作为TLR4信号通路抑制剂用于结肠癌治疗的sTLR4和MD2蛋白复合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种作为TLR4信号通路抑制剂用于结肠癌治疗的sTLR4和MD2蛋白复合物。本发明通过分别构建表达人源分泌型蛋白sTLR4和MD2后，将两者按摩尔比1:1混合后制备成sTLR4/MD2蛋白复合物，用于炎症相关疾病以及与TLR4直接相关的结直肠癌肿瘤的治疗。
【专利说明】
作为TLR4信号通路抑制剂用于结肠癌治疗的sTLR4和MD2蛋白 复合物
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种作为TLR4信号通路抑制剂用于结肠癌治 疗的sTLR4和MD2蛋白复合物。
【背景技术】
[0002] Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是一种在物种进化上高度保守的受体家 族，Toll蛋白目前为止在哺乳动物相继发现了 11种TLRs，不同的TLRs识别不同病原体相关 模式分子(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)来启动机体天然免疫系统 抗感染的第一道防线，同时对获得性免疫也具有重要的调节作用。TLRs的活化是一把"双刃 剑"，一方面通过产生前炎性因子和调节免疫细胞活性清除病原体，另一方面可能通过过量 产生的细胞因子促进内毒素休克、自身免疫病、慢性炎症和感染性疾病，使机体产生"过激" 反应带来不利影响。最新的研究显示，TLRs与肿瘤的关系密切，TLR在多种肿瘤中均有异常 表达，TLR参与肿瘤的形成并且TLR可以作为肿瘤治疗的靶标或者辅助治疗手段。
【发明内容】
[0003] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种作为TLR4信号通路抑制剂用于结肠癌 治疗的sTLR4和MD2蛋白复合物。
[0004] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0005] 所述作为TLR4信号通路抑制剂用于结肠癌治疗的sTLR4和MD2蛋白复合物，所述 sTLR4和MD2蛋白复合物中sTLR4蛋白与MD2蛋白两者的摩尔比为1: 1。.
[0006] 其中，所述sTLR4和MD2蛋白复合物中sTLR4蛋白与MD2蛋白之间离子键结合。
[0007] 所述sTLR4和MD2蛋白复合物的制备方法包括如下步骤：
[0008] (1)构建pTT5-hsTLR4-his质粒并将该质粒导入感受态细菌表达sTLR4蛋白；所述 pTT5-hsTLR4-his质粒序列如SEQ ID N0.1 所示；
[0009] (2)构建pTT5-hsMD-2-his质粒并将该质粒导入感受态细菌表达MD-2蛋白，所述 pTT5-hsMD-2-his质粒序列如SEQIDN0.2所示；
[0010] (3)将表达出的sTLR4蛋白与MD-2蛋白按权利要求1所述比例混合，即得sTLR4和 MD2蛋白复合物。
[0011]所述sTLR4和MD2蛋白复合物可用于制备治疗结直肠癌药剂。还可用于制备TLR4信 号通路抑制剂。
[0012] 本发明将原本在膜表面表达的蛋白TLR4以可溶性的形式表达，其可以有效地模拟 TLR4与配体的结合并且可能竞争性抑制膜型TLR4与所有配体的结合，模拟体内天然存在的 情况，促进分子的全面研究。
[0013] 本发明选择与结肠癌的关系证据最为确凿的TLR4作为靶标，采用STLR4和MD2蛋白 复合物作为阻断TLR4信号的策略，其可以有效地模拟TLR4与配体的结合，并且可能竞争性 抑制膜型TLR4与所有配体的结合(如细菌成分和内源性配体等）。本发明所述sTLR4和MD2蛋 白复合物可以有效抑制LPS诱导的TLR4信号传导以及TLR4活化后诱导的炎症因子以及其他 因子的产生，可以应用于炎症相关疾病及及结直肠肿瘤的治疗，为治疗结肠癌提供新的策 略和方法。
