专利名称：瘤细胞侵润特性测试装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种体外检测生物细胞侵润能力的装置，尤其是能够检测瘤细胞侵润组织和转移的能力。
背景技术：
恶性肿瘤转移危及癌患者生命。肿瘤转移过程包括瘤细胞自瘤组织脱离，在循环系统存活及转移至其他组织器官生长。在肿瘤转移过程中，瘤细胞侵润基底膜是关键步骤并在病理学中作为恶性肿瘤的标志。基底膜是细胞外基质，位于上皮细胞基底部。正常情况下，基底膜作为屏障阻止细胞和大分子通过。而恶性肿瘤细胞可分泌酶降解基底膜，从而穿过基底膜屏障进入邻近组织。
现有几种体外检测瘤细胞侵润能力的方法。例如厚胶培养法，直接将细胞外基质置于培养皿中形成胶状物，将瘤细胞置于胶状细胞外基质表面。瘤细胞可降解细胞外基质并逐渐向培养皿底部移动。该法实验周期长且仅限于作定性分析。
目前最常用的是玻而登(Boyden)小室方法。该法需预先在一微孔滤膜表面覆盖一层细胞外基质，然后将下部小室充满培养液及化学趋向因子，再将微孔滤膜置于下部小室上方，装配上部小室，然后将上部小室内加入瘤细胞悬液。瘤细胞可降解细胞外基质并穿过滤膜微孔进入下部小室。该法不仅操作步骤繁杂，费时，而且在操作过程中极易丢失侵润的瘤细胞从而导致定量分析不准确。
改良的多孔细胞培养板插入带膜小室方法虽然简化了一些操作步骤，但是仍未解决上述定量分析不准确等缺陷。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种简单装置来检测瘤细胞侵润能力。使用本装置操作步骤简单，瘤细胞培养，分离，染色，计数及分析均在同一载物片上进行，不仅简化了操作步骤，而且避免了细胞损失，所得结果适用于定量分析。
用于瘤细胞侵润性测量的该装置，包括一透明载物片，该载物片包括一个或一个以上测试区，每个测试区包括(1)一片透明微孔滤膜；(2)一层细胞外基质置于滤膜与载物片之间；(3)一层细胞外基质覆盖于滤膜表面；(4)胶粘物将滤膜周缘与载物片粘连密封；胶粘物在测试区周缘形成一条脊状突起。
本实用新型解决其技术问题所采取的技术方案是提供一种简单装置，该装置主要包括一透明载物片，上有一个或多个测试区。每个测试区上有一片微孔滤膜，微孔滤膜与载物片之间充含一层细胞外基质，微孔滤膜表面覆盖一层细胞外基质，微孔滤膜周缘用胶粘物粘在载物片上。由于微孔滤膜上下二层细胞外基质，一般细胞不能从微孔滤膜表面穿过微孔进入到微孔滤膜下面。瘤细胞必须(1)消化吸收微孔滤膜表面细胞外基质，(2)穿过滤膜微孔，(3)消化吸收微孔滤膜下面细胞外基质，(4)移入微孔滤膜与载物片之间细胞外基质层内。此步骤类似体内恶性肿瘤转移中瘤细胞侵润基底膜的过程。
本实验装置与其他现有定量检测装置不同，本装置中瘤细胞在没有化学趋向因子存在的条件下穿过微孔进入微孔滤膜与载物片之间的细胞外基质层。未侵入微孔滤膜下方的瘤细胞在实验过程中被除去。
应用本装置进行瘤细胞检测的形式有多种。其一是将分散的瘤细胞与半固体的培养液形成“肿瘤块”放置于载物片上测试区，其二是将临床切除的肿瘤碎块放置于测试区检测其细胞侵润能力，还可将单细胞悬液置于载物片上测试区进行检测。
应用本装置检测瘤细胞侵润能力时，实验操作均在同一载物片上进行，实验过程中侵入微孔滤膜下方的瘤细胞均局限于滤膜于载物片之间的细胞外基质层内，其优点为(1)在细胞固定，染色等操作过程中侵入滤膜下方的瘤细胞不会丢失；(2)瘤细胞计数及定量分析更为准确；(3)侵入微孔滤膜下方的瘤细胞均局限于微孔滤膜于载物片之间的平面，利于实验进行中显微镜下观察细胞侵润过程；(4)操作步骤简单，容易掌握。
