像、Alexa350标记的抗CK Oscar抗体的染色图像、亮视野图像。箭头为CTC0
[0043]图7C是对渐进性乳腺癌患者(6名)、渐进性胃癌患者(4名)和正常人(4名)的末梢血5mL中的CTC数进行测定。
[0044]图8A是对利用了使用X射线或紫外线的光刻和电铸的钯镍过滤器的制造方法进行说明的模式图。
[0045]图SB是对利用了使用X射线或紫外线的光刻和电铸的钯镍过滤器的制造方法进行说明的模式图。
[0046]图SC是对利用了使用X射线或紫外线的光刻和电铸的钯镍过滤器的制造方法进行说明的模式图。
[0047]图8D是对利用了使用X射线或紫外线的光刻和电铸的钯镍过滤器的制造方法进行说明的模式图。
[0048]图SE是对利用了使用X射线或紫外线的光刻和电铸的钯镍过滤器的制造方法进行说明的模式图。
[0049]图8F是对利用了使用X射线或紫外线的光刻和电铸的钯镍过滤器的制造方法进行说明的模式图。
【具体实施方式】
[0050]对本发明的实施方式进行详细说明。
[0051]1.分离末梢循环肿瘤细胞(CTC)或稀少细胞的金属过滤器
[0052]本说明书中的“CTC”为癌症患者的血液中含有的循环肿瘤细胞，是指与血液细胞等体液细胞相比细胞数非常少的稀少的细胞。
[0053]本说明书中的“稀少细胞”是指癌症患者的腹水、腹腔清洗液、淋巴液、脑脊液等体液中含有的稀少的肿瘤细胞(“稀少癌细胞”)。
[0054]本实施方式的金属过滤器17是在由特定的金属构成的极薄板上均匀地或规则地形成有数量非常多的孔(孔密度I X 1Vcm2以上)的多孔性金属过滤器。现有公知的CTC分离过滤器由聚对二甲苯(parylene)、聚碳酸酯等树脂(或聚合物)、硅形成。与此相对，本实施方式的CTC分离过滤器为金属过滤器17，其具有以下所述的、不同于树脂过滤器等的优良特性。
[0055]金属过滤器17的材质例如包含钯(Pd)、铂(Pt)、金(Au)、银(Ag)、铱(Ir)、铑(Rh)或?了 (Ru)中的至少一种。其材质可以为韦巴(Pd)、钼(Pt)、金(Au)、银(Ag)、铱(Ir)、铭(Rh)或钌(Ru)的单质金属，或者也可以为例如钯(Pd)-镍(Ni)合金、铂(Pt)-镍(Ni)合金或金(Au)-镲(Ni)合金等。在合金的情况下，优选相对于镲等对象金属，上述金属的比率高。这些金属与例如镍(Ni)等金属相比，对CTC、稀少细胞等细胞的毒性非常低(图1)。其理由在于，钯(Pd)自身的毒性低，并且，Pd与镍(Ni)的合金通过形成固溶体，能够防止镍(Ni)的溶出。其中，从金属成本、低毒性的观点出发，优选钯或钯(Pd)-镍(Ni)合金，在Pd-Ni合金的情况下，优选Pd超过50% (重量)的合金，例如Pd80%-Ni20%的合金。Pd与Ni的合金过滤器、Pd过滤器等本实施方式的金属过滤器具有耐酸性、耐热性，能够直接对过滤器进行FISH法等各种染色，并且能够直接进行(正置)显微镜观察。另外，具有硬度且耐久性高，即使不进行表面处理，细胞也不易粘附，因此，容易利用过滤器上的玻璃毛细管进行显微操作(micromanipulat1n)(图4B)。因此，本实施方式的金属过滤器17具有能够立即应对单细胞分离的自动化的优良优点。
[0056]金属过滤器17的形状只要能配置到安装在CTC分离装置的过滤单元中的过滤器圈(盒)上，则没有特别限定，例如包括圆形、方形等形状，优选为圆形。另外，金属过滤器17的尺寸可以考虑样品(血液)量、孔径、时间、流速、耐压等物理因素、操作性、成本等来适当确定。例如，在处理5mL血液的情况下，直径(圆形的情况下)或纵、横的长度(方形的情况下)通常为约10?15mm，但也可以根据血液量将尺寸非限定性地设定为例如约5?20_的范围。另外，金属过滤器17的厚度考虑与孔密度、耐压、成本等的关系来适当确定，通常为10?40 μπκ优选为约15?40 μπι。
[0057]如图2Α、图2Β、图2Ε所示，金属过滤器17具有均匀且规则地配置的多个孔101。该孔101形成在后述的凹坑102中。每Cm2过滤器表面积的孔101的密度根据格子排列、交错排列等排列的形态而不同，通常为IX 14?2 X 10 5/cm2、优选为5 X 14?I X 10 5/cm2。另外，孔101的孔径具有不使CTC或稀少细胞通过、且能够使血细胞等血液成分等、CTC或稀少细胞以外的体液细胞通过的尺寸。人类血细胞成分的大小(长径)的直方图分析的结果是，红细胞为约6?7 μ m，白细胞为约7?9 μ m，血小板小于5 μ m，与此相对，CTC或稀少细胞为约10?20 μπι。因此，孔101在凹坑102中的开口位置的孔径通常为约7?10 μπκ优选为约7.5?9 μ m、进一步优选为约7.5?8.5 μ m。
