一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞 特性的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类处于未分化状态、但持有多向分化潜能和自我更新能力的原始细 胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞两大类。成体干细胞存在于多种已分化的组织和器官内， 能自我更新并增殖、分化成特定组织的功能细胞。离体后的成体干细胞由于缺失了体内特 定微环境信号的调控，会丧失自我更新和多向分化的潜能，迅速走向分化。一直以来，制约 成体干细胞研究的一个重要瓶颈就是缺乏非常有效的对各种组织特异性干细胞进行体外 培养和扩增的方法，其体外扩增和在体外扩增过程中维持其干细胞的特性是非常困难的。 目前唯一涉及临床使用的例子是从烧伤病人的活组织中提取表皮细胞进行培养，但这并不 是真正意义上的干细胞培养，因为经过体外培养的这种表皮细胞只能分化成角质细胞。因 此成体干细胞体外培养和扩增的技术体系的成功建立将会极大推动着成体干细胞的研究 和应用。
[0003] 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，已成为威胁妇女健康的主要病因。研究证 明，激素影响着乳腺的正常发育和乳腺癌的形成，妇女患乳腺癌的风险和其生殖的历史及 激素的分泌都有重要的关联。然而系统性的激素如何通过局部的信号分子控制乳腺干细胞 的自我更新、增殖和影响乳腺癌的发生仍然并不清楚。
[0004] 现有技术中成体干细胞的体外培养非常困难，尤其突出的是在体外培养时干细胞 趋于分化、难以维持其干细胞的特性。以往的研究工作已经证实fct信号通路控制着乳腺 成体干细胞在体内的自我更新。在此基础上，将纯化的fct3A蛋白和3D培养方法结合起 来，成功在体外对乳腺干细胞进行了培养和扩增并保持了其干细胞的特性。但是使用这种 方法，需要纯化的fct3A蛋白，而纯化具有物学活性的Wnt3A蛋白代价昂贵，因此这种培养 方法很难普及到大规模的干细胞体外培养以及后续的药物筛选中。
【发明内容】
[0005] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种体外扩增乳腺干细胞 并维持其干细胞特性的方法及其应用，用于解决现有技术中的问题。
[0006] 本发明第一方面提供一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，所述 方法将乳腺管腔细胞与乳腺干细胞进行3D共培养，并在培养过程中加入雌性激素（E2)和/ 或孕激素（Pg)。
[0007] 较佳的，所述体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法具体如下：
[0008] 1)细胞3D培养：将分离得到的乳腺管腔细胞和乳腺干细胞按照2. 5~3. 5:1的 比例混合，离心得细胞沉淀并加入基质胶，将含有细胞的基质胶铺入培养板，待胶体形成后 加入细胞培养液，并在细胞培养液中加入雌激素和孕激素后进行3D培养；
[0009] 2)培养过程中每天更换新鲜培养液，培养5至7天进行传代；
[0010] 优选的，所述传代的具体方法为：去除细胞培养液后加入Dispase酶处理，再加 入胰酶处理，然后重悬并离心沉淀，在细胞沉淀中加入基质胶并铺入培养板中培养，传代完 成。
[0011] 更优选的，加入Dispase酶处理时，同时进行吹吸使基质胶完全化掉，Dispase酶 处理时间为25-35分钟。
[0012] 更优选的，胰酶处理时间为5~10分钟。
[0013] 更优选的，重悬方法为加入含有5%FBS的PBS重悬。
[0014] 优选的，所述步骤（1)中，乳腺管腔细胞和乳腺干细胞的比例为3:1。
[0015] 所述乳腺管腔细胞和乳腺干细胞的比例为细胞数比例。
[0016] 优选的，所述步骤（1)中，培养板为孔板，培养板每孔中基质胶铺入量与细胞培养 液加入量之比为1 :10-12。
[0017] 具体的，培养板可为24孔培养板，培养板每孔中基质胶铺入量为50 μ L，细胞培养 液加入量为500 μ L。
[0018] 优选的，所述步骤（1)中，雌激素在细胞培养液中的浓度为1-2μΜ，孕激素在细胞 培养液中的浓度为2. 5-5 μ Μ。
[0019] 优选的，所述步骤（1)中，3D培养在常规细胞培养箱中进行，保持潮湿并通入 5%C02，培养温度为37°C。
[0020] 所述基质胶为市售的商业化产品，购自BD公司，其使用方法参考商家建议。
[0021] 所述细胞培养液可为本领域各种常用的细胞培养液。
[0022] 优选的，所述细胞培养液中不能含有FBS胎牛血清。
