绿原酸在激活机体的wnt信号通路中的用途及其研究方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体设及绿原酸在激活机体的WNT信号通路中的用途 及其研究方法。 技术背景
[0002] 绿原酸khlorogenicacidCGA)又名咖啡较酸，是由咖啡酸kaffeicacid CA)和奎尼酸（quinicacidQA)组成的缩酪酸，其化学名为3-0-咖啡酷奎尼酸 (3-〇-caffeo^quinicacidCGA)。绿原酸是植物在进行有氧呼吸的过程中，经憐酸戊糖途 径中间产物合成的一种苯丙素类物质。绿原酸已经被开放应用于食品，保健品，化妆品和药 品等多个领域。由于它广泛的存在于常见的各种蔬菜水果中，具有多种生物活性，如：屯、 血管保护作用、抗氧化作用、抗紫外及抗福射作用、抗诱变及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作 用、降脂降糖作用、免疫调节作用等。在医药化工和食品等领域都具有广泛的应用。目前已 有大量证据显示绿原酸具备抗癌功能，然而，目前为止绿原酸抗癌功能的分子学作用机制 尚不明确，从而限制了人们从分子和基因层面对其抗癌机理相关的信号通路、精确的作用 祀点、具体生物因子的准确把握和应用。
【发明内容】
[0003] 针对上述问题，本发明提供了绿原酸的一种从基因和分子水平调控机体WNT信号 通路新用途，即绿原酸在激活机体的WNT信号通路中的用途，建立了WNT信号通路与绿原酸 抗癌功能之间的分子学联系，提供了一种通过绿原酸精确调控机体WNT信号通路的方法。 通过该应用可进一步用于指导肿瘤的治疗，也可W用于建立相关的研究模型用于对WNT信 号通路的具体作用原理或其他相关的应用。
[0004] 进一步的，所述机体为患癌机体，更进一步的为荷瘤小鼠。
[0005] 进一步的，在上述应用中通过上调基因GSK-3P和APC的表达来激活WNT信号通 路。
[0006] 进一步的，还同时下调P-Catenin基因的表达。
[0007] 作为可选方式，在上述用途中，将绿原酸制作成含有效剂量的药物制剂后施用于 机体。
[0008] 作为可选方式，在上述用途中，所述绿原酸的使用剂量为：l-100mg/kg。优选为 20 ~40mg/kg。
[0009] 作为可选方式，所述的药物制剂是W绿原酸为有效成分，加入一种或多种药学上 可接受的药用赋形剂制备而成的制剂。
[0010] 作为可选方式，所述的药物中每制剂单位含有绿原酸1~3000mg。
[0011] 作为可选方式，所述的药物是口服制剂、注射制剂或外用透皮给药制剂。 阳01引作为可选方式，所述的药物是绿原酸浓度为1~40mg/血的生理盐水注射液。也 可选择其他药学上可接受的注射液。
[0013] 本发明还提供了一种绿原酸激活机体WNT信号通路的分子机制的研究方法，包括 W下步骤：
[0014] (1)建立动物模型；
[0015] (2)采用绿原酸对模型动物进行干预作为实验组，同时建立对照组；
[0016] (3)采用基因忍片技术获得实验组和对照组中的差异表达基因；
[0017] (4)采用时间序列分析、基因功能分类分析（GO)和信号通路分析筛选出相关的基 因；
[0018] (5)采用ELISA技术或分子印记检测（westernblottest)技术或PCR技术对步 骤（4)筛选出的基因进行验证。
[0019] 采用目前的基因忍片对模型动物的基因表达进行分析时，由于方法本身的系统误 差和随机误差（如RNA的提取、反转录、杂化过程中产生的误差W及基因忍片和RNA质量 的影响等）会在一定程度上影响分析结果的准确性，该方法虽然可W快速基因表达的差异 但由误差导致的假阳性结果的可能性也很大，本发明通过将基因忍片技术分析获得的差异 表达基因与pathway(信号传导通路）和GO(geneontology)两个指标来进行分析和相互 验证，将差异基因控制在研究目标相关功能基因的范围内有助于高效准确地筛选出目标基 因，同时采用化ISA技术或分子印记检测（westernblottest)技术或PCR技术对步骤（4) 中筛选出的基因进行验证，可有效避免假阳性，提升结果的可信度。
[0020] 作为可选方式，所述步骤（1)中的动物模型为小鼠EMT-6乳腺癌动物模型，本领域 技术人员也可根据研究需要和实际情况灵活选择其他动物模型。
[0021] 作为可选方式，所述步骤（2)中的对照组可W包括阳性对照、阴性对照、空白对 照，本领域技术人员可根据研究需要和实验对照的公知设计原理进行灵活的选择。例如，所 述对照组可W包括多締紫杉醇干预组、干扰素干预组和生理盐水空白对照组。
