工布乌头在缓解果蝇肠道炎症损伤中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及工布乌头提取物在缓解果蝇肠道炎症损伤方面的应用，涉及果蝇天然免疫技术领域。
【背景技术】
[0002]正常情况下，肠粘膜屏障中的正常菌群与宿主之间具有一定的平衡。不良的外界环境，感染等条件下均会引起肠道内稳态失调，进而诱导机体产生全身或局部炎症反应。病原体通过肠道进入机体后，诱导肠道表皮细胞激活一系列免疫应答反应，最终通过产生抗菌肽和活性氧将病原体杀死。在果幡中，一个肠道干细胞(Intestinal stemcell, ISC)进行不对称分裂通常可产生两个细胞，其中一个细胞保持干细胞特性，另一个为短暂不分裂的成肠细胞(Enteroblast, EB)，成肠细胞可继续分化为吸收型的肠上皮细胞(Enterocyte, EC)或者分泌型的内分泌细胞(Enteroendocrine cell, EE)。上述细胞的共同作用可实现肠道组织的维持和更新。与哺乳动物肠道相比，果蝇的肠道结构及细胞组成相对简单，而且调节肠道功能的相关信号途径都与哺乳动物相似。综上，研宄果蝇肠道免疫调节机制及肠道干细胞分化机制对揭示人类肠道相关疾病的发病机制具有重要的指导意义。
[0003]工布乌头(Aconitum kongboense Lauener)分布于中国西藏，四川西部等地，是常用藏药。工布乌头有毒，具有祛风除湿，止痛等功效，用于治疗湿关节疼痛，跌打损伤，毒虫咬伤等病症。然而，目前尚无对工布乌头提取物用于缓解肠道炎症损伤的相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于揭示出工布乌头提取物可应用于缓解肠道炎症损伤。
[0005]上述目的是通过以下方案予以实现的:
[0006]首先给果蝇喂食有毒试剂(SDS和DSS)来建立果蝇肠道炎症损伤模型，将工布乌头提取物进行果蝇生存率、肠道上皮细胞数量及免疫染色、肠道形态学观察等实验，结果发现工布乌头提取物具有较好的抗炎活性，可用于制备抗炎药物，尤其是治疗肠道炎症的药物。
【附图说明】
[0007]图1为工布乌头提取物对SDS和DSS处理后果蝇生存率的影响；
[0008]图2为工布乌头提取物对SDS处理后果蝇肠道干细胞和成肠细胞数量的影响；
[0009]图3为工布乌头提取物对SDS处理后果蝇肠道细胞免疫染色结果的影响；
[0010]图4为工布乌头提取物对SDS处理后果蝇肠道形态的影响；
【具体实施方式】
[0011]下面结合实例对本发明作进一步说明:
[0012]实验动物:野生型W1118品系黑腹果幡(Drosophila melanogaster)为实验室保存，esgGal4 UAS-GFP由北京大学袭荣文教授提供。果蝇培养温度为25°C、相对湿度60%。
[0013]果蝇培养基的配制:对照组培养基配方为玉米粉14.2g、琼脂1.lg、酵母粉3.3g、大豆粉1.9g、白糖17g、丙酸0.94mL、去离子水200mL。实验组中加入与对照组去离子水等体积的工布乌头提取液，实验组中工布乌头提取物的浓度为I %。
[0014]本实施例涉及的各实验试剂均为市售分析纯:SDS和DSS等。
[0015]实施例1工布乌头水提取液的制备
[0016]称取工布乌头粉末10g，加入300mL去离子水隔夜浸泡12h，中火熬制3h，过滤，滤渣后加入200mL去离子水用同样的方法提取I次，合并2次滤液浓缩至50mL，即得到质量浓度为200mg/mL(20% )的中草药水提取液。4°C密封储存备用。
[0017]实施例2工布乌头提取物对SDS和DSS处理后果蝇生存率的影响