[0058]金属过滤器17还具有能够捕捉CTC或稀少细胞的大小的凹坑102 (或凹部)。凹坑102的尺寸只要是能够捕捉CTC或稀少细胞的尺寸即可，非限定性地例如直径为20?30 μπι且深度为5?15 μm，优选直径为25?30 μπι且深度为10 μπι。上述的凹坑102可以形成在上述的全部或一部分的孔101的上部，为了维持高的孔密度，优选这样的形态。深度小于5 μ--时，CTC无法进入。为了使CTC几乎完全进入，需要至少约5?15 μπι的深度。这样的凹坑102的数量相对于孔101的数量优选为80?100%、进一步优选为100% (即，在所有的孔101的上部存在凹坑102)。
[0059]金属过滤器17中，孔101 “规则地配置”为尽可能达到高密度的配置，是指所有的孔101以特定的规则性排列。这样的规则性包括例如格子状的排列、交错格子的排列、放射状的排列、同心圆状的排列等(图2Α、图2Β和图2C)。图2Α、图2Β(交错格子排列)中，在孔101的上部形成有深度10 μπι的凹坑102，整体上形成立体结构，因此，在本说明书中，将这样的形态的过滤器称为3D过滤器。另一方面，图2C (格子排列)中，在孔101的上部存在深度I ym的凹坑，但整体上具有接近于平面的结构，因此，在本说明书中，将这样的凹坑的深度小于5 μ m的形态的过滤器称为2D过滤器。该2D过滤器相当于日本特开2011-163830号公报的图5所示的尺寸选择性微腔阵列。该2D过滤器的凹坑相对于CTC或稀少细胞的大小而言过浅，因此，无法将孔中捕获的该CTC或稀少细胞与周围的残留血液细胞隔离。与此相对，本实施方式的金属过滤器17为3D过滤器，通过设置凹坑102，基于I)能够在没有血细胞污染的情况下将CTC逐个地排列(图案化)；2)利用在一定的条件下产生的与重力反向的流动，优化与水压的平衡，由此能够控制细胞被孔101捕获的强度；等理由，通过操作能够准确且简便地进行轻柔的单细胞选取(图4A)。但是，凹坑102的深度过深时(超过15 μ m时)，虽然对CTC的回收率、过滤速度没有影响，但会相反地使单细胞图案化变得不完全，在选取时可能会产生形成阻力等不良情况。
[0060]金属过滤器17的周缘优选以无孔的方式进行了镶边。通过存在缘部，CTC计测变得准确，另外，能够使用镊子夹持而不损伤金属过滤器17。另外，通过设置凹坑102，有时会因电铸的条件而使金属过滤器17略微产生翘曲，但如果通过超声波熔敷等从上下镶有聚碳酸酯等支撑材料，则能够矫正翘曲。
[0061]本实施方式的金属过滤器17例如可以利用LIGA(Lithogaphie GalvanoformungAbfomung，光刻电镀模塑)技术来制作(服部正、表面技术、Vol.62，N0.12，619-624，2011 ；ff.Elufeld and H.Lhe, Radiat.Phys.Chem.，45 (3): 340-365，1995)。作为一例，可以通过如下方法来制作电铸过滤器，该方法包括:在基板上层叠抗蚀剂、吸收材料(任选成分)、掩模，照射紫外线、X射线或同步加速放射光(、> y夕口卜口 y放射光)而形成抗蚀剂图案后，进行以基板作为电极进行电铸的金属镀敷，在残留预定开孔的时刻结束电铸，进一步进行抗蚀剂的除去(参考图8A?图8F)。
[0062]2.末梢循环肿瘤细胞(CTC)或稀少细胞分离用装置
[0063]本实施方式还提供用于从血液等体液中分离CTC或稀少细胞的装置，其特征在于，具备多孔性的金属过滤器17。
[0064]多孔性的金属过滤器17已在上述1.的部分中进行了说明。从成本等方面考虑，优选的过滤器为钯(Pd)过滤器或钯(Pd)-镍(Ni)合金过滤器。
[0065]在本实施方式的装置中，以使流路相对于金属过滤器17垂直的方式安装该金属过滤器17。金属过滤器17通常以可装卸或不可装卸的方式设置在过滤器盒16上，该过滤器盒16固定在装置上。过滤器盒16由具备具有用于固定金属过滤器17的适当宽度的缘且内侧形成开放空间的上下两片构件(上、下过滤器圈)构成，金属过滤器17被固定在该构件之间。根据需要，可以在该构件与金属过滤器17之间夹入衬垫(例如，特氟龙(注册商标)、橡胶、纸等)，由此，能够防止金属过滤器17的变形和漏液(图3B?图3C)。过滤器盒16的构件由树脂(聚合物)、橡胶、金属等材质构成，两个构件中设置有用于固定过滤器的机构。这样的机构可以列举例如螺纹等。或者，过滤器盒16也可以为单纯地通过来自上下的压力将金属过滤器17固定(压入)的结构。或者，也可以以金属过滤器17与过滤器盒16成为一体的方式制作过滤器盒16，这种情况下，金属过滤器17以无法拆卸的方式固定在过滤器盒16上。
