[0046] 断颈处死BALB/C肿瘤小鼠，75 %酒精消毒后放于超净工作台平皿中，用高压灭菌 手术器械剪开肿瘤皮肤，分离肿瘤包膜，取出肿瘤，以消毒后生理盐水清洗，称重。剪碎瘤 体，充分匀浆制成细胞悬液。按每克肿瘤4ml溶液的比例用生理盐水稀释调整浓度，肿瘤组 的每只小鼠于右前肢下方皮下接种0. 2ml。至此，实验所需小鼠模型建立成功，可供实验所 用。
[0047] 2.实验分组
[0048]基因芯片分析：取上述模型动物随机分为：高剂量绿原酸组（20mg/kg)、多西紫杉 醇对照组和生理盐水空白对照组。每隔24小时给药一次，绿原酸组在初次给药3、6、9、12、 15和18天后取样进行基因表达检测，对照组在初次给药12天后进行取样分析。
[0049]PCR验证：取上述模型动物随机分为6组：高剂量绿原酸组（20mg/kg)、中等剂量 绿原酸组（l〇mg/kg)、低剂量绿原酸组（5mg/kg)、多西他赛阳性对照组、干扰素阳性对照组 和生理盐水空白对照组。给药方式为皮下注射给药，每隔24小时给药一次，在初次给药12 天后取出各动物体内的肿瘤组织，测量尺寸、称重后剪碎作为PCR验证的组织样本。
[0050] 3?基因芯片检测方法
[0051] 3. 1RNA的提取和标记
[0052] 米用mirVanaRNAIsolationKit(AppliedBiosystemp/nAM1556)方法，组织 收集15分钟内对总RNA进行提取。RNA的质量和浓度通过分光光度法和凝胶电泳进行检 测。所有提取的样本的A260/A280比值在2. 0-2. 1之间，28S/18S的比值为2。采用Agilent 2100生物分析仪对对结果进行进一步验证，RNA质检结果合格，且RIN值均多7. 0。
[0053] 取纯化的cRNA4yg浓缩至6. 6y1，加10y1DMS0混匀。加pH为0? 9的0? 3M碳酸 氢钠（NaHC03)溶液3. 4y1并混匀。加入到荧光染料（Cy3)中，混匀后于25°C保温1小时。 向保温后的cRNA混合物中加入4M的Hydroxylamine溶液9y1，混勾后于25°C保温15min〇
[0054] 3. 2杂交和扫描
[0055] 取Cy3cRNA加入到lOXBlockingAgent11y1 和 25XFragmentationBuffer 2. 2y1组成的混合溶液中，并加Nuclease-freewater适量，使得总体积为55y1〇加入 55y1 2XGExHybridizationBuffer。取 100yl芯片，65°C17 小时，滚动杂交。取出杂 交后的芯片，浸入37°C预热的洗液1中洗涤1分钟；再将芯片放入37°C预热的洗液2中洗 涤1分钟。最后将芯片放入Agilent扫描仪中进行扫描，分辨率为5ym，扫描仪将自动以 100%PMT和10%PMT各扫描一次，Agilent软件可自动将两次扫描的结果进行合并。
[0056] 3. 3基因芯片数据预处理
[0057] 在获得原始数据后，背景校正由安捷伦扫描仪配套软件通过划格自动读取得到。 在进行标准化之前对数据取对数（Log2)，经对数转换后，荧光信号强度的值域会缩小，数据 分布也更符合正态性，有利于标准化数据。在所有微阵列样本中选定一个基准，其他所有微 阵列数据均以该基准做变换，以求获得相同的均值密度的基线。将质量较差的探针进行过 滤，差异基因的筛选使用t检验，认为p< 0. 05的为差异基因。
[0058] 3. 4网络分析
[0059] 将用于基因表达分析的探针表达的数据，导入SBC生物芯片数据分析系统对数据 进行分析。
[0060] 4.RT-qPCR验证
[0061] 收集绿原酸组、阳性对照药物多西他赛、干扰素组及空白组的肿瘤组织的总RNA， 根据CaN、Nfatc2、Nfatc3、Nfatc2ip，检测基因的序列要求选定目标片段，并由此设计合 成引物，分别进行RT-qPCR检测。导入SBC生物分析系统，根据要验证的目标基因（CaN、 NFATC2、NFATC2ip和NFATC3)设计引物，如表1所示：
[0062] 表1各基因引物序列
[0063]
[0064] 采用分光光度计和凝胶电泳检测所得总RNA的质量和浓度，各组样品的A260/280 吸光度比值在2. 0~2. 2, 28S/18S亮度比大于或等于2,复合检测的质量要求。
[0065] 采用第一链cDNA合成试剂和T7启动子引物对所得总RNA进行反转录合成双链 cDNA〇
[0066] 以cDNA为模板分别加入相应的引物进行PCR扩增反应，采用凝胶电泳对扩增产物 进行分析。
[0067] 5.结果和讨论
[0068] 5. 1绿原酸抑制EMT-6乳腺癌小鼠的结果
