BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0108] 本发明发明人发现激素能够促进乳腺细胞内源的fct4和Rspo I基因的表达；同时 进一步验证了 fct4蛋白能够促进乳腺干细胞的体外培养和扩增并保持其干细胞的特性， 而Rspol蛋白能够对Wnt4蛋白的功效进一步放大。因此，发明人利用激素替代Wnt3A蛋白 对乳腺干细胞进行体外的培养和扩增。结果发现，在此培养体系中，乳腺干细胞能够在体外 连续传代多次而不分化，保持着干细胞的特性，其数量在每次传代中递增。体内移植实验也 表明这些乳腺干细胞即使经过体外的长期传代培养，依然持有发育潜能，能够发育成功能 完整、形态正常的乳腺器官。在怀孕期间，这些再生的乳腺能够分化并分泌乳汁。
[0109] 各实施例中乳腺管腔细胞和乳腺干细胞的流式细胞分选方法如下：
[0110] 1.将成年小鼠处死后取出其乳腺组织，通过胶原酶将剪碎后的乳腺进行消化；
[0111] 2.消化后的乳腺加入红细胞裂解液去除红细胞后利用胰酶将其消化成单细胞；
[0112] 3.在制备好的单细胞中加入以下抗体：anti-Terll9-FITC，anti-CD31-FITC，an ti-CD45-FITC，anti-CD29-APC和anti-CD24-PE-Cy7进行染色，染色后的单细胞通过流式 细胞分离技术获得野生型小鼠的乳腺管腔细胞（Lin_，CD24+，0)291°)和Actin-DsRed标记 小鼠的乳腺干细胞（Lin_，CD24+，CD29hi)。Actin-DsRed小鼠为已构建好的小鼠，可从The Jackson Laboratory购买。实施例6中野生型小鼠的乳腺干细胞分离方法同Actin-Dsred 小鼠,标记同样为LirT，⑶24+，⑶29hi。
[0113] 各实施例中管腔细胞与干细胞的混合培养方法如下：
[0114] 1.将分选得到的管腔细胞和干细胞按照3 :1的比例混合并铺入基质胶中进行培 养，所用培养液为之前所述基本培养液中加入外源的雌激素和孕激素，并以未加入激素组 作为对照；
[0115] 2.对混合培养的细胞每隔5至7天进行传代。
[0116] 各实施例中干细胞的体内重建能力考查方法如下：
[0117] 将传代后的乳腺干细胞移植入3周龄的裸鼠乳腺脂肪垫中，培养裸鼠4至8周后 检查乳腺的生长情况，以此确定乳腺干细胞的再生能力。
[0118] 实施例1
[0119] 激素上调小鼠乳腺中Wnt4和Rspol蛋白的表达试验：
[0120] 具体步骤：将成年小鼠的卵巢摘除，并在脖颈处植入雌激素或孕激素的缓释药剂 片（雌激素和孕激素缓释剂片：商品化产品，从WWW.equl.com，Innovative research of America购买)。继续饲养小鼠3周，将小鼠处死并取出乳腺。分离得到小鼠乳腺单细胞后， 将细胞用蛋白裂解液裂解，并按常规western blot方法检测裂解液中Wnt4和Rspol蛋白 的表达。Control组为未摘除卵巢未植入激素组；Placebo组为摘除卵巢未植入激素组；E2 组为摘除卵巢只植入1粒雌激素组；Pg组为摘除卵巢只植入1粒孕激素组；E2+Pg组为摘除 卵巢植入雌激素和孕激素各1粒组。
[0121] 激素可以上调小鼠乳腺中Wnt4和Rspol蛋白的表达结果如图1所示，和Control 组和Placebo组相比，E2和Pg处理组均可以使Wnt4和Rspol蛋白表达增加；E2使Rspol 蛋白表达增加比Pg明显，Pg使Wnt4蛋白表达增加比E2明显；E2+Pg组Wnt4和Rspo 1蛋白 表达增加均非常明显。图I (a):雌激素和孕激素都能够诱导体内Wnt4和Rspol基因的表 达；图I (b):量化结果显示相比安慰剂，雌激素和孕激素均能够显著上调Wnt4和Rspol蛋 白的表达，且同时加入两种激素时蛋白表达最商。
[0122] 可见，在摘除小鼠卵巢后，小鼠失去了内源的激素刺激。通过外源植入不同激素 可以确切了解不同激素在乳腺发育时的作用。本结果显示，雌激素能够明显地提高乳腺中 Rspol蛋白的表达，而孕激素能够明显地提高乳腺中Wnt4蛋白的表达，因此同时植入两种 激素时fct4和Rspol蛋白均得到明显的提高。
[0123] 实施例2
[0124] 雌性激素和孕激素体外促进小鼠乳腺管腔细胞中Wnt4和RSPOl基因的表达试 验：
