羊抗人apob多克隆抗体的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种羊抗人APOB多克隆抗体的制备方法，步骤依次为抗原提取、动物免疫、抗血清的纯化处理；其中：所述抗原提取是将提取的APOB抗原与液体石蜡，羊毛脂，卡介苗及表面活性剂混合乳化；所述表面活性剂包含以下种类中的一种或者几种：曲拉通X?100、吐温?20、PEG20000。本发明从人血清里提取天然的APOB抗原，然后用此抗原免疫动物得到的多抗与其它抗原校准品匹配性很好。本发明制备工艺简单，免疫动物时在抗原里加入少许表面活性剂能使抗体效价得到提高。
【专利说明】
羊抗人APOB多克隆抗体的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及多克隆抗体的一种制备方法，尤其涉及载脂类ΑΡ0Β多克隆抗体的制备
方法。
【背景技术】
[0002] 抗原免疫动物产生的抗体是血清γ -球蛋白的一部分。γ -球蛋白是一组结构相似但又有差异的蛋白质通称为免疫球蛋白按其结构和免疫化学性质的差异又可分为五
类分别称为I gG、I gA、I gM、IgD和IgE，抗体以IgG最为稳定。因蛋白在体液中含量不同以及分离纯化的难易的差别可分别采用多克隆抗体制备法和单克隆抗体制备法。
【发明内容】
[0003] 本发明为了克服现有技术的不足，如何在少使用抗原的同时增强抗体的活性与效价，为了达到此目的，本发明设计了一种抗原乳化液，其特征在于:在乳化液里加入卡介苗与少量表面活性剂，使产生的ΑΡ0Β抗体效价大幅度提高。
[0004] 本发明的目的提供了一种ΑΡ0Β多克隆抗体的制备方法，在抗原乳化液里加入卡介苗与少量表面活性剂，使抗体效价较普通的方法得到提高。
[0005] 本发明的具体技术方案是:一种羊抗人ΑΡ0Β多克隆抗体的制备方法，步骤依次为抗原提取、动物免疫、抗血清的纯化处理;其中：
所述抗原提取是将提取的ΑΡ0Β抗原与液体石蜡，羊毛脂，卡介苗及表面活性剂混合乳化;所述表面活性剂包含以下种类中的一种或者几种：曲拉通X-100、吐温-20、PEG20000。
[0006] 进一步的，所述抗原提取步骤是： a.将人血清密度调整到1.06g/ml。
[0007] b.超速离心，4万转/分钟，10小时。
[0008] C.离心结束后吸取第二层即为较纯净的ΑΡ0Β抗原。
[0009] 进一步的，所述的动物免疫是将乳化好的抗原免疫羊，每半月免疫一次，共免疫 4-6 次。
[0010] 进一步的，所述混合乳化步骤中，每升乳化液中曲拉通X-100的添加量在25μ1? 2.5mL之间。
[0011 ] 进一步的，所述混合乳化步骤中，每升乳化液中吐温-20的添加量在16μ1?1.6mL之间。
[0012] 进一步的，所述混合乳化步骤中，每升乳化液中PEG20000的添加量在0.5g~10g之间。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明用免疫双扩散方法测定抗体的效价与纯度的示意图。
【具体实施方式】
[0014] 下面对本发明做进一步描述：
(1)抗原：目前所知的载脂蛋白进入异种机体后能致敏淋巴细胞，与抗体产生特异性结合复合物即具备有抗原性。抗原性包括免疫原性和抗原特异性两方面的含义。载脂蛋白因具备抗原特异性和免疫原性，因此可称为完全抗原。大多数动物的免疫系统是非常敏感的，用于免疫的抗原仅需要极微量。抗原应该是纯化品，该纯品电泳后仅出现一条区带， 即认为可用于免疫抗原纯品。
[0015] 本发明的ΑΡ0Β抗原是从人血清里经超速离心提取，经电泳后出现一条带，故可用于动物免疫。
[0016] (2)佐剂:佐剂是指与抗原混合注入机体后能增加抗原的免疫性或者能改变免疫反应类型的一种物质。人们公认的佐剂是福氏佐剂(Freund’adjuvant )，具有明显的免疫刺激作用。福氏佐剂又可分为两种：即不完全佐剂和完全佐剂，属于一种油包水的乳剂。由羊毛脂与液体石蜡组成。油包水乳化剂有助于促进免疫反应的进行，还可起部分保护不稳定抗原的作用，使抗原在体内的吸收期延长，从而减少加强注射的次数。在不完全佐剂内加入杀死的分枝杆菌(如结核杆菌或卡介苗)制备成完全佐剂。分枝杆菌能增加局部淋巴结的炎症反应，扩大免疫原性，从而促进最终高亲和力抗体的形成。
[0017] 佐剂制备方法:取石蜡油6份、羊毛脂4份再加5份不含抗原的抗原缓冲液，混匀， 灭菌分装于小玻璃瓶中，〇—8°C保存，此为不完全全佐剂。在不完全佐剂中加入卡介苗 (3—5mg)即为完全佐剂，均贮存于0—8°C。临用时取完全佐剂3份加入含抗原的缓冲液1份， 混匀振摇或研磨，使其成为乳化状态，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，无统一标准和固定模式。一般是每羊(约20kg重)最多每次不超过3mg抗原量。
[〇〇18]本发明乳化液的组成：
液体石蜡6份羊毛脂4份抗原缓冲液5份卡介苗1份 ΑΡ0Β抗原2份表面活性剂0.5份
