一种快速分离乳腺癌原代肿瘤活细胞方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞分离技术领域，涉及乳腺癌原代肿瘤活细胞分离方法，尤其涉及高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离方法。分离的乳腺癌原代肿瘤活细胞可用于药敏试验。
【背景技术】
[0002]据报道，目前国内外对绝大多数的恶性肿瘤患者手术后采用化学药物治疗。而研究表明，化疗只对其中约25%的肿瘤患者有效，对于化疗无效的其余75%的患者来说，无疑是忍受了痛苦同时加重了对家庭以及社会的经济和精神双重压力。有研究表明，对那些化疗药物不敏感的乳腺癌细胞给予化疗药物的刺激，将促进肿瘤细胞的EMT和转移，由此可见，耐药的肿瘤细胞更容易发生转移。因此，准确的肿瘤药敏试验对肿瘤尤其是乳腺癌的治疗和预后的判断显得至关重要。
[0003]目前，现有技术的肿瘤药敏试验中所采用的肿瘤单细胞分离技术是用胶原酶消化分离技术。实践显示，该种技术分离得到的单细胞在体外培养的前四周生长的大多数为肿瘤间质中的非肿瘤细胞，即成纤维细胞，很难想像，用非肿瘤细胞为主的成纤维细胞为载体获得的所谓肿瘤细胞药敏试验的结果能在何种程度上准确反映肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。事实上，目前临床对肿瘤药敏试验结果的反馈的确不如人意。鉴于此，国内外业内研究人员均试图努力改进肿瘤药敏试验技术。本申请的发明人认为，只有将高纯度肿瘤细胞作为药敏试验的载体，将有助于获得肿瘤细胞对化疗药物敏感性的正确结果，并用以指导临床正确选择化疗药物进行抗肿瘤治疗。
[0004]以乳腺癌为例，肿瘤化疗药敏检测通常采用体外与体内两类检测方法。国内外常用的体外药敏试验检测法有MTT法、CD-DST法和ATP-TCA法。但其中国内业界常用MTT法已遭逐渐淘汰；日本目前常采用⑶-DST法；而欧美常采用ATP-生物荧光体外抗肿瘤药物敏感性检测技术(ATP-TCA法)。ATP-TCA法是近年来发展起来的较先进的肿瘤药敏检测技术，临床试验证实该技术的应用提高了肿瘤的疗效。美国国立卫生研究院的GOG (GynecologicOncologyGroup)项目组认为ATP-生物突光体外检测肿瘤化疗敏感性方法是最有发展前途的一种药敏试验方法。该技术原理是根据细胞内源性ATP含量与活细胞数呈正相关，测定细胞内源性ATP的含量以反映细胞的活性和活细胞数量，在体外测定经不同浓度化疗药物直接杀伤的培养肿瘤细胞中的ATP含量，从而计算肿瘤细胞的抑制率，进而判断该肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度。
[0005]但是，该ATP-TCA法的前提是所检测的细胞必须是高纯度的乳腺癌肿瘤细胞，该技术中，只有对高纯度的乳腺癌肿瘤细胞给予抗肿瘤药物，才能真正检测出该药物对肿瘤细胞的直接杀伤作用，若这些用于做肿瘤药物敏感性试验的细胞中除了肿瘤细胞外还含有其他对该药物敏感的细胞，如成纤维细胞、血管内皮细胞等，那么在给药时将有大量非肿瘤细胞被杀死，从而出现药敏试验的假阳性或疗效扩大的结果。这对于个性化治疗或预后的预测将会起到误导的作用，甚至于出现过度治疗的危害。
[0006]然而，本领域技术人员知晓，乳腺癌肿瘤组织并不是单一种类的细胞样本，而是多种细胞的混合体。在不同病例中肿瘤细胞的比例也存在很大差异:肿瘤细胞丰富者可以占组织中细胞总数的90%以上；而在某些病例中，肿瘤细胞数所占比例还不到肿瘤组织总细胞数的10%，其余多为间质细胞，炎症细胞，甚至于肿瘤组织中的正常上皮细胞等。倘若直接用手术切除组织做药敏试验，非肿瘤细胞的存在将严重影响药敏试验结果的准确性和可靠性。由于肿瘤细胞系经过体外长期培养后，生物学行为发生了改变，无法正确反应化疗药物在体内的反应，并且不同的乳腺癌患者对化疗药物的反应存在着个体差异性，因此，如果用已经建系的乳腺癌细胞作为药敏试验的载体，会出现与临床用药的结果相去甚远的情形，因此利用细胞系作为化疗药物的载体是不合适的。
[0007]目前国内外现有技术的乳腺癌肿瘤细胞分离技术方法和药敏体系均存在或多或少的缺点，无法快速批量分离高纯度的原代肿瘤细胞。如:传统酶消化法获取的单细胞多为成纤维细胞，尤其在原代分离的前4周内成纤维细胞作为优势细胞会抑制肿瘤细胞的生长，以这些细胞作为抗肿瘤药物的靶细胞则会造成药敏试验结果的假阳性；若采取多次传代后在成纤维细胞中挑取肿瘤细胞克隆的方法，则需要消耗3-4周的时间，无法满足临床快速诊断的要求；且因长时间体外培养后可能改变肿瘤细胞的生物学行为，从而影响化疗药物的响应程度；显微切割技术(Lasercapturemicrodissect1n, LCM)是利用激光能量从组织切片或细胞培养皿中捕获感兴趣的细胞，虽然LCM可以快速准确地从组织中捕获目的细胞，但捕获过程中激光的能量会破坏RNA的完整性，且每次操作时所能捕获的细胞量也十分有限，不利于后续非扩增性实验的开展；此外，LCM技术也无法直接捕获组织中的活细胞。因此，在药敏试验的细胞准备中无法运用LCM等上述方法和技术获取靶细胞。
[0008]本申请的发明人拟提供一种可以快速批量分离高纯度的原代肿瘤活细胞的方法，既可以弥补LCM的不足，又可以用于临床药敏试验。
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【发明内容】
[0024]本发明的目的旨在克服现有技术中存在缺陷，提供一种乳腺癌原代肿瘤活细胞分离方法，尤其是高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离方法。本方法分离的乳腺癌原代肿瘤活细胞可用于药敏试验。
[0025]本发明针对目前生物学和医学研究领域，原代乳腺癌细胞分离纯度低且