[0022] 作为可选方式，所述步骤（2)中的实验组中包括多个不同剂量的实验组。进一步 的，包括绿原酸剂量分别为5mg/kg、lOmg/kg和20mg/kg的S个实验组。作为可选，各实验 组和对照组分别设置至少3组平行试验，优选为5组平行试验。
[0023] 本发明还提供了一种采用上述方式筛选出的基因在激活机体的WNT信号通路中 应用，其特征在于，通过促进机体本身的WNT信号通路关键基因的表达或向机体中引入外 源性的WNT信号通路关键基因。通过促使相关基因的高表达，激活WNT信号通路来实现抗 癌效果。
[0024] 作为可选方式，所述WNT信号通路关键基因为GSK-3 P和APC中的至少一种。研 究证实：糖原合成激酶3(GSK-3P)基因是泛素连接酶E3(APC)的上游基因，GSK-3P基因 能够上调APC基因的表达，两者又能在WNT信号通路直接下调处于更下游的P -连环蛋白 (P-catenin)基因的表达。P-连环蛋白可作为细胞核内的一种转录因子来促进细胞分裂 基因的表达，P-连环蛋白的积累可能会导致肿瘤的形成。另外，糖原合成激酶3可通过多 种信号通路对转录活性、细胞的增殖、分化和迁移产生影响，还能够使轴蛋白和P-连环蛋 白憐酸化，导致P-连环蛋白降解。APC基因的表达可在细胞分裂后期促进免疫复合物的高 效、快速和高度选择性的降解，同时也可W使轴蛋白和P-连环蛋白憐酸化，导致P-连环 蛋白降解。本发明通过上调GSK-3P和APC基因来抑制P-连环蛋白基因的表达和降低体 内的P-连环蛋白水平，通过WNT信号通路促进肿瘤细胞的调亡，可实现抗肿瘤功能。
[00巧]作为可选方式，通过向机体施用有效剂量的绿原酸来促进机体本身的WNT信号通 路关键基因的表达。采用绿原酸依靠机体自身的响应机制可同时实现上述2种基因的高表 达，对WNT信号通路进行多方位的协同调节，有利于提高综合抗癌作用。
[00%] 作为可选方式，通过将WNT信号通路关键基因与基因载体复合后引入机体中使其 进行表达。通过引入外源性基因可在机体本身缺乏相应基因的情况下实现对WNT信号通路 的控制，且可根据需要对单一基因或特定基因的组合作用进行研究，简化研究对象。作为可 选方式，所述载体为常用的腺病毒等病毒载体或常用的非病毒载体（如PEI等）。
[0027] 本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥 的特征和/或步骤W外，均可任何方式组合。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] 本发明提供了一种从基因和分子水平调控机体的WNT信号通路的新方法，为从基 因和分子水平研究机体的WNT信号通路提供了新的切入点。同时还提供了一种从基因和分 子水平研究绿原酸抗癌机理的方法，该方法可有效控制误差和避免假阳性结果，准确性高， 易于实现。通过该方法成功筛选出2种WNT信号通路关键基因，通过对该基因的调控可有 效调节机体的WNT信号通路，可用于肿瘤的治疗。
【附图说明】：
[0030] 图1为实施例1中基因忍片技术检测获得的拟合曲线18和21的示意图，其中（a) 拟合曲线18,（b)为拟合曲线21 ; 阳03U 图2为实施例1中各组中立种基因表达的相对量，其中（a)为GSK-3P基因，化） 为APC基因，（C)为P-catenin基因；
[0032] 图3为本发明中的WNT信号通路的示意图。
【具体实施方式】：
[0033]W下通过实施例的【具体实施方式】再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但 不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。在不脱离本发明的精神和 原则之内做的任何修改，W及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改 进，均应包括在本发明的保护范围内。 阳〇34] 实施例1
[0035] 1.动物模型的建立
[0036] 1. 1乳腺癌移植BALB/C鼠模型的建立
[0037] 本次实验采用的瘤株为EMT-6 (小鼠乳腺癌细胞）细胞。
[0038] 1. 2EMT-6细胞的复苏、培养、接种
[0039] 将冻存细胞株从-152°C超低溫冰柜中取出，40°C水浴解冻，离屯、并用基础培养基 洗涂后用完全培养基悬浮细胞，转移到细胞培养瓶内