【附图说明】
[0014] 图 1 为pTT5-hsTLR4-his酶切鉴定图；图中：Lanel，2:pTT5-hsTLR4-his digested by Hindlll+BamHI；
[0015] 图2为pTT5-hSTLR4表达过Ni柱电泳图；
[0016] 图3为pTT5-hSTLR4过分子筛图；
[0017] 图4为pTT5-hSTLR4过分子筛电泳图；
[0018] 图5为pTT5-hSTLR4终产物电泳图；
[0019] 图6为pET-28a-MD-2质粒酶切鉴定结果图；图中：Lanel，2:pET-28a-MD-2NdeI + Xohl双酶切鉴定结果；
[0020] 图7为PET28a-MD-2蛋白变性过Ni柱电泳图；
[0021] 图8为PET28a-MD-2蛋白复性后电泳图；
[0022]图9为TLR4和MD-2的表达与临床CRC患者的临床病理特征的关系图；
[0023]图10为sTLR4和MD-2复合物抑制细胞膜表面TLR4与LPS的结合实验结果图；
[0024] 图11为sTLR4和MD-2复合物抑制LPS诱导的SW480细胞的周期，迀移和侵袭实验结 果图；
[0025]图12为sTLR4和MD-2复合物抑制LPS诱导的SW480细胞促炎及迀移因子的分泌实验 结果图；
[0026]图13为STLR4和MD-2复合物抑制小鼠肿瘤模型的成瘤性实验结果图。
【具体实施方式】
[0027] pTT5-hsTLR4_his质粒构建以及蛋白表达纯化
[0028] -、pTT5-hsTLR4-his 载体构建
[0029] 基因名称：hsTLR4-his(1914bp)
[0030] 模板质粒:pMD18-T-hsTLR4
[0031] 表达载体质粒:pTT5
[0032] 克隆位点：Hindll I+BamHI
[0033] 引物：
[0034] PTT5-hsTLR4-HindIII-F(正向引物）：
[0035] 5'-CCCAAGCTTGCCACCATGATGTCTGCCTCGCGCCTGG-3'（SEQ ID N0.3)
[0036] pTT5-hsTLR4-BamHI_R(反向引物）：
[0037] 5 '-CGCGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTATTCATCTGACAGGTGATATTC-3 '（SEQ ID N0.4)
[0038] 实验方法：
[0039] 1.PCR扩增目的基因
[0040] PCR扩增hs TLR4-h i s，在引物中引入Hi nd III和Bamm酶切位点. [0041 ]按以下组分制备PCR反应体系(表1):
[0042]表 1
[0044] 按以下条件设置反应程序进行PCR反应(表2):
[0045] 表 2
[0048] 琼脂糖凝胶回收目的条带，大小为1914bp。
[0049] 2.载体质粒pTT5及目的基因的Hindlll+BamHI双酶切 [0050]酶切反应在37°C水浴反应2h，载体质粒酶切体系(表3):
[0051]表 3
[0053] 目的基因酶切体系(表4):
[0054] 表 4
[0056]分别回收质粒pTT5酶切大片段和目的基因酶切产物
[0057] 3.质粒pTT5HindIII+BamHI回收大片段与目的基因连接，连接反应在22°C反应2小 时，连接反应体系(表5):
[0058]表5
[0061 ] 4.连接产物转化。取10μ1上述连接产物与100μΙ JM109感受态细菌混匀后冰浴 30min，42°C热激45s，立即置冰上放置2min，加入预热至室温的400μ1 LB培养基，37°C恒温 摇床培养lh，4000rpm离心lmin，弃去400μ1培养上清，剩余100μΙ用移液器混匀后均匀涂布 于含1 〇〇μg/ml Ampici 11 in抗性的LB平板上，37 °C恒温培养箱倒置培养过夜。
