阿可拉定在制备用于抑制肝癌干细胞药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及阿可拉定在制备用于抑制肝癌干细胞药物中的用途，属于医药领域。【背景技术】
[0002] 干细胞是一种能够无限制自我更新，并具有分化成不同成熟组织类型的多能性细 胞。
[0003] 肿瘤干细胞是肿瘤组织中存在的一种或几种具有干细胞特性的细胞亚群。肿瘤干 细胞具有自我复制和定向分化的能力，是肿瘤生长、复发和转移的根源，并导致了器官正常 功能的紊乱，最终导致机体死亡。在例如脑、肺、肝脏、结肠、前列腺等器官的肿瘤中陆续发 现了类似的肿瘤干细胞，因此，肿瘤干细胞被认为是癌症治疗的有效靶点。然而，由于肿瘤 干细胞具有耐药性、耐放疗和耐化疗性的特点，因此，恶性肿瘤难以治愈，一直以来困扰着 人类社会。
[0004] 肝癌是世界五大常见的癌症之一，肝癌的根治性治疗方法包括手术及肝移植。然 而，80%以上的肝癌患者参加治疗时，病情已到晚期，无法应用上述治疗方法。即使能够实 施手术切除，术后的复发率也比较高，而且肝癌术后的长期预后不能令人满意。经肝动脉栓 塞化疗或全身化疗是肝癌患者通常使用的治疗手段，但由于化疗药物的毒性及肿瘤抗化疗 药性强，所以长期看来肝癌的整体治疗效果并不理想。
[0005]EpCAM又称为⑶326,是一种I型跨膜糖蛋白。在肝癌干细胞和肝癌母细胞中均有 表达，但是在正常成熟的细胞中无表达，因此，EpCAM可用来作为肝癌干细胞的标志物。
[0006] CD133又名Prominin-1、AC133,在造血干细胞和神经干细胞中均有表达，是人类 造血干/祖细胞的一种跨膜糖蛋白，由于CD133肝癌细胞具有较强的致瘤性和增殖性，与肝 祖细胞的特征相似，并且肝癌病人CD133的高表达显示出预后差并且易复发的特点，CD133 也被认为是肝癌的标志物。
[0007]CD24是一种低分子质量高度糖基化的蛋白质，是B细胞分化的标记物，在淋巴细 胞成熟、神经系统发育以及在生理状态下的器官组织新陈代谢中发挥关键作用。研究发现 肝癌患者肿瘤内如果⑶24高表达，手术后一年内复发率较肿瘤内只有低表达肝癌患者高3 倍，同时出现肿瘤转移的机会也较高。因此，CD24也被认为肝癌干细胞的标志物。
[0008] 阿可拉定，又名淫羊藿素，是从中药淫羊藿中提取分离得到的主要活性成分淫羊 藿苷经酶转化得到的新的有效单体，其结构式如下式（I)所示：
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[0010] 该化合物的制备方法公开于CN101302548,该方法以淫羊藿苷为原料，以0 -葡萄 糖苷酶进行水解，水解产物离心得到的沉淀用丙酮溶解，离心过滤得到上清液。再将离心得 到的上清液用水进行重结晶，得到阿可拉定纯品。
[0011] 在申请号为200780039276. 9的中国专利中公开了一种用于治疗与雌激素受体相 关疾病的化合物和方法，该专利中公开了阿可拉定用于治疗与雌激素受体ER-a36相关的 肝癌。
[0012] 在现有技术中，并没有针对阿可拉定对ER-a36以外的其他靶点的进一步研究， 也没有阿可拉定对肿瘤干细胞，特别是肝癌干细胞的研究。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供阿可拉定在制备用于抑制肝癌干细胞药物中的用途。
[0014] 本发明一方面提供了阿可拉定在制备用于抑制肝癌干细胞药物中的用途。
[0015] 优选地，其中所述的肝癌干细胞包括肝癌起始细胞。
[0016] 优选地，其中阿可拉定通过抑制肝癌干细胞标志物EpCAM的表达抑制肝癌干细 胞。
[0017] 优选地，其中阿可拉定通过抑制肝癌干细胞标志物⑶133的表达抑制肝癌干细 胞。
[0018] 优选地，其中阿可拉定通过抑制肝癌干细胞标志物⑶24的表达抑制肝癌干细胞。
[0019] 优选地，其中阿可拉定用于抑制与STAT3相关的肝癌干细胞。
[0020] 本发明的有益效果在于：本发明通过对阿可拉定的进一步研究，确定了阿可拉定 对肝癌治疗的新的靶点，即肝癌的干细胞，优选地，肝癌起始细胞。因此，阿可拉定有望通过 对肝癌干细胞抑制，从根本上治愈肝癌。
【附图说明】
[0021] 图1表示阿可拉定对肝癌细胞Ifep-12细胞活力的抑制。
[0022] 图2表示阿可拉定对正常肝细胞L02细胞活力的抑制。
[0023] 图3表示顺钼对肝癌细胞Ifep-12细胞活力的抑制。
[0024] 图4表示顺钼对正常肝细胞L02细胞活力的抑制。
