小檗碱在制备Hedgehong信号通路抑制剂中的用图
【专利摘要】本发明涉及细胞生物学、分子生物学及肿瘤药理学领域。具体涉及小檗碱在制备Hedgehong信号通路抑制剂中的用途。本发明提供了小檗碱(Berberine，以下简称BBR)在作为Hedgehog通路抑制剂的应用，特别是在抗髓母细胞瘤生长方面具有较明显的抑制作用。本发明所述的BBR可以单独成药，或将BBR作为有效成分制备抗肿瘤药物，所述药物制成片剂，胶囊剂，口服液，脂质体等剂型；扩大BBR的应用领域。
【专利说明】
小檗碱在制备Hedgehong信号通路抑制剂中的用途
技术领域
[0001] 本发明属细胞生物学、分子生物学及肿瘤药理学领域，涉及小檗碱（Berberine，以 下简称BBR)的新的药物用途，具体涉及小檗碱在制备Hedgehong信号通路抑制剂中的用 途。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了 Hedgehog(Hh)是1980年由Christianey与Eric在果绳大规模 基因突变筛选中发现的体节极性基因。通常Hh信号通路参与了昆虫胚胎体节形成和附肢 发生，同时在哺乳动物神经管分化过程中发挥关键作用，以及参与细胞的自我更新与修复； 研究显示，Hh信号通路持续异常激活有致癌作用。特别是最近通过Hh信号通路的研究，显 示Hh信号通路异常活化在许多肿瘤的发生发展过程都起了重要作用，例如在成神经管细 胞瘤、基底细胞癌、急性粒细胞白血病等的发生发展过程中。因此，阻断肿瘤细胞中Hh信号 传导通路将为人类肿瘤的治疗提供一个新的有效手段。
[0003] 已知Hedgehog家族蛋白是一种高度保守的分泌性信号分子。在哺乳动物中 存在三种同源蛋白分别为 Sonic Hedgehog (Shh)，Indian Hedgehog (Ihh)和 Desert Hedgehog(Dhh) ;Hedgehog的受体为十二次跨膜蛋白Patched(PTCH)，在哺乳动物中有两种 同源蛋白PTCH1和PTCH2。研究表明，PTCH1是三种Hedgehog蛋白的主要受体，其基因突变 后会引起多种的出生缺陷。研究还显示，PTCH下游的Smoothed(SM0)是Hh通路激活的关 键效应因子，为七次跨膜的G蛋白耦联受体，在没有Hh信号分子时，PTCH抑制SM0活性，Hh 通路处于关闭状态；一旦Hh与PTCH结合后，PTCH对SM0的抑制作用解除，SM0激活将信号 向细胞内传递。活化的Smo将信号传递到核转录因子Gli，下游的Gli转录因子被激活，以 全长形式转入核内引起靶基因的转录。
[0004] BBR是中药黄连的有效成分之一，通常作为腹泻的一种非处方药。迄今，尚未见有 关BBR可确切抑制肿瘤的生长的研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供小檗碱（Berberine，以下简称BBR)的新的药物用途，具体涉 及小檗碱在制备Hedgehong信号通路抑制剂中的用途。进一步将所述的小檗碱用于制备治 疗肿瘤的药物，特别是治疗某些实体瘤的药物。
[0006] 本发明的小檗碱（简称BBR)为天然中药黄连的有效成分之一，其具有下述结构：
[0007]
[0008] 本发明中进行了 BBR对体外细胞Hedgehog信号通路的特异性抑制作用实验， 和BBR对Hh依赖的髓母细胞瘤的体内抗瘤效应实验，结果显示：所述的BBR能显著抑制 NIH3T3细胞中Hedgehog信号活性，尤其抑制Gli lucifearse的活性并呈剂量依耐性；以及 BBR对Hh信号通路有特异性抑制作用，尤其能显著抑制C3H10T1/2中碱性磷酸酶的活性，抑 制效果呈明显剂量关系；所述的BBR对Smoothened过表达激活的Gli-luciferase活性有 抑制作用，并呈现良好量效关系，而对SmoM2激活的Gli-luciferase活性无抑制作用，提示 BBR是Smoothened的拮抗剂；以及，所述的BBR在100mg/kg剂量时对同种异体移植的髓母 细胞瘤具有较为明显的抗瘤效应。
[0009] 本发明所述的BBR可以单独成药，或将BBR作为有效成分制备抗肿瘤药物，特别是 制备抗髓母细胞瘤药物，所述药物制成片剂，胶囊剂，口服液，脂质体等剂型。
[0010] 本发明提供了小檗碱（BBR)在作为Hedgehog通路抑制剂的应用，能有效抑制与 Hedgehog信号通路活化相关的肿瘤，特别是在抗髓母细胞瘤生长中具有较明显的抑制作 用。可进一步将BBR制备成或改造成新的抗肿瘤药，扩大BBR的应用领域。
[0011] 本发明的有益效果是：