[0062] 5.挑取单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，250rpm，37 °C恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，经Hindlll+BamHI双酶切，阳性克 隆可切出1914bp的条带。鉴定正确的重组克隆进行测序验证。
[0063] 实验结果：
[0064] l.pTT5-hsTLR4-his 酶切鉴定图见图 1。
[0065] 2.测序结果
[0066] 二、sTLR4 蛋白纯化
[0067] l.hSTLR4 特性：
[0068] ①分子量预测为78k，PI为5.02
[0069] ②His标签 [0070] 2.表达纯化步骤
[0071 ]①复苏CH0-S细胞lml，加入含有2 %的血清，1 %的双抗的CH0培养基（培养基1) 6ml，1000r离心5min，倒掉上清，加入20ml培养基1，放到细胞培养摇床上，37 °C，8 %的C02培 养过夜。
[0072]②细胞计数，用培养基1，传代到3*105个细胞/ml，血清逐渐降低到0,连续传代几 天，到细胞计数为1 * 106个细胞/ml，，21，用CH0细胞培养基(细胞培养基2)
[0073] ③pTT5-hSTLR4质粒2ml，CH0培养基80ml，polyfectine转染试剂3ml，混匀，静止 30min，一滴滴加入CH0细胞培养基21，连续培养72h。
[0074] ④sTLR4细胞培养液2000r离心30min。
[0075] ⑤离心上清过Ni2+柱，缓冲溶液用20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.0。
[0076] 1)先用缓冲溶液平衡Ni2+柱。
[0077] 2)上清过GE公司的20mlNi柱，然后用缓冲溶液洗平基线。
[0078] 3)洗脱液为在缓冲溶液中分别加入30mM，50mM，500mM咪唑进行梯度洗脱。
[0079] ⑥过Ni柱30mM咪唑洗脱峰浓缩过分子筛，型号是HiprepTM16/60Sephacry I TMS-200HR，缓冲液为20mM的磷酸钠，pH7.0。
[0080] ⑦浓缩过内毒素去除柱，去除内毒素。
[0081 ]⑧用MILLEXGV filter Unit 0.22um过滤膜过滤终产物。
[0082]⑨用BCA法测浓度。
[0083] ⑩冻干。
[0084] 3.实验过程图分析
[0085] 从pTT5-MTLR4电泳图（图2)未见明显目的条带，30mM咪唑洗出的蛋白可能含目的 条带，需要进一步纯化。从图3和图4中可以看到过分子筛峰2为目的蛋白，但还是有些杂，进 一步过内毒素去除柱。从图5中可以看到很纯的目的条带。
[0086] pTT5-hsMD-2_his质粒构建以及蛋白表达纯化
[0087] 一、pTT5-hsMD-2_his 载体构建
[0088] 基因名称:hsMD-2
[0089] 表达质粒载体:pET_28a
[0090] 克隆位点：Ndel+Xohl
[0091] 引物:pET-28a-MD-2-F (正向引物）：
[0092] 5'-CCCATATGATGGAAGCGCAGAAACAGTACTGGG-3'（SEQ ID N0.5)
[0093] pET-28a-MD-2_R(反向引物）：
[0094] 5'-CCCTCGAGTAAGTTAGAGTTCGGCTGGTGCAGGATA-3'（SEQ ID N0.6)
[0095] 1.PCR扩增目的基因
[0096] PCR扩增MD-2,在引物中引入Ndel+Xoh頂每切位点.
