通过流式细胞术检测阿可拉定对Huh7和PLC/PRF/5肝癌细胞中EpCAM 阳性细胞的比例的影响来监测阿可拉定对肿瘤起始细胞在体外的抑制。实验方法：细胞培 养：首先将Huh7细胞在DMEM培养基中培养至细胞密度为80% ;再将培养后的细胞分至含 有活性炭处理的体积浓度为2. 5%的胎牛血清的无酚红培养基中，培养24小时。
[0100] 加入二甲基亚砜（DMS0)和阿可拉定：在培养体系中分别加入DMS0对照（即不含 有阿可拉定的DMS0溶液）和含有3iiM、4iiM、5iiM、7. 5iiM和10iiM浓度阿可拉定的DMS0 溶液，并使每个反应体系中DMSO体积浓度的终值为0. 1 %。
[0101] 检测方法：在药物处理48小时后，用FACS流式细胞术检测EpCAM阳性细胞的比 例。所用流式细胞仪购自BD生物科学公司（BDBiosciences)，商品名：BDFACSCalibur。
[0102] 检测中用到的EpCAM抗体购自上海浩然生物科技有限公司，原产地eBioscience， 向品编号12-9326。
[0103] 结果：由图11可见，3iiM浓度的阿可拉定降低了PLC/PRF/5细胞中EpCAM表达为 阳性细胞的比例，同时10UM浓度的阿可拉定，EpCAM阳性细胞的比例降低了 40%，随着阿 可拉定浓度的增加，PLC/PRF/5细胞中EpCAM阳性细胞的比例逐渐降低。此外，10iig/ml浓 度的顺钼对于EpCAM阳性的细胞并没有这种影响，反而略微升高了EpCAM阳性细胞的比例。
[0104] 由图12可见，3yM浓度的阿可拉定降低了Huh7细胞中EpCAM阳性细胞的比例，同 时10iiM浓度的阿可拉定相对于DMS0对照组，EpCAM阳性细胞的比例降低了 20%以上，随 着阿可拉定浓度的增加，Huh7细胞中EpCAM表达为阳性的细胞比例逐渐降低。此外，10yg/ ml浓度的顺钼对于EpCAM阳性的细胞并没有这种影响，反而略微升高了EpCAM阳性细胞的 比例。
[0105] 实施例6
[0106] 在阿可拉定体外处理肝癌细胞后，检测体内肿瘤植入能力。
[0107] 实验步骤：细胞培养：首先PLC/PRF/5和Huh7细胞在DMEM培养基中培养至细胞 密度为80% ;再将培养后的细胞分至含有活性炭处理的体积浓度为2. 5%的胎牛血清的无 酚红培养基中，培养24小时。加入二甲基亚砜（DMS0)和阿可拉定：在培养体系中分别加 入DMS0对照（即不含有阿可拉定的DMS0溶液）和5iiM浓度阿可拉定的DMS0溶液以及 10Ug/ml浓度顺钼的DMS0溶液，并使每个反应体系中DMS0体积浓度的终值为0. 1 %。处 理48小时后，阿可拉定、DMS0以及顺钼处理过的PLC/PRF/5和Huh7存活下来的细胞分别 接种到4至6周N0D/SCID雌性小鼠皮下，每个小鼠接种的细胞数为5*105个，制作移植瘤 模型。
[0108] 检测方法：记录各组中小鼠的成瘤时间和成瘤体积绘制肿瘤生长曲线。
[0109] 检测阿可拉定在体外处理肝癌细胞后，肿瘤起始细胞在体内的植入能力。
[0110] 结论：见图13,通过观察，相对于DMS0组，阿可拉定体外处理PLC/PRF/5肿瘤细胞 后，植入体内的肿瘤不成瘤。顺钼体外处理的肿瘤细胞植入体内后，肿瘤体积增长略微大于 DMS0 组。
[0111] 参见图14,相对于DMS0组，阿可拉定体外处理Huh7肿瘤细胞后，植入体内的肿瘤 基本不成瘤。顺钼体外处理的肿瘤细胞植入体内后，肿瘤体积增长速度和成瘤情况与DMS0 对照组无明显差别。
[0112] 实施例7
[0113] 除了EpCAM，⑶133和⑶24也被确认作为肿瘤干细胞的标志物。通过以下方法，确 定阿可拉定对干细胞PLC/PRF/5、Huh7细胞的mRNA的抑制。
[0114]实验方法：细胞培养：首先将PLC/PRF/5和Huh7细胞分别在DMEM培养基中培养至 细胞密度为80% ;再将培养后的细胞分至含有活性炭处理的体积浓度为2. 5%的胎牛血清 的无酚红培养基中，培养24小时。加入二甲基亚砜（DMS0)和阿可拉定：在培养体系中分别 加入DMS0对照（即不含有阿可拉定的DMS0溶液）和5iiM浓度阿可拉定的DMS0溶液，并 使每个反应体系中DMS0体积浓度的终值为0. 1 %。
[0115] 检测方法：在药物处理24小时后，提取总RNA，反转录为cDNA，用RT-qPCR方法检 测EpCAM、CD133、CD24的mRNA相对表达量。
[0116] 检测中，EpCAM的引物：
