绿原酸在激活机体的免疫相关信号通路中的用途及其研究方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及绿原酸在激活机体的免疫相关信号通路中的 用途及其研究方法。 技术背景
[0002] 绿原酸（chlorogenicacidCGA)又名咖啡縣酸，是由咖啡酸（caffeicacid CA)和奎尼酸（quinicacidQA)组成的缩酸酸，其化学名为3-〇-咖啡酰奎尼酸 (3-o-caffeoylquinicacidCGA)。绿原酸是植物在进行有氧呼吸的过程中，经磷酸戊糖途 径中间产物合成的一种苯丙素类物质。绿原酸已经被开放应用于食品，保健品，化妆品和药 品等多个领域。由于它广泛的存在于常见的各种蔬菜水果中，具有多种生物活性，如：心 血管保护作用、抗氧化作用、抗紫外及抗辐射作用、抗诱变及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作 用、降脂降糖作用、免疫调节作用等。在医药化工和食品等领域都具有广泛的应用。目前已 有大量证据显示绿原酸具备抗癌功能，然而，目前为止绿原酸抗癌功能的分子学作用机制 尚不明确，从而限制了人们从分子和基因层面对其抗癌机理相关的信号通路、精确的作用 靶点、具体生物因子的准确把握和应用。
【发明内容】
[0003] 针对上述问题，本发明提供了绿原酸的一种从基因和分子水平调控机体免疫反应 的新用途，即绿原酸在激活机体的免疫相关信号通路中的用途，建立了免疫相关信号通路 与绿原酸抗癌功能之间的分子学联系，提供了一种通过绿原酸精确调控机体免疫相关信号 通路的方法。通过该应用可进一步用于指导肿瘤的治疗，也可以用于建立相关的研究模型 用于对免疫相关信号通路的具体作用原理或其他相关的应用。
[0004] 进一步的，所述机体为患癌机体，更进一步的为荷瘤小鼠。
[0005] 进一步的，在上述应用中通过上调免疫相关基因来激活免疫相关信号通路。进一 步的，通过促进免疫因子（如IL-2RandIFN-y)的分泌以及激活T细胞、NK细胞和巨噬 细胞来实现抗癌效果。
[0006] 进一步的，所述免疫相关基因为CaN、NFATC2、NFATC2ip和NFATC3。
[0007] 作为可选方式，在上述用途中，将绿原酸制作成含有效剂量的药物制剂后施用于 机体。
[0008] 作为可选方式，在上述用途中，所述绿原酸的使用剂量为：l_100mg/kg。优选为 20 ~40mg/kg。
[0009] 作为可选方式，所述的药物制剂是以绿原酸为有效成分，加入一种或多种药学上 可接受的药用赋形剂制备而成的制剂。
[0010] 作为可选方式，所述的药物中每制剂单位含有绿原酸1~3000mg。
[0011] 作为可选方式，所述的药物是口服制剂、注射制剂或外用透皮给药制剂。
[0012] 作为可选方式，所述的药物是绿原酸浓度为1~40mg/mL的生理盐水注射液。也 可选择其他药学上可接受的注射液。
[0013] 本发明还提供了一种绿原酸激活机体免疫相关信号通路的分子机制的研究方法， 包括以下步骤：
[0014] (1)建立动物模型；
[0015] (2)采用绿原酸对模型动物进行干预作为实验组，同时建立对照组；
[0016] (3)采用基因芯片技术获得实验组和对照组中的差异表达基因；
[0017] (4)采用时间序列分析、基因功能分类分析（G0)和信号通路分析筛选出相关的基 因；
[0018] (5)采用ELISA技术或分子印记检测（westernblottest)技术或PCR技术对步 骤⑷
[0019] 筛选出的基因进行验证。
[0020] 采用目前的基因芯片对模型动物的基因表达进行分析时，由于方法本身的系统误 差和随机误差（如RNA的提取、反转录、杂化过程中产生的误差以及基因芯片和RNA质量 的影响等）会在一定程度上影响分析结果的准确性，该方法虽然可以快速基因表达的差异 但由误差导致的假阳性结果的可能性也很大，本发明通过将基因芯片技术分析获得的差异 表达基因与pathway(信号传导通路）和GO(geneontology)两个指标来进行分析和相互 验证，将差异基因控制在研究目标相关功能基因的范围内有助于高效准确地筛选出目标基 因，同时采用ELISA技术或分子印记检测（westernblottest)技术或PCR技术对步骤（4) 中筛选出的基因进行验证，可有效避免假阳性，提升结果的可信度。
[0021] 作为可选方式，所述步骤（1)中的动物模型为小鼠EMT-6乳腺癌动物模型，本领域 技术人员也可根据研究需要和实际情况灵活选择其他动物模型。
[0022] 作为可选方式，所述步骤（2)中的对照组可以包括阳性对照、阴性对照、空白对 照，本领域技术人员可根据研究需要和实验对照的公知设计原理进行灵活的选择。例如，所 述对照组可以包括多烯紫杉醇干预组、干扰素干预组和生理盐水空白对照组。