[0097]按以下组分制备PCR反应体系(表6):
[0098]表 6
[0101 ]按以下条件设置反应程序进行PCR反应(表7):
[0102]表7
[0104]经三次PCR后琼脂糖凝胶回收目的条带，大小为435bp。
[0105] 2.载体质粒pET_28a及目的基因的Ndel+Xohl双酶切
[0106] 酶切反应在37°C水浴反应2h，载体质粒酶切体系(表8):
[0107] 表8
[0109] 目的基因酶切体系(表9):
[0110] 表9
[0113]分别回收质粒pET_28a酶切大片段和目的基因酶切产物
[0114] 3.质粒pET_28a Ndel+Xohl回收大片段与目的基因连接，连接反应在22°C反应2小 时，连接反应体系(表10):
[0115] 表10
[0117] 4.连接产物转化。取10μ1上述连接产物与100μΙ JM109感受态细菌混匀后冰浴 30min，42°C热激45s，立即置冰上放置2min，加入预热至室温的400μ1 LB培养基，37°C恒温 摇床培养lh，4000rpm离心lmin，弃去400μ1培养上清，剩余100μΙ用移液器混匀后均匀涂布 于含l〇〇μg/ml Kan+抗性的LB平板上，37°C恒温培养箱倒置培养过夜。
[0118] 5.挑取2个单菌落接种于含5ml，100μg/ml Kan+抗性的LB培养液中，250rpm，37°C 恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，经质粒Ndel+Xohl双酶切鉴定（见图 谱如Figl所示），阳性克隆可切出435bp的条带。鉴定正确的重组克隆进行测序验证。测序引 物为:T7-F(5-TAATACGACTCACTATAGGG-3)(SEQIDN0·7)挑选鉴定正确的重组质粒进行病 毒包装。
[0119] 实验结果：
[0120] 1 · pET-28a-MD_2 质粒酶切鉴定
[0121] 酶切鉴定结果表明，所挑克隆均为阳性克隆。
[0122] 2.测序结果
[0123] 二、PET28a-MD_2蛋白的纯化
[0124] l.PET28a-MD_2 蛋白基本性质
[0125] (1 )PET28a-MD_2分子量预测为19K，PI为8 · 4
[0126] (2)PET28a-MD-2 带 his 标签
[0127] (3)K+抗性
[0128] 2 · PET28a-MD_2变性复性纯化步骤
[0129] (1)菌体破菌后离心，沉淀研磨，加入100ml缓冲溶液(20mM磷酸钠，8M尿素，pH7 · 0) 变性，用高压匀浆破碎仪破菌1次。
[0130] (2)16000r离心30min，上清过GE公司的20ml Ni柱
[0131] ①先用缓冲溶液(20mM磷酸钠，8M尿素，pH7.0)平衡Ni 2+柱
[0132] ②上清过GE公司的20mlNi柱，然后用缓冲溶液洗平基线
[0133] ③洗脱液为在缓冲溶液中分别加入30mM，50mM，500mM咪唑进行梯度洗脱
[0134] (3)过Ni柱500mM咪唑洗脱液透析至20mM磷酸钠，1 %的精氨酸，ImM还原性谷胱甘 肽，0.1 mM氧化性谷胱甘肽.
[0135] (4)复性成功后，进一步透析到20mM磷酸钠缓冲液，pH7.0。
[0136] (5)过内毒素检测柱Detoxi-GelTM Endotoxin Removing Columns(Thermo) -次。
[0137] (6)用内毒素检测试剂盒检测内毒素，（湛江安度斯生物有限公司）
[0138] (7)用MILLEXGV filter Unit 0.22um过滤
[0139] (8)BCA法测浓度，分装，冻干。
[0140] 3.实验过程图分析
[0141] 从图7中可以看出该蛋白过Ni柱500mM咪唑①纯度可以，可以复性。
[0142] 从图8中可以看到目的蛋白位置大约在19k，纯度>90%，符合要求，内毒素检测〈1， 过滤，测浓度，冻干。