[0012] 1.本发明为Hedgehog信号通路提供了一种新的抑制剂。
[0013] 2.本发明提供了 BBR在治疗肿瘤方面的应用，特别是Hedgehog信号通路异常激活 肿瘤的应用。本发明在抑制肿瘤生长方面取得了较好的效果，同时来源广，价格低，对细胞 毒性小，有利于临床应用。
[0014] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的阐述，可以更清楚地理解本发明，但 并不限制本发明的保护范围。
【附图说明】
[0015] 图1为不同浓度下，BBR作用于NIH3T3细胞36h后Gli-luciferase活性抑制的 量效曲线，结果表明其对SHH刺激的Gli luciferase活性抑制的IC50为4. 66uM，对SAG活 化 Smoothened 激活 Hedgehog 信号的 IC50 为 8. 70uM。
[0016] 图2为不同浓度下，BBR作用于NIH3T3细胞24h后Glil mRNA表达的柱形图，呈 现良好的量效关系。
[0017] 图3为不同浓度下，BBR作用于C3H10T1/2细胞72h后对碱性磷酸酶表达的抑制 的柱形图，呈现良好的剂量关系，进一步表明其对Hh信号通路活性的抑制作用。
[0018] 图 4 为转染 Smoothened 质粒与 Smoothened M2 (W535L)质粒激活 Hedgehog 信号 后，用不同浓度的BBR作用NIH3T3细胞36h后，抑制Smoothened激活的Gli luciferase 活性；然而对SmoothenedM2(W535L)激活的Gli luciferase活性没有抑制作用，呈现良好 量效曲线，提示BBR是Smoothened的诘抗剂。
[0019] 图5为BBR与Bodipy-cyclopamine的相互作用的情况，结果表明BBR与 cyclopamine竞争性结合Smoothened，进一步说明了 BBR是Smoothened的诘抗剂。
[0020] 图6为从裸小鼠身上的髓母细胞瘤组织分离得到的髓母瘤细胞，用BBR处理24h 后显著抑制GlilmRNA的表达。
[0021] 图7为BBR(100mg/kg灌胃给药，每天一次）给药21天对裸小鼠接种的髓母细胞 瘤的生长抑制效应。
【具体实施方式】
[0022] 下列实施例举例说明了本发明的标准实验室实践，用于示范本发明的模式，而不 应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。
[0023] 应特别指出的是在下列实施例中，使用的分子生物学技术和动物实验技术是本领 域普通技术人员所熟知的，并可在诸如Rudin，C.M.et al. Treatment of medulloblastoma with hedgehog pathway inhibitor GDC-0449.N. Engl. J. Med. 361，1173 - 1178 (2009) 及 Kim J, Tang JY. et al.Itraconazole, a commonly used antifungal that inhibits Hedgehog pathway activity and cancer growth. Cancer Cell. 2010 Apr 13; 17 (4) : 388-99等参考文献中获得。
[0024] 实施例1 :BBR对体外细胞Hedgehog信号通路的特异性抑制作用
[0025] 1. BBR对体外细胞Hedgehog信号通路的抑制作用：
[0026] 1) :Gli-luciferase双荧光素酶报告基因测试
[0027] NIH3T3 (American Type Culture Collection)细胞用含 10 % (v/v)新生牛血 清（GIBC0)的 Dulbecco' s modified Eagle' s medium(DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 链霉素 (Hyclone)，37°C，5 % C02恒温培养。接种3 X 104个细胞于48孔板中。24h后用转染试剂 lipo2000 (Invitrogen)车专染Gli-dependent firefly luciferase reporter和 TK-Renilla luciferase reporter vectors。转染后48h，换成含0.5%新生牛血清（GIBC0)的培养基， SAG(lOOnM)或Shh_N conditioned medium(ShhN-CM)及配制成不同浓度的BBR对细胞进行 处理。36h后终止反应。荧光素酶活性按照双荧光素酶报告系统（Promega)的说明书使用 化学发光仪T20(p r〇mega)检测。本实验每组3个复孔，至少重复三次；