[0069] 结果见表2,显示：绿原酸高、中、低剂量组，阳性对照药物多西他赛、干扰素组在 分别给药12天后，对EMT-6乳腺癌BALB/C小鼠移植瘤的生长有明显的抑制作用，与空白组 比较，有统计学差异，且绿原酸高剂量组明显高于阳性对照干扰素组。
[0070] 表2EMT-6/BABLC小鼠移植瘤重量和抑瘤率的影响（x±s,n= 5)
[0071]
P< 0. 1有差异用*表示，当P< 0. 05时有显著性差异用林表示
[0072] 5. 2绿原酸处理后的肿瘤细胞基因表达谱分析
[0073] 对筛选后的每个基因在6个时间的变化趋势进行拟合得到每个基因在给药后的 不同点的变化趋势，并对走势相似的曲线进行组合得到了 79条走势不同的曲线，其中拟合 曲线的18和21的P值为0或者接近于0 (如图1)，因此他们所代表的生物学意义与期望值 就更加的接近，我们在进行SBC生物芯片系统分析的时候主要是对这两条曲线进行分析。
[0074] (1)趋势21所涉及的基因及相关信号通路
[0075] 趋势21曲线里面所涵盖的基因共568个，在整体上均是表达上调的，所以此处分 析的基因在整个时间序列中都是呈高表达的基因，即肿瘤小鼠给予绿原酸后该组的基因的 表达都上调。见图2。
[0076] 趋势21中基因所涉及的相关信号通路主要见下表3,与抗肿瘤作用相关的具有显 著意义的信号转导通路为免疫调节类信号通路，共涉及四条通路（Tcell、Bcell、内吞作 用和NK自然杀伤等），这与绿原酸在小鼠模型能中明显抑瘤，而对裸鼠肿瘤模型抑瘤效果 较差的生物学现象相一致。以上结果提示，绿原酸主要通过调节自身免疫系统起到抗肿瘤 作用。
[0077] 另外趋势21中与抗肿瘤作用相关的主要信号通路还包括WNT通路中Duplin、 GSK3b、Dvl2、APC等基因持续增高，可以有效的促进0-catenin的降解，阻止肿瘤发展。
[0078] 表3趋势21中基因所涉及的相关信号通路
[0079]
[0080] (2)趋势18所涉及的基因及相关信号通路
[0081] 图3是拟合前的18趋势图的各个基因在给药后的6个时间点的组织的mRNA的表 达谱及变化趋势，筛选出相同时期表达情况相似的基因。该趋势曲线里面所涵盖的基因共 752个，在整体上均是表达下调的，所以此处分析的基因在整个时间序列中都是呈相对低表 达的基因，即肿瘤小鼠给予绿原酸后该组的基因的表达都下调。
[0082] 趋势18中基因所涉及的相关信号通路主要见下表4,与抗肿瘤作用相关信号转导 通路为P53信号通路、MAPK信号通路和代谢相关信号通路。
[0083] 表4趋势18中基因所涉及的相关信号通路
[0084]
[0085] (3)趋势曲线21涉及的抗肿瘤免疫信号通路及基因的分析
[0086] 将趋势线21中所涵盖的基因全部导入系统中，将21所涵盖的基因与KEGG数据 库对比、分析后得到的与表达上调基因有关的pathway-共有96个，其中具有统计学意义 (P< 0. 05)的一共有29个。在这29个具有统计学意义的pathway中我们发现与机体免疫 相关的T细胞信号传导通路、B细胞信号传导通路、NK细胞传导通路都在其中。由此可以看 出在给予绿原酸后BALB/C肿瘤小鼠的免疫系统的相关基因有出现高表达的趋势。趋势线 21中的基因所归类的G0有312个，其中P彡0.05的有6个。只有当基因既在pathway中 和G0中同时出现的时候，它可能才具有真正的生物学意义。分别对pathway和G0中的基 因进行文献查询找出对免疫相关的基因且同时出现在两者中的基因，同时结合基因表达谱 的原始分析数据，找到了以下与免疫相关的基因。具体基因见表5和图5。
[0087] 表5给予绿原酸后上调的免疫相关基因
[0088]
[0089] 5. 3荧光定量PCR验证差异表达基因
[0090] 根据图4可知，给药后绿原酸组的组织中基因Nfatc2ip、Nfatc3、Nfatc2、CaN的平 均表达量均高于空白组，阳性药物多西他赛对照组的组织中该基因的表达量低于空白组。 由Nfatc2ip、Nfatc2和Nfatc3定量PCR检测结果可见，绿原酸能有效增强免疫相关核因子 Nfatc的表达，增强机体的免疫反应。由于CaN除与免疫调节信号通路相关外，还与其他细 胞内信号通路相关，因此本实验结果显示多西他赛也能较弱地增强CaN的表达。
[0091] 6?结论
[0092] 采用基因芯片技术进行绿原酸抗肿瘤作用机理的探索性研究，研究结果显 示，给予乳腺癌模型小鼠绿原酸后，可使抗肿瘤免疫调节类信号通路（共涉及四条通 路：Tcell、Bcell、内吞作用和NK自然杀伤等）中的关键基因Nfatc2(NM_010899)、 Nfatc2ip(NM_010900)、Nfatc3 (NM_010901)和CaN(NM_001004025)上调，激活T细胞、NK细 胞和巨噬细胞等抗肿瘤免疫细胞，发挥抗肿瘤作用。RT-qPCR验