[0117] 5，-3，端GGGGAACAACTGGATCTGGA，3，-5，端CCAGCAACAACTGCTATCACC
[0118] CD133 的引物：
[0119] 5，-3，端AACGGCACCATTGGTCTCTG，3，-5，端AACGGCACCATTGGTCTCTG
[0120] CD24 的引物：
[0121] 5，-3，端TGAAGAACATGTGAGAGGTTTGAC; 3，-5，端GAAAACTGAATCTCCATTCCACAA。
[0122] 结论：见图15,通过RT-qPCR分析方法，阿可拉定显著降低了PLC/PRF/5肝癌细胞 中的干细胞标志物EpCAM、⑶133以及⑶24的mRNA表达水平。
[0123] 见图16,通过RT-qPCR分析方法，阿可拉定显著降低了Huh7肝癌细胞中的干细胞 标志物EpCAM、CD133以及CD24的mRNA表达水平。
[0124] 实施例8
[0125] 通过阿可拉定对肝癌干细胞信号转导和转录激活因子STAT3活性的抑制，评估阿 可拉定对肝癌启始细胞的抑制作用是否通过STAT3介导。
[0126] 1.评估STAT3和肝癌干细胞的关系
[0127] 实验方法：细胞培养：首先PCL/PRF/5和Huh7细胞在DMEM培养基中培养至细胞 密度为80% ;再将培养后的细胞分至体积浓度为2%的培养因子B27的DMEM/F12培养基 中。加入二甲基亚砜（DMS0)和STAT3抑制剂：在培养体系中分别加入DMS0对照（即不含 有阿可拉定的DMS0溶液）和200iiM的STAT3抑制剂S3I-201的DMS0溶液，并使每个反应 体系中DMS0体积浓度的终值为0. 1 %。
[0128] 检测方法：在药物处理5天后，用显微镜观察，同时记录干细胞球的数目。
[0129] 结论：通过图17可见，在受到STAT3抑制剂作用之后，无论PLC/PRF/5细胞还是 Huh7细胞均在干细胞球的形成上受到了抑制。
[0130] 因此可见，STAT3活化可以作为肝癌干细胞的形成的标志。
[0131] 2.通过STAT3基因沉默评估阿可拉定对肝癌起始细胞的抑制作用
[0132] 实验方法：细胞培养：首先PCL/PRF/5细胞在DMEM培养基中培养至细胞密度为 80% ;再将培养后的细胞分至含有活性炭处理的体积浓度为1%的胎牛血清的无酚红培养 基中，培养24小时。
[0133] siRNA转染：将STAT3的siRNA转染进入PCL/PRF/5细胞，转染48小时后将培养 的细胞分至含有体积浓度为2%细胞因子B27的DMEM/F12培养基中，未转染siRNA的PCL/ PRF/5细胞分别作为阴性对照（NC)。
[0134] 加入二甲基亚砜（DMS0)和阿可拉定：在培养体系中分别加入DMS0和10iiM的阿 可拉定的DMS0溶液，并使每个反应体系中DMS0体积浓度的终值为0. 1 %。
[0135] 检测方法：在细胞成球培养4天后，用显微镜观察，同时记录干细胞球的数目。
[0136] 结论：参见图18,STAT3基因沉默加剧了阿可拉定对于PCL/PRF/5细胞的干细胞起 始能力的抑制，可见，STAT3在阿可拉定抑制PCL/PRF/5细胞的干细胞起始能力中发挥关键 作用。
【主权项】
1. 阿可拉定在制备用于抑制肝癌干细胞药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述的肝癌干细胞包括肝癌起始细胞。3. 根据权利要求1或2所述的用途，其中阿可拉定通过抑制肝癌干细胞标志物EpCAM 的表达抑制肝癌干细胞。4. 根据权利要求1或2所述的用途，其中阿可拉定通过抑制肝癌干细胞标志物CD133 的表达抑制肝癌干细胞。5. 根据权利要求1或2所述的用途，其中阿可拉定通过抑制肝癌干细胞标志物CD24的 表达抑制肝癌干细胞。6. 根据权利要求1所述的用途，其中阿可拉定用于抑制与STAT3相关的肝癌干细胞。
【专利摘要】本发明涉及阿可拉定在制备用于抑制肝癌干细胞药物中的用途。阿可拉定通过抑制肝癌干细胞标志物的表达抑制肝癌干细胞。因此，本发明为肝癌的靶向治疗提供了进一步研究的方向，有望通过对肝癌干细胞的抑制，从而从根本上治愈肝癌。
【IPC分类】A61K31/352, A61P35/00
【公开号】CN105106196
【申请号】CN201410472236
【发明人】孟坤, 郭玉明, 王媛媛, 朱海, 和尹立
【申请人】北京盛诺基医药科技有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年9月16日