[0028] 结果显示：BBR能显著抑制NIH3T3细胞中Hedgehog信号活性，表现为抑制Gli lucifearse的活性并呈剂量依耐性，其对SHH刺激的Gli luciferase活性抑制的IC50为 4. 66uM，对 SAG 活化 Smoothened 激活 Hedgehog 信号的 IC50 为 8. 70uM(如图 1 所示）；
[0029] 2):实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)
[0030] NIH3T3细胞以4X105接种于六孔板中，24h后换成1 %新生牛血清（GIBC0)的DMEM 培养基，同时加入10% Shh_N conditioned medium(ShhN-CM)，细胞以不同浓度的BBR处 理，24h后用Trizol (北京鼎国生物）提取总RNA，以内源性的⑶SB作为参照，用逆转录试剂 盒（PrimeScript* RT Master Mix，Takara)逆转录，用SYBR? Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)(Takara)按照说明书实时定量，使用iCycler iQ system(Bio-Rad)实时焚光定量 PCR仪，对Hedgehog的靶基因Glil mRNA进行定量测定，本实验每组设置三个复孔，至少重 复三次。计算出基因的相对表达水平；
[0031] 结果显示：BBR能抑制NIH3T3中Hedgehog信号通路活性，表现Glil mRNA相对比 表达降低，且呈明显量效关系（如图2所示）；
[0032] 3):碱性磷酸酶实验：
[0033] C3H10T1/2(ATCC)细胞用含 10% (V/V)胎牛血清（GIBC0)的Dulbecco's modifies Eagle' s medium(DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 链霉素（Hyclone)，37°C，5% C02 恒温培养，以 4X 104个细胞于48孔板中，24h后加入5% Shh-N CM及配制成不同浓度的BBR对细胞进行 处理，孵育72h后，用碱性磷酸酶试剂盒测定碱性磷酸酶的活性（碧云天），本实验每个浓度 设三个复孔，至少重复三次，
[0034] 结果显示：BBR对Hh信号通路有特异性抑制作用，表现为能显著抑制C3H10T1/2 中碱性磷酸酶的活性，抑制效果成明显剂量关系（如图3所示）；
[0035] 2. BBR抑制Hedgehog信号通路作用靶点的实验：
[0036] 1) :BBR对Smoothened活化从而激活Hedgehog信号通路的抑制
[0037] NIH3T3细胞以3X104个/孔种在48孔板中，24h后用转染试剂lipo2000同 时车专染 hSmo (Origene)、Gli-dependent firefly luciferase reporter 和 TK-Reni 11a luciferase reporter vectors，转染后36h，换成含0.5%新生牛血清（GIBC0)的DMEM培养 基，用不同浓度的BBR对细胞进行处理36h后，用双荧光素酶报告系统测定Gli-luciferase 的相对活性，本实验每个浓度设三个复孔，至少重复三次；
[0038] 结果显示：BBR对Smoothened过表达激活的Gli-luciferase活性有抑制作用，并 呈现良好量效关系，而对SmoM2激活的Gli-luciferase活性未见有抑制作用（如图4所 示），提示BBR是Smoothened的诘抗剂；
[0039] 2) :BBR 与 Bodipy-cyclopamine 的相互作用
[0040] 293T(ATCC)细胞用含 10% (V/V)胎牛血清（GIBC0)的 DMEM(GIBCO)，青霉素 / 链霉素，37°C，5% C02恒温培养，以1X105个细胞接种于24孔板中，24h后用转染试剂 lipo2000(Invitrogen)转染 hsmo(0rigene)500ng，转染后 24h，换成含 1 % 新生牛血清 (GIBC0)的 DMEM 培养基，加入 Bodipy-cyclopamine (Biovision) (luM)以及不同浓度的 BBR 对细胞进行处理，37°C，5% C02恒温孵育10h后，细胞用1XPBS洗2次，4%多聚甲醛固定 lOmins，0? 1 % Triton 冰上孵育 lOmins，0? 5ug/ml DAPI (鼎国昌盛）染色 5mins, 1 XPBS 洗 2次，封片；