[0066]除了包含安装有金属过滤器17的过滤器盒16的过滤单元11以外，装置还可以进一步包括储存单元10、流量调节单元12和废液回收单元14 (储液瓶)(图3A)。
[0067]储存单元10为装入血液等体液样品的容器，由玻璃、聚合物等能够辨别液面的(例如透明的)材质构成，根据需要，可以具有液量(即计量)刻度。
[0068]过滤单元11已在上文进行了说明，包括用于以可装卸的方式安装金属过滤器17的过滤器盒16。
[0069]流量调节单元12具有用于对从储存单元10、包含过滤器盒16的过滤单元11中通过并由于自重(即重力)而自然流下的血液等体液的流量或流速进行调节的装置。这样的装置例如为具有锐角结构的尖端的旋入式凸型螺栓，将螺栓旋紧时，压迫废液管，流量减少或者为零(停止)，另一方面，打开螺栓时，流量增加。螺栓例如由金属、树脂、聚合物等材质构成。
[0070]废液回收单元14包含对过滤后的血液等体液、清洗装置时的废液等进行回收的容器(储液瓶)。该废液回收单元14例如由玻璃、树脂、聚合物、金属等材质构成。
[0071]关于各单元间的固定，例如，可以利用通过旋转进行安装或拆卸的螺栓机构9(图3A)来进行固定，也可以利用插入式的间隙配合18 (图3C)来进行，或者，也可以利用其他惯用的固定工具来进行。此外，在上述各单元的基础上，还可以设置用于设置将单元组装而成的结构体的支架。
[0072]将装置的一例示于图3A (外观)、图3B (构成部件)和图3C(组装时的装置的主视图)中。图中，过滤单元11包含过滤器盒16。流量调节单元12包含液量调节螺栓8。废液回收单元14在其上面设置有储液盖13，在其侧面上部设置有空气孔7。装置中还包含支架15。
[0073]从加工容易性、成本的方面考虑，优选装置的整体由丙烯酸树脂等树脂或聚合物形成。如果是透明的材质，则能够监控液体的流下速度，因此优选。关于装置的大小，在不包括支架15的组装结构体的情况下，为横宽约10?15cm、高度约20?30cm、适合过滤约5?7.5mL的血液样品的尺寸，即使在样品的容量大的情况下，通过分成小份来施加，以该尺寸也能够充分应对。
[0074]另外，以上的记载为试制机的规格，对于量产型机则另当别论，依照该试制机制作模具，例如利用树脂、塑料等材料进行制作，因此，能够生产低成本的一次性装置。
[0075]本实施方式的装置为利用自重(重力)获得用于过滤的流速的无泵(即不使用泵)方式，因此为开放体系。这与公知的过滤器型CTC分离装置中采用的泵式或负压管式的驱动力不同。在这些以往的方式中，存在对细胞造成应激、或者由于细胞的固定、流路的密闭性而难以分离活细胞的单细胞等问题，但本实施方式的装置能够解决这些问题。
[0076]通过细胞毒性非常低的钯等在金属过滤器17中的应用、该金属过滤器17的超高孔密度、平坦表面加工以及金属过滤器17的3D化，本实施方式的装置即使不对血液等体液进行预处理，也能够在将CTC或稀少细胞被孔101捕获的流速维持于较低流速的状态下进行血液细胞的高速过滤。具体而言，包括清洗在内能够用约30分钟将5ml的全血进行高速过滤，但从孔101中通过的流速却较慢。另外，由于孔101具有极为平滑的表面性状，因此对细胞造成的应激、伤害性低。
[0077]其结果，能够在血细胞等的污染少的状态下使CTC或稀少细胞进行排列。而且，通过在孔101的上方设置凹坑102，认为在一定的条件下会发生在流体力学上与重力反向的流动。因此，CTC不会很深地被孔101捕获，因而能够将对CTC施加的剪切应力抑制在最低限度。因此，能够将CTC或稀少细胞的细胞伤害抑制在最低限度，能够以几乎100%的存活率且以约80%以上的回收率分离CTC或稀少细胞。
[0078]3.末梢循环肿瘤细胞(CTC)或稀少细胞分离方法
[0079]本实施方式还提供使用上述中说明的安装有金属过滤器17的装置从癌症患者的体液中分离CTC或稀少细胞的方法。
[0080]具体而言，该方法为一种从体液中分离CTC或稀少细胞的方法，其中，包括:向本实施方式的装置中注入癌症患者的、选自例如血液、腹水、腹腔清洗液、脑脊液或淋巴液中的体液；以及通过仅依赖于重力的流速将CTC或稀少细胞分离到金属过滤器17的上部。