[0023] 更优体的，所述细胞培养液的组分如下：基本培养液：DMEM/ F12=l: 1，1%PS，1%ITS (商品化产品，从 GIBCO-Invitrogen 购买），50ng/mL EGF (商品化产 品，从BD公司购买）。
[0024] 优选的，所述乳腺管腔细胞和乳腺干细胞分离步骤如下：
[0025] A)乳腺单细胞的制备：将乳腺组织消化、裂解后，再用胰酶处理制备成单细胞，胰 酶中加入脱氧核糖核酸酶1去除DNA ;
[0026] B)流式细胞分选：通过流式细胞技术分离小鼠乳腺管腔细胞和小鼠的乳腺干细 胞。
[0027] 更优选的，将乳腺组织消化的具体方法为：将乳腺组织放入含有胶原酶的消化液 消化，消化液消化时间为2个小时左右。
[0028] 更优选的，所述裂解的具体方法为：使用红细胞裂解液裂解，裂解液裂解时间为5 分钟左右。
[0029] 进一步优选的，消化液具体为 RPMI-1640,0· 025M!fepes，5%FBS，1%PS。
[0030] 更优选的，所述步骤（A)中，胰酶处理的时间为10分钟左右。
[0031] 更优选的，所述步骤（B)中，流式细胞分选分选的具体步骤为：在制备好的单细胞 中加入下列抗体：&11衍161'119411'(：，311衍-〇)31411'(：，311衍-〇)45411'(：，311衍-〇)29-八？〇 和anti-CD24-PE-Cy7进行染色；通过流式细胞技术分离小鼠乳腺管腔细胞和小鼠的乳腺 干细胞。
[0032] 进一步优选的，染色时间为20分钟左右。
[0033] 进一步优选的，所述步骤（B)中，所述通过流式细胞技术分离小鼠乳腺管腔细胞 时，其分子标记为LirT，CD24+，CD29lQ。
[0034] 进一步优选的，所述步骤（B)中，所述小鼠的乳腺干细胞为Actin-DsRed小鼠的乳 腺干细胞，所述通过流式细胞技术分离Actin-DsRed小鼠的乳腺干细胞时，其分子标记为 LirT, CD24+，CD29hi。
[0035] 优选的，所述乳腺管腔细胞与所述乳腺干细胞来自相同的物种。具体的，均来源于 小鼠。
[0036] 更优选的，小鼠的乳腺组织获取方法为：将成年小鼠处死后取出第四对乳腺并剪 碎。
[0037] 本发明所提供的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，可通过体内移 植实验确定干细胞特性的维持状况，具体步骤如下：将经过连续传代后的乳腺干细胞克隆 移植注射入3周龄的雌性裸鼠乳腺脂肪垫中，饲养手术后的小鼠4至8周并检察乳腺干细 胞是否再生成小鼠乳腺，依此确定干细胞特性的维持。
[0038] 进一步的，本发明还提供所述体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法在 干细胞培养领域的应用。
[0039] 本发明第二方面提供了雌性激素和孕激素在体外扩增乳腺干细胞和/或保持乳 腺干细胞特性中的用途。
[0040] 进一步的，所述雌性激素和孕激素通过对与乳腺干细胞共培养的乳腺管腔细胞旁 分泌的调控来扩增乳腺干细胞和/或保持乳腺干细胞特性。
[0041] 本发明第三方面提供一种用于体外扩增乳腺干细胞和/或保持乳腺干细胞特性 的组合物，包括：
[0042] 组分一：乳腺管腔细胞；
[0043] 组分二：雌激素和/或孕激素。
[0044] 进一步的，所述组合物还包括基质胶、细胞培养液、EGF生长因子和ITS生长因子。
[0045] 所述EGF生长因子和ITS生长因子使用时添加与细胞培养液中，以细胞培养液为 基准计，其浓度分别为：ITS，1% ;EGF终浓度为50ng/mL。
[0046] 所述细胞培养液为各种常规细胞培养液，如DMEM/F121 :1。
[0047] 优选的，所述细胞培养液中不能含有FBS胎牛血清。
[0048] 所述乳腺管腔细胞可以是与待培养的乳腺干细胞来源于同一本体，或者可以为乳 腺管腔细胞系。
[0049] 当所述乳腺管腔细胞与待培养的乳腺干细胞来源于同一本体时，可采用常规方法 如流式细胞分选技术从本体中分离乳腺管腔细胞。
[0050] 较佳的，雌激素在培养基中的浓度为1 μ M，孕激素在培养基中的浓度为2. 5 μ M。
[0051] 所述组分一与组分二分别独立包装，在使用前混合。
[0052] 本发明第四方面，提供了一种用于乳腺重建的制剂，为以采用本发明体外扩增乳 腺干细胞并维持其干细胞特性的方法培养获得的乳腺干细胞为主要活性成分的制剂。
[0053] 进一步的，所述制剂以来源于乳腺重建对象本体的乳腺干细胞采用本发明体外扩 增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法培养获得的乳腺干细胞为主要活性成分。
[005