[0125] 具体步骤：如前所述，将雌性成年小鼠处死，并将制备的抗体染色后的乳腺单细胞 进行流式细胞分选，将分选得到的小鼠乳腺管腔细胞放入基质胶中进行3D细胞培养；培养 过程中分别在培养液中加入1 μ M雌性激素和/或2. 5 μ M孕激素；培养过程中每天更新培 养液；培养7天后吸掉培养液加入Dispase处理30分钟左右使基质胶溶化，离心并收集细 胞克隆；将收集到的细胞克隆分别通过常规方法进行裂解并提取RNA或者蛋白质；分别通 过RT-qPCR和western blot实验方法检测细胞克隆中Wnt4和Rspol基因在mRNA和蛋白 水平上的表达。实验组中Vehicle为未加激素的对照组，培养液中加入相同体积的DMSO作 为对照；E2组为只加入雌激素；Pg组为只加入孕激素；E2+Pg为加入雌激素和孕激素。
[0126] 实验结果如图2所示，和对照组相比，雌激素处理组Rspol基因的mRNA水平和蛋 白水平均有提高；雌激素处理组Wnt4基因的mRNA水平没有显著提高，Wnt4基因的蛋白水 平比对照组要高；和对照组相比，孕激素处理组fct4基因和Rspol基因在mRNA和蛋白水平 上均有提1?。
[0127] 由以上结果可知：在体外培养体系中，雌激素能够上调小鼠乳腺管腔细胞中 Rspol基因的mRNA水平和蛋白表达水平；雌激素虽不能上调Wnt4基因的mRNA水平，但可 以上调Wnt4蛋白的表达水平；孕激素则可以同时上调Rspol基因和Wnt4基因的mRNA和蛋 白表达水平。
[0128] 实施例3
[0129] Wnt4蛋白对经典Wnt信号通路的激活以及Rspol蛋白对该通路信号的放大作用试 验：
[0130] 具体步骤：
[0131] 1.通过克隆构建将小鼠的Wnt4基因和全长Rspol基因或者Rspol基因的活性片 段蛋白构建入慢病毒表达载体pWPI (商品化载体：可从addgene购买）。
[0132] Wnt4基因引物：
[0133] F:5, -TTGGCGCGCCACCATGAGCCCCCGTTCGTGC-3，（Seq ID. No. 1)
[0134] R:5, -AACCGCGCGGTCACCGGCACGTGTGCAT-3，（Seq ID. No. 2)
[0135] Rspol基因引物：
[0136] F: 5，-TTGGCGCGCCACCATGCGGCTTGGGCTGTGCGT-3，（Seq ID. No. 3)
[0137] R:5, -AACCGCGCGGTCACTGTGCCCAGGTAGGTC-3，（Seq ID. No. 4)
[0138] Rspol活性片段引物：
[0139] F:5，-TTGGCGCGCCaccatggagcactgtgaggcctgctt-3'（Seq ID. No. 5)
[0140] R:5，-aaccgcgcggtcagcactccatggtgctgttag-3，（Seq ID. No. 6)
[0141] 所用内切酶为ASCI。
[0142] 2.将构建好的Wnt4和Rspol基因转入293T细胞，转染后20小时将培养液置换为 蛋白收集培养液（DMEM/F121 :1，1%PS，l%Glutamax，0.0 lM H印es)，继续培养24至72小时后 收集含有这两种蛋白的条件上清培养液。
[0143] 3.在24孔板或者96孔板中铺入L细胞(细胞中含有稳定转入的7TCF-luciferase 报告基因)，培养48至72小时，培养时培养液中分别加入纯化的Wnt3a蛋白，收集的含Wnt4 蛋白，Rspol全长蛋白（RspolFL)，Rspol活性片段蛋白（RspolFu)的条件培养液。
[0144] 实验结果如图3所示，和对照组（control)相比，加入纯化Wnt3a蛋白组的荧光素 酶活性有约20倍的提高；加入Wnt4条件培养液组的荧光素酶活性有约10倍的提高；加入 Wnt4和Rsp0IFL条件培养液组的荧光素酶活性有约15倍的提高；加入Wnt4和RspolFu条 件培养液组的荧光素酶活性有约25倍的提高；加入Wnt3a蛋白和Wnt信号通路抑制剂DKKl 组的荧光素酶活性和对照组没有明显区别；加入fct4条件培养液和Wnt信号通路抑制剂 DKKl组的荧光素酶活性和对照组没有明显区别。
[0145] 以上结果说明，和纯化的Wnt3a蛋白一样，含有Wnt4蛋白的条件培养液可以激活 经典的fct信号通路；Rspol蛋白可以放大Wnt4蛋白对Wnt信号通路的激活作用；DKKl可 以抑制Wnt3a和Wnt4蛋白对经典Wnt信号通路的激活作用。
[0146] 实施例4
[0147] Wnt4蛋白旁分泌促进乳腺干细胞的自我更新和扩增并保持其干细胞特性试验：
[014