[0081]作为样本的癌症患者的体液为含有CTC或稀少细胞的体液或者疑似含有CTC或稀少细胞的体液，主要为血液或淋巴液。
[0082]CTC或稀少细胞的分离中使用的体液的量(体积)通常为I?20mL，优选为3?7mL。通常，体液(特别是血液)在使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)(根据目的使用含有0.25?ImM EDTA的PBS)稀释例如2?20倍后进行过滤。特别是在血液量、血细胞数多的情况下，可以进行以下的预处理。
[0083]预处理例如包括:将体液与含有磁性纳米粒子的阳离子性核糖体(MCL)混合，使体液中的CTC或稀少细胞和白细胞中摄入该磁性纳米粒子后，注入到通入本实施方式的金属过滤器17的流路中，利用配置在流路中途的磁石将未被磁化的红细胞等细胞预先从该体液中除去(预过滤)。该预处理利用了如下性质:通常，红细胞中不摄入磁性纳米粒子，另一方面，CTC或稀少细胞、白细胞中摄入磁性纳米粒子。通过该预过滤将红细胞除去，解除磁力后，将CTC或稀少细胞和白细胞导入到该过滤器装置中，由此，能够在大幅减慢金属过滤器17的流速的状态下将白细胞除去，因此，CTC或稀少细胞残留在金属过滤器17的凹坑102中而不会被孔101强力地捕获。在组合使用这样的预处理和利用本实施方式的金属过滤器17的处理的情况下，与单独进行利用金属过滤器17的处理的情况相比，对CTC或稀少细胞施加的剪切应力减小，能够以更高的回收率(80?90% )进行回收(图5A、图5B)。
[0084]该方法是将体液注入到装置中、通过重力下的流速进行过滤的简单方法，但通过使用超高孔密度(例如，5X104?1.5X105/cm2)的3D金属过滤器17，能够实现可容许的充分的快速处理。例如，包括清洗在内能够用约30分钟处理约5.0mL的样本(全血)。清洗液使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)，但根据需要也可以EDTA。
[0085]接着，为了对金属过滤器17上的CTC或稀少细胞的数量进行计测，使用与CTC或稀少细胞特异性结合的荧光标记抗体例如Alexa488标记的抗EpCAM抗体、或与白细胞特异性结合的PE标记的抗CD45抗体等抗体混合物，对CTC或稀少细胞进行染色，利用显微镜计测CTC或稀少细胞的个数等。此时，染色可以直接在固定于装置上的金属过滤器17上进行。
[0086]染色后，将过滤器盒16从装置中取出，直接使用过滤器盒16在正置型荧光显微镜下计数CTC数，进而，可以使用包含微细的玻璃毛细管的操作器将CTC或稀少细胞从金属过滤器17的凹坑102中逐个回收。另外，用于考察有无基因扩增的FISH法可以通过将金属过滤器17从过滤器盒16上取出并直接固定来进行。
[0087]另外，本实施方式的3D Pd-Ni合金过滤器装置也可以用于荷瘤小鼠的末梢血中的CTC的测定。本发明人使用导入有GFP的大肠癌细胞系(COLM5-EGFP)、胃癌细胞系(GCIY-EGFP)等的皮下移植自然转移模型，制作了能够以良好的重现性检测CTC的多个系的CTC模型(小鼠)。采集移植I?3个月后的小鼠后腔静脉血，使用本实施方式的3DPd-Ni合金过滤器装置进行过滤，以GFP荧光作为指标测定CTC数。结果确认，在小鼠血液中，与转移的程度相关地检测到CTC (图6A、图6B)。此外还确认，从回收的数个CTC中提取RNA、DNA,能够对特定的基因的表达、基因突变进行分析。
[0088]进而，对于乳腺癌患者和胃癌患者等的实际的临床样本(末梢血)，也使用本实施方式的3D Pd-Ni合金过滤器装置进行过滤，并测定了 CTC染色后的CTC数，结果，与小鼠CTC模型同样，在转移性患者样本中，与正常人的血液相比，检测到显著多的CTC，从而也确认了本实施方式在临床样本中的有效性(图7A、图7B、图7C)。
[0089]由上可以期待，本实施方式的方法今后在转移复发的早期诊断、伴随诊断和药剂的治疗效果的评价等转移癌的诊断和治疗方法这两方面担负重要的作用。另外可以预料，本实施方式的装置和方法对于CTC在生物体内的动态等转移机制的阐明等基础研宄也很有用。
[0090]实施例
[0091]以下示出实施例进一步对本实施方式进行详细说明，但本实施方式的技术范围不受这些具体例的限制。
[0092][实施例1]
[0093][钯镍过滤器的制造方法]