[0041 ] 结果显示：BBR与Bodipy-cyclopamine存在竞争性结合（如图5所示），进一步表 明BBR位Smoothened的诘抗剂。
[0042] 实施例2 :BBR对Hh依赖的髓母细胞瘤的体内抗瘤效应实验
[0043] 1.BBR对髓母细胞瘤细胞Glil mRNA表达的抑制
[0044] 选取生长良好Ptch+/ P53 / C57B/L小鼠自发生长的髓母细胞瘤组织分离得到瘤细 胞（MB 细胞），Neurobasal-A Medium(GIBCO)，B-27 添加剂（GIBC0)，丙酮酸钠（GIBC0)， L-谷氨酰胺（GIBC0)，青霉素/链霉素（Hyclone)，37°C，5 % C02恒温培养，接种5 X 106个细 胞于六孔板中，24h后细胞加以不同浓度的BBR，作用24h后用Trizol提取总RNA，以内源性 的基因⑶SB作为参照，用逆转录试剂盒（Prim&Script? RT Master Mix，Takara)逆转录， 用 SYBR* Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)(Takara)按照说明书实时定量，使用 iCycler iQ system(Bio-Rad)实时荧光定量PCR仪，对Hedgehog的靶基因Glil mRNA进行定量测 定，本实验每组设置三个复孔，至少重复三次。计算基因的相对表达水平；
[0045] 结果显示：BBR能抑制MB细胞中Hedgehog信号通路活性，表现Glil mRNA相对比 表达降低，且呈明显量效关系（如图6所示）；
[0046] 2. BBR对髓母细胞瘤生长的抑制
[0047] 取生长良好的Ptch+/ P53 / C57B/L小鼠，待髓母细胞瘤长到合适大小，取出，剪切 成1.5_左右，在无菌条件下，接种于5周龄雌性裸鼠（华阜康）的左侧腋窝皮下，待移植 瘤体积长至110mm 3左右，剔除移植瘤过大、过小以及未见生长的裸小鼠，随机分组给药，实 验组按照lOOmg/kg灌胃给药，每天一次，阴性对照组同时给等量的溶媒0. 5% CMC-Na。肿 瘤体积（tumor volume，TV)的计算公式为：TV = 1/2X长X宽2,根据测量的结果计算相 对瘤体积（relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV = Vt/V。其中V0为分笼给药时 测量所得的肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积；
[0048] 结果显示：BBR在100mg/kg剂量时对同种异体移植的髓母细胞瘤具有较为明显的 抗瘤效应（如图7所示）。
【主权项】
1. 如下式结构的小檗碱（BBR)在制备Hedgehong信号通路抑制剂中的用途，W - 〇2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的BBR抑制NIH3T3细胞中Hedgehog信 号活性。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的BBR特异性抑制Hh信号通路，其中 包括抑制C3H10T1/2中碱性磷酸酶的活性，抑制Smoothened过表达激活的Gli-luciferase 活性。4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的BBR对SmoM2激活的Gli-luciferase 活性无抑制作用。5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的BBR用于制备Smoothened的诘抗剂。6. 权利要求1所述结构的小檗碱（BBR)在制备抗肿瘤药物中的用途。7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤是髓母细胞瘤。8. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的药物制成片剂，胶囊剂，口服液或脂 质体。
【文档编号】A61P35/00GK105853416SQ201510031124
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月21日
【发明人】谭文福, 王娟, 彭元求, 刘原, 杨君
【申请人】复旦大学