[0025] 图5表示阿可拉定、顺钼对PCL/PRF/5肝癌干细胞成球数目的抑制。
[0026] 图6表示阿可拉定、顺钼对PCL/PRF/5肝癌干细胞成球尺寸的抑制。
[0027] 图7表示阿可拉定、顺钼对Huh7肝癌干细胞成球数目的抑制。
[0028] 图8表示阿可拉定、顺钼对Huh7肝癌干细胞成球尺寸的抑制。
[0029] 图9表示阿可拉定、顺钼对PLC/PRF/5肝癌二代干细胞球数目的抑制作用。
[0030] 图10表示阿可拉定、顺钼对Huh7肝癌二代干细胞球数目的抑制作用。
[0031] 图11表示阿可拉定和顺钼分别对PLC/PRF/5细胞中EpCAM表达为阳性的细胞比 例的抑制。
[0032] 图12表示阿可拉定和顺钼分别对Huh7细胞中EpCAM表达为阳性的细胞比例的抑 制。
[0033] 图13表示阿可拉定和顺钼分别在体外处理PLC/PRF/5肝癌细胞后，植入体内的肿 瘤体积增长情况。
[0034] 图14表示阿可拉定和顺钼分别在体外处理Huh7肝癌细胞后，植入体内的肿瘤体 积增长情况。
[0035] 图15表示阿可拉定对PLC/PRF/5肝癌细胞标志物EpCAM、CD133以及CD24在mRNA 水平的抑制。
[0036] 图16表示阿可拉定对Huh7肝癌细胞标志物EpCAM、⑶133以及⑶24在mRNA水平 的抑制。
[0037] 图17表示STAT3抑制剂对PLC/PRF/5和Huh7肝癌干细胞球数目的抑制。
[0038] 图18表示通过对STAT3进行RNA干扰（siSTAT3)处理，阿可拉定能加速抑制肝癌 干细胞的成球能力。
【具体实施方式】
[0039] 以下实施例仅用于对本发明进行示例性说明，不用于限制本发明，在本发明保护 范围内所做的修改、改变、变型等都在本发明的保护范围内。
[0040] 本发明中的"起始细胞tumor-initiatingcells(T-ICs) "是肿瘤干细胞的一种， 具有正常干细胞的特征，具有自我更新和分化的潜能。肿瘤起始细胞比肿瘤内其他较成熟 的癌细胞对传统化疗更具抗药性，是肿瘤化疗后复发的主要原因之一。
[0041] 本发明中的人肝癌细胞Hep-12由来源于复发肝癌组织经原代培养后建系而 成（有关该细胞的建立方法见：Thepropertiesoftumor-initiatingcellsfroma hepatocellularcarcinomapatient^primaryandrecurrenttumor,carcinogenesis. XuXL,XingBC，HanHB，ZhaoWetal，2010 ;31 (2): 167-74)。
[0042] 本发明中的"肝癌"指的是原发性肝癌，即起源于肝脏的上皮或间叶组织的肝脏恶 性肿瘤。
[0043] 本发明中的"STAT3"是信号传导与转录激活因子蛋白家族中的一种蛋白，在细胞 因子-受体相互作用的过程中充当载体，保持信号在细胞内传递的内在特异性，STAT3被发 现其与肿瘤存在密切的关系。
[0044] 本发明中的"siRNA"指的是沉默RNA技术，本发明中siSTAT3是STAT3蛋白的RNA 沉默，用于评估肝癌细胞中STAT3蛋白的作用。
[0045] 本发明中的CCK8试剂盒购自东仁化学科技（上海）有限公司（Dojindo Laboratories),商品名称细胞计数器（CellCountingKit)CCK_8,商品编号为CK04。
[0046] 本发明中的培养因子B27购自上海英骏生命技术公司的（Invitrogen)，商品名称 B27,商品编号 12587010。
[0047]本发明中的"DMEM/F12培养基"购自上海英骏生命技术公司（Invitrogen)，商品 名称DMEM/F12培养基，商品编号11039-021。
[0048] 本发明中的"人肝癌细胞PLC/PRF/5"购自于日本癌症研究银行JapaneseCancer ResearchBank(JCRB)，Tokyo,Japan，商品名称PLC/PRF/5,商品编号为JCRB0406。
[0049] 本发明中的"肝癌细胞株Huh7"购自于日本癌症研究银行JapaneseCancer ResearchBank(JCRB),Tokyo,Japan，商品名称Huh_7,商品编号为JCRB0403。
[0050]本发明中的"肝细胞株L02"购自于中国科学院典型培养物保藏委员会。
[0051] PLC/PRF/5和肝癌细胞株Huh-7的区别均为人肝细胞肝癌，来源于不同的人。
[0052] 本发明中的STAT3抑制剂购自