[0094]如图8A所示，在基板19上以预定的厚度涂布感光性抗蚀剂20。需要说明的是，在使用不具有导电性的硅基板、玻璃基板作为基板19的情况下，附加导电膜层(例如铜)，但也可以为不锈钢基板、镍基板、铜基板等具有导电性的基板。
[0095]接着，如图SB所示，通过描绘有预定图案的Cr掩模21照射紫外线22，由此实施曝光。在此，在使用X射线代替紫外线22作为光源的情况下，使用X射线掩模代替Cr掩模
21ο
[0096]接着，如图8C所示，经过显影工序将感光性抗蚀剂20在基板19上图案化。
[0097]接着，如图8D所示，利用电铸使钯镍合金(Pd-Ni) (Pd:Ni重量比、例如80:20)的析出成膜23从基板19的表面析出，以覆盖图案化的感光性抗蚀剂20的方式利用电铸连续地实施Pd-Ni的析出成膜23的析出，在残留预定的开孔24的时刻结束电铸。
[0098]接着，如图8Ε所示，利用有机溶剂将形成的感光性抗蚀剂20除去。该感光性抗蚀剂20的除去可以利用使用氧等离子体进行的干法蚀刻。
[0099]最后，如图8F所示，将基板19剥离或蚀刻除去。
[0100]经过这样的工序，制成了钯镍过滤器(也称为“3D过滤器”或“Pd-Ni过滤器”)。
[0101][实施例2]
[0102][钯镍过滤器的特征化]
[0103]该钯镍过滤器通过利用单独且高度的电铸技术进行微细加工而制作，因此，与其他的聚碳酸酯、聚对二甲苯或硅制的过滤器相比，能够实现100000/cm2以上的高孔密度和10%以上、通常为50%以上的高孔隙率。由此，能够进行全血的高速过滤，也不会堵塞，能够实现CTC的高效且快速的回收(图2A和图2B)。另外，通过平滑的表面性状、孔的均匀性等高精度的加工以及以细胞毒性少的钯为材质，还能够大幅减小细胞损伤(图1A、图1B)。
[0104]另外，本钯镍过滤器能够进行121°C、30分钟的热处理(Autoclave，高压釜)，而且在利用次氯酸(市售的夕一)、1当量盐酸进行的化学药品耐性试验(I小时)中，形状没有任何变化，另外，在CTC回收率等功能方面也未见变化。由此，能够进行灭菌处理，能够实现医疗领域中的利用、再利用等低成本化。
[0105][实施例3]
[0106][使用培养癌细胞的细胞加标(CellSpike)实验]
[0107]将人类胃癌细胞MKN-45、GCIY和人类大肠癌细胞COLM-5以1.0 X 16个/1cm皿接种到含有10%胎牛血清的RPMI培养基中，在37°C /5% CO2的条件下静置培养。培养3?4天后，抽吸除去培养基，用PBS(pH7.2)清洗后，添加0.2%胰蛋白酶/2mM EDTA，在370C /5% CO2的条件下温育3?5分钟。镜检确认细胞已从皿上剥离，加入含有血清的RPMI培养基，终止胰蛋白酶的作用后，进行吹吸，并回收细胞。将回收的细胞离心分离(1200rpm、3分钟)，抽吸除去上清并重悬到新鲜的RPMI培养基中。通过使用台盼蓝(卜y/《>7''少一)的色素排除法计数活细胞数，制备成IX 16细胞/ml后，接种到新皿中。
[0108]细胞捕捉(Cell Spike，细胞加标)实验中，使用作为在人类大肠癌细胞C0LM-5和人类胃癌细胞GCIY中强制表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的细胞系的C0LM5-EGFP细胞、GCIY-EGFP细胞。使用如上制备的细胞悬浮液，在从正常人采集到装有EDTA2Na的真空采血管内的血液2?2.5ml中混合50、500或5000个培养癌细胞来准备样品。
[0109][利用过滤器装置的培养癌细胞的分离方法和检测操作]
[0110]在安装有3D过滤器的CTC分离装置的储存单元中导入含有ImM EDTA/0.5% BSA的PBS 5ml而对储存和过滤器进行清洗后，将添加有导入或未导入GFP的培养癌细胞(50、500或5000个)的血液(2?2.5ml)用PBS稀释5?10倍并导入。约10分钟的过滤后，为了清洗残留的血细胞成分，导入5ml PBSo在未导入GFP的培养癌细胞的情况下，使PBS清洗液流尽后，旋紧液量调节螺栓，关闭流路后，导入500 μ I的细胞染色液(Alexa488标记的抗EpCAM抗体、PE标记的抗CD45抗体和Hoechst33342 ;分别为0.5 μ g/ml)。在导入有GFP的培养癌细胞的情况下，导入由后两者构成的细胞染色液。避光在室温下反应30分钟后，打开液量调节螺栓，排出细胞染色液。向储存器中导入5ml含有ImM EDTA/0.5% BSA的PBS，对过滤器上的细胞进行清洗。仅使用PBS再进行一次该操作，旋紧液量调节螺栓后，立即将过滤器盒从CTC分离装置中取出，向过滤器盒上部的储液部中添加100?200 μ I的PBS，放置到显微镜载物台上，直接进行荧光显微镜观察。