将上述物质混合后研磨成乳化状就可以免疫动物了。
[0019] (3)免疫途径及方法免疫部位可分别选用皮内、皮下或淋巴结。第1次免疫采用皮内结合皮下多点注射，常注射在背部或腿部。许多作者介绍在后足皮下或皮内注射，因为四足落地的关系很易造成感染，使第1次免疫失效，并使动物行走不便，造成伤害。整个免疫过程以2—3个月为宜。一般是第1次免疫后的2—3周再进行第2次免疫，待最后一次免疫后的7—10天取静脉血测试抗体效价(试血），效价达到要求后即可一次性放血，采用颈动脉放血，得抗血清。
[0020] (4)抗血清的获得与保存:免疫成功的动物放血过程，所有用具均严格消毒并按无菌操作方式进行放血。放血收集的血清一般含有的杂质比较多，需要进一步纯化，本发明采用饱和硫酸铵方法纯化血清得到纯度较高的APOB抗体。抗血清的防腐剂以Ο . 1 %叠氮钠为宜，也可采用加入20%?30%无菌甘油保存的方法。若时间较长，可采用一70°C低温保存。一般在0 — 8°C保存1年，抗体效价几乎无改变保存2年，其效价稍有降低。抗体切忌反复冻融，否则抗体效价很快降低，以颈动脉一次性放血为宜。
[0021 ] (5)抗体的鉴定:抗体检测可分别采用免疫火箭电泳法、单向扩散法、免疫电泳法、
ELI SA法、免疫透射比浊法和放射免疫沉淀法。
[〇〇22] 1，免疫扩散法
将均匀地混合制备0.8%琼脂糖凝板，呈三角形打三个孔分别加样人ΑροΒ抗原，抗人 ΑροΒ血清、人全血清于三孔内，水平置于37°C温箱内扩散，观察白色沉淀线。
[〇〇23] 2.免疫电泳扩散法
制备10x6cm琼脂糖胶板沾横轴方向间隔打三个孔挖二条小槽于孔内加入全血清各电泳，电压40分钟后取出胶块，再治电泳方向于三孔间挖二条小槽，再分别加入抗人 ΑροΒ血清和抗人全血清，待血清进入洗胶后，水平置于37度温箱中，S卩12-24h观察沉淀线。 [〇〇24] 3.免疫火箭电泳
制备含有人ΑροΒ抗血清或抗人全血清的0.8%琼脂糖胶板，在含抗体的琼脂糖胶板一端打一抗原孔，将抗原置阴极电泳3-4小时置于10%三氯醋酸固定15-20min取出胶板，在黑色背景下量取白色沉淀峰的高度或面积。
[〇〇25] 4干燥、染色
将上述各类型胶块转移到薄胶片上，置〇.9%Nacl中漂洗除去胶中血清，此时免疫复合物仍将化胶中.清洗完毕，取出附在胶片，凉干，再染色，可照相，复印，永久保存。
[0026] 本发明用免疫双扩散方法测定抗体的效价与纯度，具体方法是以琼脂糖为基质缓冲液，在培养皿里铺板，在板中央打一个孔，放人血清标本。在板周围打一圈孔，放置按一定效价稀释好的ΑΡ0Β抗体（比如按此比例稀释抗体：1:80，1:120，1:160，1: 200，1: 260，1: 300)，如图1所示。
[0027] 加好样后放在烘箱里37度烘烤24小时，然后观察反应沉淀线的情况。本实验效价能达到1:300，且只有单一沉淀线，抗体比较纯。
[0028] 从实验数据看本发明所产生的抗体效价比较高且比较纯。
【主权项】
1. 一种羊抗人APOB多克隆抗体的制备方法，步骤依次为抗原提取、动物免疫、抗血清的 纯化处理;其中： 所述抗原提取是将提取的ΑΡ0Β抗原与液体石蜡，羊毛脂，卡介苗及表面活性剂混合乳 化;所述表面活性剂包含以下种类中的一种或者几种：曲拉通Χ-100、吐温-20、PEG20000。2. 根据权利要求1所述的一种羊抗人APOB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗 原提取步骤是： a. 将人血清密度调整到1.06g/ml; b. 超速离心，4万转/分钟，10小时； c. 离心结束后吸取第二层即为较纯净的APOB抗原。3. 根据权利要求1所述的一种羊抗人APOB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的 动物免疫是将乳化好的抗原免疫羊，每半月免疫一次，共免疫4-6次。4. 根据权利要求1所述的一种羊抗人APOB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述混 合乳化步骤中，每升乳化液中曲拉通X-100的添加量在25μ1?2.5mL之间。5. 根据权利要求1所述的一种羊抗人APOB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述混 合乳化步骤中，每升乳化液中吐温-20的添加量在16μ1?1.6mL之间。6. 根据权利要求1所述的一种羊抗人APOB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述混 合乳化步骤中，每升乳化液中PEG20000的添加量在0.5g~10g之间。
【文档编号】C07K16/06GK105949310SQ201610584752
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月25日
【发明人】任传伍, 刘作鹏, 崔鹏飞, 练子富
【申请人】上海华臣生物试剂有限公司