[0143] 由于这两种蛋白的生理上相互作用是通过离子键实现，因此将两种蛋白复合时可 选用简单的混合处理，以避免改变两种蛋白的空间结构:每lml 0.01%BSA中含sTLR4 5.0μ g和MD-2 1.25yg，37°C混合处理至少1小时。
[0144] 复合物的应用
[0145] 一、体外实验
[0146] 1. sTLR4和MD-2与细胞膜上的TLR4受体竞争性结合LPS，从而抑制了LPS-TLR4信号 通路。
[0147] 2. sTLR4和MD-2抑制SW480细胞的周期进展及迀移，侵袭能力。
[0148] 3.STLR4和MD-2抑制SW480细胞炎症因子及趋化因子的释放。
[0149] 二、体外实验
[0150] 1. sTLR4和MD-2抑制荷瘤裸鼠的成瘤性。
[0151] 2. sTLR4和MD-2抑制荷瘤裸鼠的体重下降。
[0152] 3.STLR4和MD-2抑制裸鼠肿瘤组织中炎症因子以及趋化因子的分泌。
[0153] 4. sTLR4和MD-2抑制裸鼠肿瘤组织中的血管生成。
[0154] 5.在A0M/DSS小鼠模型中，sTLR4和MD-2抑制了小鼠的成瘤性及体重减轻，同时延 长了小鼠的生存曲线。
[0155] 实验结果：
[0156] 1 .TLR4和MD-2的表达与临床CRC患者的临床病理特征的关系
[0157] 巨噬细胞在炎性疾病和炎症相关的癌症中发挥重要作用，是分泌促炎细胞因子的 主要来源之一。为检测LPS对TLR4信号通路的影响，我们检测了巨噬细胞及CRC细胞上TLR4 和MD-2的表达。RT-PCR结果显示LPS促进了巨噬细胞及CRC细胞TLR4和MD-2基因水平的表 达。对细胞上清中两种蛋白水平进行检测，发现LPS对两者的表达无明显影响。此外，检测血 清中TLR4和MD-2的表达，RT-PCR结果发现CRC患者血清中TLR4和MD-2的mRNA表达明显高于 健康对照者，而ELISA结果显示CRC患者血清中TLR4和MD-2的蛋白表达与健康对照者相比无 显著差异。进一步通过免疫组化对CRC肿瘤组织中TLR4和MD-2蛋白的表达进行验证。结果发 现，与正常组织相比，CRC肿瘤组织中的TLR4和MD-2蛋白的表达明显增高。以上结果显示，在 CRC细胞，巨噬细胞及CRC肿瘤组织中，TLR4和MD-2的表达均明显增高。（见图9, *P〈 0.05, * *Ρ〈0·01)
[0158] 2.STLR4和MD-2复合物抑制细胞膜表面TLR4与LPS的结合
[0159] 为检测sTLR4和MD-2复合物对膜表面TLR4与LPS结合能力的影响，sTLR4，MD-2及 sTLR4和MD-2复合物分别与LPS-FITC预混后加入到经PMA诱导的THP-1细胞中，通过检测细 胞表面LPS-FITC的荧光强度评估TLR4与LPS结合能力。结果发现，经sTLR4和MD-2复合物处 理后，THP-1细胞上的荧光强度与LPS-FITC组相比明显下降，而经sTLR4或MD-2蛋白单独处 理后，细胞的荧光强度没有明显降低。相同结果在结肠癌细胞株SW480上也得到验证。以上 结果提示，sTLR4和MD-2复合物可以与LPS结合，从而竞争性抑制了细胞膜上TLR4与LPS的结 合。（见图10)
[0160] 3.STLR4和MD-2复合物抑制LPS诱导的SW480细胞的周期，迀移和侵袭
[0161] 为检测sTLR4和MD-2复合物对LPS诱导后SW480细胞周期的影响，流式细胞术检测 相应蛋白作用后各组细胞周期的改变。结果发现sTLR4和MD-2复合物显著抑制了细胞的周 期进程。此外，我们检测了sTLR4和MD-2复合物对结肠癌细胞迀移和侵袭能力的影响。结果 发现，sTLR4和MD-2复合物显著抑制了肿瘤细胞的迀移和侵袭能力。（见图11，* P〈0 · 05)
[0162] 4. sTLR4和MD-2复合物抑制LPS诱导的SW480细胞促炎及迀移因子的分泌