[0111]为了对不具有透光性的金属过滤器上捕捉、回收的癌细胞进行观察，使用装备有制冷C⑶相机(R1-1 ;尼康)的正置反射荧光显微镜(Eclipse LV100ND ;尼康)，为了对来自Hoechst33342、Alexa488、PE的荧光进行观察，使用UV-1A、FITC、Cy3滤光片，分别获取图像。图像获取和分析软件使用NIS-Elements (尼康)。
[0112][使用过滤器装置的培养癌细胞的回收率的研宄]
[0113]在安装有3D过滤器的CTC分离装置中具有液量调节螺栓，通过对因自重而流过的液量进行调节，能够控制流速。使用混合有500个培养癌细胞的10倍稀释血液(将2.5ml的血液用PBS稀释10倍)，对以2ml/分钟、4ml/分钟或8ml/分钟改变流速时的回收率进行研宄。3D过滤器使用凹坑的直径30 μπκ凹坑的深度10 μπκ孔的直径8 μπκ孔密度99178/cm2、交错格子排列的Pd-Ni过滤器。其结果，在2ml/分钟、4ml/分钟时分别显示出约90%、80%的高回收率，但在8ml/分钟时，为70%以下。可知在2?4ml/分钟的流速下能够得到80?90%的回收率，因此，以下的实验以该范围的流速进行(图5A)。
[0114]接着，将2.5ml的血液用PBS稀释10倍，混合10、50、500或5000个培养癌细胞，研宄癌细胞的回收率。装置的流速为2ml/分钟。从混合有50、500、5000个细胞的稀释血液中回收的回收率为85?95% (图5B)。从仅混合有10个细胞的稀释血液回收的回收率平均为70%，考虑到细胞数的计数的偏差，表明即使是少数的细胞也具有高回收效率。
[0115][回收的细胞的存活率的研宄结果]
[0116]将混合有5000个培养癌细胞的稀释血液(将2.5ml的血液用PBS稀释10倍)用3D过滤器进行分离，通过使用台盼蓝的色素排除法对捕捉到的细胞的存活率进行计数。3D过滤器使用凹坑的直径30 μ m、凹坑的深度10 μ m、孔的直径8 μ m、孔密度99178/cm2的Pd-Ni过滤器。回收的细胞的存活率为99%，表明其为细胞伤害性非常低的回收方法。其中，在ImM以上的EDTA存在下进行过滤的情况下，观察所回收的癌细胞的增殖性时，与对照(未添加EDTA)相比显著低。但是，如果使用肝素作为抗凝剂、使用胶原蛋白包被皿来促进粘附，则增殖性显著恢复。因此，认为在EDTA存在下进行过滤时回收癌细胞的增殖性降低的原因与其说是由过滤器装置引起的应激，还不如说是长时间的EDTA处理。
[0117][使用3D过滤器的培养癌细胞的单细胞回收的研宄]
[0118]为了提高癌细胞的捕捉、排列和回收的效率，将金属过滤器加工成如图2A所示在贯通孔的上部设置有凹坑的3D形状。该形状期望直径为20?30 μ m、深度为5?15 μ m，在使用尖端直径加工为约40 μπι的玻璃毛细管对捕捉到的细胞进行抽吸回收的情况下，凹坑的直径为30 μπι时最容易进行回收。关于凹坑的深度，如果将5 μπι与10 μπι进行比较，则深度为10 μπι时，与深度为5 μπι时相比，即使由于操作器等而使液面移动，细胞也不易从捕捉其的凹坑中移动出来，因此，能够稳定且无污染地回收作为目标的单细胞(图4Β中示出了使用操作器回收I个癌细胞时的亮视野图像)。使用肝素作为抗凝剂时，细胞对金属过滤器的粘附性增强(需要说明的是，在EDTA存在下细胞对金属过滤器几乎不显示粘附性)、利用操作器的细胞的回收率降低。因此，认为需要根据目的区别使用抗凝剂。
[0119][实施例4]
[0120][从CTC模型小鼠进行的CTC分离]
[0121]体外的培养细胞与体内的CTC的细胞生存环境显著不同，因此，仅通过在正常人血液中添加培养癌细胞的细胞加标实验，难以准确地评价CTC分离装置的性能。另一方面，对于患者的临床样本而言，如果不收集癌症的进行度(stage，期)不同的多数病例、对其进行测定并进行统计性分析，则难以评价装置的性能。与此相对，如果存在在癌细胞移植后随时间推移以具有重现性的方式出现CTC的小鼠(以下称为“CTC模型小鼠”)，则可望对CTC分离装置的性能进行快速且准确的评价。另外，CTC模型小鼠对CTC在生物体内的动态分析等CTC的基础研宄也极为有用。因此，单独进行了 CTC模型小鼠的制作。