[0018]以普通培养基中培养的果蝇作为对照组，工布乌头培养基中培养的果蝇作为实验组。分别随机收集对照组和实验组羽化了 3?5天的果蝇，每组中雌雄果蝇各15只。各组果蝇饥饿处理2h后转移到放有5层滤纸的果蝇管中，向滤纸中分别加入5%蔗糖溶液包含
0.6% SDS,4% DSS等致炎因子使滤纸充分润湿，每24h更换一次滤纸并记录果蝇死亡数。
[0019]结果显示:SDS处理果蝇4天后，对照组生存率降到26.6%，而喂食工布乌头的实验组生存率为57.1% (*#P〈0.001)，与对照组相比提高了 30.5% (图1A)。另外，DSS处理果蝇7天后，对照组的生存率仅为10%，而喂食工布乌头的实验组生存率分别为50.9%(***P〈0.001)，比对照组提高了 40.9% (图1B)。上述结果说明，工布乌头提取物可缓解SDS和DSS诱导的肠道炎症损伤，显著地提高了果蝇的生存率。
[0020]实施例3工布乌头提取物对SDS处理后果蝇肠道干细胞和成肠细胞数量的影响
[0021]随机收集对照组和实验组羽化3?4天的雌果蝇喂食含5%蔗糖的SDS (0.6% )溶液16h，显微镜下提取10?15条果蝇肠道于甲醛中，常温固定30min后与GFP抗体结合，4°C过夜。2抗rat-FITC结合2h后DAPI染色lOmin，最后用甘油封片，于焚光显微镜下观察并照相。
[0022]结果显示:喂食工布乌头实验组中GFP阳性细胞(前体细胞，包括肠道干细胞和成肠细胞)数较对照组相比明显减少，结果见图2。以上结果表明工布乌头可以较好地抵御致炎因子处理后干细胞及成肠细胞的过度增殖。
[0023]实施例4工布乌头提取物对SDS处理后果蝇肠道细胞免疫染色结果的影响
[0024]随机收集对照组和实验组羽化3?4天的雌果蝇喂食含5%蔗糖的SDS (0.6% )溶液96h，显微镜下提取10?15条果蝇肠道于PBS中，7-AAD室温染色30min，多聚甲醛固定lOmin，DAPI染色lOmin，甘油封片后焚光显微镜下观察并拍照。
[0025]结果显示:对照组的肠道上皮细胞均出现大量死亡，而喂食工布乌头的实验组中肠道上皮细胞的死亡数量明显减少，结果见图3。
[0026]实施例5工布乌头对SDS处理后果蝇肠道形态的影响
[0027]收集羽化了 3?4天的雌果幡，SDS处理后，显微镜下提取10?15条果幡肠道于PBS中，自然光下观察肠道形态变化。
[0028]结果显示:SDS处理的对照组由于肠道上皮细胞大量死亡，长度明显缩短，而且在中后肠位置出现了明显的黑色素瘤。当喂食工布乌头时，与对照组相比肠道长度明显增加，而且没有出现黑色素瘤，结果见图4。
[0029]综上所述，通过对果蝇生存率、肠道干细胞和成肠细胞数量变化、肠道细胞染色及肠道形态的分析，我们认为工布乌头提取物可缓解果蝇肠道炎症损伤。
【主权项】
1.工布乌头提取物在缓解果蝇肠道炎症损伤中的应用，其特征在于: 工布乌头水提物能提高果蝇喂食SDS或DSS后的生存率，同时缓解SDS引起的肠上皮细胞的凋亡，肠道黑色素瘤的产生及前体细胞的过度增殖。
【专利摘要】本发明是工布乌头提取物在缓解果蝇肠道炎症损伤中的应用。采用水提法得到工布乌头提取物，对工布乌头提取物进行果蝇肠道炎症损伤模型修复实验，结果发现工布乌头提取物具有良好的抗炎活性，可用于制备抗炎药物,尤其是抗肠道炎症损伤的药物。
【IPC分类】A61P29/00, A61K36/714, A61P1/00
【公开号】CN104983821
【申请号】CN201510377387
【发明人】金丽华, 于世超, 王超, 关法春
【申请人】东北林业大学, 金丽华
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月2日