[0163] 为检测sTLR4和MD-2复合物对炎症的抑制作用，LPS与相应蛋白混合后分别作用于 SW480细胞，检测各组细胞中促炎因子及趋化因子的水平。结果发现，经sTLR4和MD-2复合物 处理后，肿瘤细胞分泌的促炎因子TNF-α，IL-8，IL-6及趋化因子CXCL1，丽P2的mRNA水平显 著降低，同时IL-8和CXCL1的蛋白水平也明显下降。以上结果提示，sTLR4和MD-2复合物抑制 了LPS诱导的SW480细胞促炎因子及迀移因袭的分泌。（见图12，* P〈0.05)
[0164] 5. sTLR4和MD-2复合物抑制小鼠肿瘤模型的成瘤性
[0165] 为探讨sTLR4和MD-2复合物在小鼠肿瘤模型中的保护作用，我们成功构建裸鼠荷 瘤模型和腹腔种植转移模型，并观察sTLR4和MD-2复合物对两种小鼠模型在LPS作用后的影 响。结果发现，sTLR4和MD-2复合物处理后，两种肿瘤模型小鼠的肿瘤体积与其他组相比均 明显减小，而体重无明显改变。此外，肿瘤组织中的促炎因子TNF-α和IL-6的mRNA及蛋白表 达明显下降，而具有抑制炎症因子IL-10的表达却显著增高。同时，我们发现sTLR4和MD-2复 合物处理后，肿瘤组织中VEGF的mRNA水平明显下降，免疫组化结果也显示肿瘤组织中⑶31 显著降低。另外，我们还在A0M/DSS小鼠模型中探讨sTLR4和MD-2复合物的保护作用。同样 的，STLR4和MD-2复合物抑制了小鼠结肠的缩短程度，抑制了小鼠体重的下降，延长了小鼠 的生存时间。（见图13, *Ρ〈0·05)
[0166] TLR4已经被证实与多种癌症密切相关，包括胃癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和结肠 癌。又有研究报道TLR4的高表达与结直肠癌的肝转移关系密切。我们的研究同样证实了这 一点。鉴于TLR4在老鼠和结肠炎相关的结肠炎中的作用，缺失TLR4的老鼠可以达到预防结 直肠癌的作用，证实了TLR4可以直接或间接促进肿瘤进展。我们的研究从体内体外两方面 分别证实了 sTLR4/sMD-2复合物对肿瘤细胞生物学行为和肿瘤生成的抑制作用。国外也有 学者报道了类似的研究在胃癌肿瘤细胞中的作用。总之，LPS诱导的TLR4信号的活化促进了 CRC生长，粘性和转移能力。针对TLR4信号通路的研究将有可能为结直肠癌的防治提供新的 治疗策略。
【主权项】
1. 一种作为TLR4信号通路抑制剂用于结肠癌治疗的STLR4和MD2蛋白复合物，其特征在 于，所述sTLR4和MD2蛋白复合物中sTLR4蛋白与MD2蛋白两者的摩尔比为1:1。2. 如权利要求1所述的sTLR4和MD2蛋白复合物，其特征在于，所述sTLR4和MD2蛋白复合 物中sTLR4蛋白与MD2蛋白之间离子键结合。3. 如权利要求1或2所述sTLR4和MD2蛋白复合物的制备方法，其特征在于，所述方法包 括如下步骤： (1) 构建pTT5-hsTLR4-hi s质粒并将该质粒导入感受态细菌表达sTLR4蛋白；所述pTT5-hsTLR4-his质粒序列如SEQ ID Ν0.1所示； (2) 构建pTT5-hsMD-2-his质粒并将该质粒导入感受态细菌表达MD-2蛋白，所述pTT5-hsMD-2-his质粒序列如SEQIDN0.2所示 ； (3) 将表达出的sTLR4蛋白与MD-2蛋白按权利要求1所述比例混合，即得sTLR4和MD2蛋 白复合物。4. 权利要求1或2所述sTLR4和MD2蛋白复合物在制备治疗结直肠癌药剂中的应用。5. 如权利要求1或2所述sTLR4和MD2蛋白复合物在制备TLR4信号通路抑制剂中的应用。
【文档编号】A61K38/17GK105949319SQ201610268515
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】戴盛明, 邹燕, 覃凤娴, 陈纪飞, 蒙杰, 韦柳华, 梧春林, 张巧云, 陈翔, 陈晓丽, 吴昊, 韦东
【申请人】柳州市工人医院