[0122][CTC模型小鼠的制作及使用其的过滤器装置的评价]
[0123]将通过导入GFP基因而发出高亮度的绿色荧光的、转移性高的胃癌细胞系(GCIY-EGFP)和大肠癌细胞系(COLM5-EGFP)分别移植到裸鼠的皮下。经时后处决小鼠，从后腔静脉采取0.5?1.0ml的血液，用PBS稀释10倍后，使用CTC分离装置测定CTC。同时使用倒置型荧光显微镜研宄有无肺、肝、肾等的微小转移。在大肠癌COLM5-EGFP皮下移植模型中，直至移植后I?2个月为止，肺转移限于少数的微小转移，CTC数也几乎为O (零)，为偶尔检测到I?2个CTC的程度。另一方面，在移植后2?3个月，肉眼也可观察到肺转移，少数在肝、肾也观察到转移，此时检测到约10?100个CTC，多时检测到1000个以上的CTC (结果示于图6A和图6B中)。在胃癌GCIY-EGFP皮下移植模型中，也与肉眼的转移和全身转移的出现相应地检测到CTC。使用该装置在使用小鼠Lewis肺癌细胞系(Lewis-GFP)的肺癌模型中也同样地进行实验，明确了 CTC的出现与向肝、肾等的多器官转移同步。由CTC与肉眼的转移、全身性转移同步出现暗示，CTC检测可能对癌症转移的早期诊断有用。另外，由使用CTC模型小鼠的研宄表明，该装置具有能够准确地捕捉CTC在生物体内动态的充分的灵敏度和精度。
[0124]对从模型小鼠分离的CTC进行各种基因分析。免疫荧光染色中，可以直接在金属过滤器上进行染色，在HER2阳性胃癌荷瘤小鼠CTC中能够检测到HER2的过量表达。对使用操作器回收的CTC进行了基因分析，结果确认，对于I个?数个CTC，从其中提取、扩增RNA、DNA,能够进行利用RT-PCR法的HER2等的基因表达的分析、利用直接测序法的K-Ras等的基因序列的分析等。
[0125][实施例5]
[0126][从胃癌患者和乳腺癌患者的末梢血进行的CTC分离]
[0127]使用装有EDTA2Na的采血管从4名胃癌患者、6名乳腺癌患者、4名正常人的肘静脉进行5ml的采血。4名胃癌患者和6名乳腺癌患者为在爱知县癌症中心中央医院(日本、名古屋)住院的患者。从患者进行的采血获得了爱知县癌症中心伦理委员会(日本、名古屋)的许可，并在自患者处获得同意书后进行。
[0128]从各人进行采血后，在I小时以内用PBS稀释10倍，施加到CTC分离装置中，进行过滤。CTC分离装置的金属过滤器使用凹坑的直径24μm、凹坑的深度10μm、孔的直径8 μm、孔密度136325/cm2的3D Pd-Ni过滤器。过滤以2.5ml/分钟的流速进行。将过滤器盒上的细胞用PBS清洗，用10%福尔马林在室温下固定10分钟，清洗后，将含有Alexa488标记的抗EpCAM抗体、PE标记的抗⑶45抗体、以及根据情况使用的Alexa350标记的抗CKOscar抗体的细胞染色液添加到过滤器盒上，在室温下反应30分钟。进一步用PBS清洗后，用H0echst33342进行核染色。用PBS清洗后，将每个过滤器盒转移到正置型荧光显微镜上，将 EpCAM+/ (CK Oscar+) /CD45-/Hoechst33342+细胞判定为 CTC，计测 CTC 数。结果，在正常人中4名的CTC均为O个，与此相对，在4名渐进性胃癌患者中分别为0、2、4、11个，6名渐进性乳腺癌患者中分别为1、3、4、11、15、22个。将胃癌患者的染色图像示于图7A中，将乳腺癌患者的染色图像示于图7B中，将CTC数的测定结果示于图7C中。
[0129][实施例6]
[0130][利用磁性纳米粒子的细胞的磁分离的组合使用]
[0131]使用胃癌细胞N87，以CTC的全部回收为目标，将使用磁性纳米粒子的磁分离(预处理)和使用3D Pd-Ni过滤器的利用大小进行的分离组合使用，尝试提高回收率。使磁性阳离子脂质体(直径150nm) 10pg/细胞与100个N87细胞的细胞悬浮液作用2小时，混合到含有20万个白细胞的牛血清中后，使用组合有磁分离流路和过滤器的装置进行捕捉。能够捕捉回收约80?90%的细胞，与单独使用过滤器相比，观察到回收率的提高。
[0132]产业实用性
[0133]安装有本发明的金属过滤器的装置以高回收率实现了血液等体液中的CTC或稀少细胞的分离，并且能够将CTC或稀少细胞以接近无伤(intact)的状态回收，因此，不仅能够用于CTC数量的评价，而且能够用于单一 CTC细胞的基因分析，能够有效地用于转移性复发的早期诊断、治疗效果的监测、体液活检(Liquid b1psy)等的可能性高。