[0023] 作为可选方式，所述步骤（2)中的实验组中包括多个不同剂量的实验组。进一步 的，包括绿原酸剂量分别为5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg的三个实验组。作为可选，各实验 组和对照组分别设置至少3组平行试验，优选为5组平行试验。
[0024] 本发明还提供了一种采用上述方式筛选出的免疫相关基因在激活机体的免疫相 关信号通路中应用，其特征在于，通过促进机体本身的免疫相关基因的表达或向机体中引 入外源性的免疫相关基因。通过促使免疫相关基因高表达，提高机体中免疫因子（如IL-2R andIFN-y)的分泌以及激活T细胞、NK细胞和巨噬细胞来实现抗癌效果。
[0025] 作为可选方式，所述免疫相关基因为CaN、NFATC2、NFATC2ip和NFATC3这4种基 因中的至少一种。研究证实：NFATC2基因在T细胞受体刺激作用下由细胞质进入细胞核 可成为激活T细胞的主要核因子，NFATC2基因可以防止免疫调节机制中的Thl/Th2平衡 向Th2方向倾斜，从而恢复机体的抗肿瘤免疫活性，防止机体的抗肿瘤免疫功能的弱化， 避免癌细胞从机体的免疫监控中漏网，控制癌细胞的再生和转移。NFATC3可与NFATC2协 同管控T细胞受体反应、细胞分裂、Th2异化反应等过程，可帮助恢复Thl/Th2平衡，促进 IL-2,IFN-y，TNF-a和IL-10等免疫因子的分泌。NFATC2ip基因在转录后会发生甲基化， 该甲基化过程有助于保持Thl型和Th2型细胞因子的表达。CaN基因的表达有助于通过其 去磷酸化作用促进NFAT族基因由胞浆进入细胞核进行表达，同时促进IL-2等细胞因子的 表达。
[0026] 作为可选方式，通过向机体施用有效剂量的绿原酸来促进机体本身的免疫相关基 因的表达。采用绿原酸依靠机体自身的响应机制可同时实现上述4种基因的高表达，对免 疫相关信号通路进行多方位的协同调节，有利于提高综合抗癌作用。
[0027] 作为可选方式，通过将免疫相关基因与基因载体复合后引入机体中使其进行表 达。通过引入外源性基因可在机体本身缺乏相应基因的情况下实现对机体免疫相关信号通 路的控制，且可根据需要对单一基因或特定基因的组合作用进行研究，简化研究对象。作为 可选方式，所述载体为常用的腺病毒等病毒载体或常用的非病毒载体（如PEI等）。
[0028] 本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥 的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0029] 本发明的有益效果：
[0030] 本发明提供了一种从基因和分子水平调控机体免疫反应的新方法，为从基因和分 子水平研究机体的免疫反应相关信号通路提供了新的切入点。同时还提供了一种从基因和 分子水平研究绿原酸抗癌机理的方法，该方法可有效控制误差和避免假阳性结果，准确性 高，易于实现。通过该方法成功筛选出4种免疫相关基因，通过该对基因的调控可有效调节 机体的免疫相关信号通路，可用于肿瘤的治疗。
【附图说明】：
[0031] 图1为实施例1中基因芯片技术检测获得的拟合曲线18和21的示意图；
[0032] 图2为趋势21给药后的6个时间点的组织的mRNA的表达谱及变化趋势
[0033] 图3为趋势18给药后的6个时间点的组织的mRNA的表达谱及变化趋势
[0034] 图4为实施例1中各组中四种基因表达的相对量，其中（a)为Nfatc2ip基因，（b) 为Nfatc3基因，（c)为Nfatc2基因，（d)CaN基因；
[0035] 图5为本发明中的免疫相关的钙离子信号通路的示意图。
【具体实施方式】：
[0036] 以下通过实施例的【具体实施方式】再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但 不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和 原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改 进，均应包括在本发明的保护范围内。
[0037] 实施例1
[0038] 1?动物模型的建立
[0039] 1. 1乳腺癌移植BALB/C鼠模型的建立
[0040] 本次实验采用的瘤株为EMT-6 (小鼠乳腺癌细胞）细胞。
[0041] 1. 2EMT-6细胞的复苏、培养、接种
[0042] 将冻存细胞株从_152°C超低温冰柜中取出，40°C水浴解冻，离心并用基础培养基 洗涤后用完全培养基悬浮细胞，转移到细胞培养瓶内，静置于5%C02细胞培养箱中37°C培 养，每2~3天换液。细胞生长铺满细胞瓶后用0. 25%胰蛋白酶消化传代培养至肿瘤接种 所需细胞数量。
[0043] 待EMT-6小鼠乳腺癌细胞细胞长满所需数量之后，用0. 25%胰酶消化，培养液吹 打、离心，收集细胞用PBS稀释，浓度调至5X106/ml，以0. 2ml/只接种于BALB/C小鼠右前 肢下方。
[0044] 接种后观察小鼠状态，待到肿瘤长至适当大小即可转种。
[0045] 1. 3肿瘤转种