[0134](标号说明)
[0135]7…空气孔
[0136]8…液量调节螺栓
[0137]9…螺栓机构(固定用)
[0138]10…储存单元
[0139]11…过滤单元(其中包含过滤器盒)
[0140]12…流量调节单元
[0141]13…储液盖
[0142]14…废液回收单元(储液瓶)
[0143]15…支架
[0144]16…过滤器盒(也称为过滤器圈)
[0145]17…金属过滤器
[0146]18…间隙配合(插入式)
[0147]19…基板
[0148]20…感光性抗蚀剂
[0149]21 …Cr 掩模
[0150]22…紫外线
[0151]23...钮(Pd)-镍(Ni)合金的析出成膜
[0152]24…开孔
【权利要求】
1.一种末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其具备金属过滤器，所述金属过滤器具有能够捕捉体液中的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞的凹坑、和形成于该凹坑且能够使所述末梢循环肿瘤细胞或所述稀少细胞以外的体液细胞通过的孔。
2.如权利要求1所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中， 所述金属过滤器的材质为钯或钯镍合金。
3.如权利要求1或2所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中， 所述凹坑的直径为20?30 μ m，所述凹坑的深度为5?15 μ m。
4.如权利要求1?3中任一项所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中， 所述孔的直径为7?10 μ m。
5.如权利要求1?4中任一项所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中， 所述凹坑和所述孔的孔密度为I X 14个/cm2?2 X 10 5个/cm 2。
6.如权利要求1?5中任一项所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其中， 所述金属过滤器的厚度为10?40 μπι。
7.如权利要求1?6中任一项所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置，其具有用于安装所述金属过滤器的过滤器盒。
8.一种末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离方法，其中， 将选自癌症患者的血液、腹水或腹腔清洗液中的体液注入到权利要求1?7中任一项所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离用装置中，利用所述金属过滤器的所述凹坑捕捉该体液中的所述末梢循环肿瘤细胞或所述稀少细胞后，在存活的状态下进行回收。
9.如权利要求8所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离方法，其中， 进一步包括对所述末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞进行特异性染色。
10.如权利要求8或9所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离方法，其中， 包括对所述体液进行稀释或预处理的步骤。
11.如权利要求10所述的末梢循环肿瘤细胞或稀少细胞分离方法，其中， 所述预处理包括以下的步骤:将所述体液与含有磁性纳米粒子的阳离子性核糖体混合，使所述体液中的所述末梢循环肿瘤细胞或所述稀少细胞和白血球细胞中摄入所述磁性纳米粒子后，注入到通入所述金属过滤器的流路中，利用配置在所述金属过滤器前方的磁铁将未摄入磁性纳米粒子的红血球等细胞从该体液中除去。
【文档编号】C12M1/26GK104520420SQ201480001457
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2013年7月24日
【发明者】中西速夫, 伊藤诚二, 绢田精镇, 市野泽义行, 游佐亚希子, 本多裕之, 大河内美奈 申请人:株式会社奥普特尼克斯精密