以下结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。
图1是本装置基本结构的透视图，在载物片上有多个测试区。
图2是图1中一个测试区放大的断面图。
图3是本装置一个测试区包括附加结构---指环状圆筒的断面图。
具体实施方式
图1中载物片(10)为普通显微镜用载玻片，其一侧磨砂区(24)用于写标记。每一测试区(20)包括一圆形微孔滤膜(12)，微孔滤膜周缘以胶粘物(14)粘于载物片(10)上。图2中载物片(10)与微孔滤膜(12)之间有一层细胞外基质(30)，微孔滤膜(12)表面覆盖一层细胞外基质(16)。胶粘物(14)在测试区周缘形成一条脊状突起，其表面涂有一层斥水性物质(18)。图3中的测试区其中载物片(10)，圆形微孔滤膜(12)，二层细胞外基质(16)，(30)与图2中相同。其区别在于图3中胶粘物(14)所形成脊状突起表面粘着一指环状圆筒(24)，但是未涂斥水性物质。
本装置中载物片可用光学玻璃或透明塑料制作，或用普通显微镜用载玻片。要求透明，以便于实验过程中显微镜下观察细胞移动及细胞侵润现象。微孔滤膜要求表面光滑，与常用细胞染料无着色，不影响生物细胞生长和移动。微孔的孔径根据细胞大小选择5-12微米之间。滤膜材料可用聚碳类，纤维素，聚脂类。一般用带有8微米孔径的聚碳膜。胶粘物为斥水性物质，可用树脂。胶粘物所形成的脊状突起高度在50-500微米之间。图2中胶粘物表面斥水性物质可用蜡，其目的在于防止测试区的液体外溢。图3中指环状圆筒下缘应光滑平整，与测试区边缘水密性粘和，以便置入细胞培养液。指环状圆筒下缘与测试区边缘的粘合力应小于微孔滤膜周缘与载物片之间的粘合力，以便必要时可将指环状圆筒与测试区分离，而不影响微孔滤膜与载物片的粘合。指环状圆筒可用塑料，硅橡胶等对细胞无毒性的材料制作，其筒壁高度5-10毫米。
本装置中微孔滤膜与载物片之间的距离应根据所研究的瘤细胞决定，一般不超过一个细胞的直径，为5-50微米。即相当于水化后的细胞外基质膜层的厚度。为使微孔滤膜与载物片之间距离均匀一致，可实施下述技术方法。其一是先在载物片上测试区置入均匀厚度的细胞外基质层，然后再将微孔滤膜周缘与载物片粘合。其二是在微孔滤膜周缘与载物片之间放置一个相应厚度的薄垫圈后进行粘合。其三是将每个测试区机械切削出相应厚度的凹陷再将微孔滤膜周缘与载物片粘合。也可直接制作各测试区具有相应厚度的凹陷的载物片。
细胞外基质可用提取的粘膜下基质，或自EHS肉瘤鼠提取的细胞外基质(Matrigel)。由于细胞外基质在4℃时呈液体状，在37℃时凝结成胶状，所以在使用细胞外基质充填载物片和微孔滤膜之间及覆盖微孔滤膜时应在4℃下进行。将细胞外基质用蒸馏水稀释至一定浓度，然后置入微孔滤膜周缘与载物片之间，形成细胞外基质层。将已稀释的细胞外基质直接涂在微孔滤膜表面，所形成的细胞外基质层水化后的厚度一般为5-50微米。涉及细胞外基质的操作应在无菌条件下进行。在操作后可于无菌操作台内自然风干干燥。在使用前须预先将细胞外基质层水化。
实施例一此实施例可用于检测生物活性因子对瘤细胞侵润性质的影响。其操作过程如下在无菌条件下，预先在图2所示本装置的测试区上加蒸馏水使细胞外基质层水化。先将培养的瘤细胞制备成单细胞悬液，再加入一定浓度琼脂。将此瘤细胞悬液加到测试区。琼脂逐渐冷却形成半固体的“瘤细胞块”。由此造成利于瘤细胞的生长环境。分别将不同浓度的生物活性因子添加到各个测试区。将本装置放入37℃孵箱进行细胞培养12小时以上。从37℃孵箱取出本装置，以福尔马林液固定细胞，磷酸缓冲液清洗后进行细胞染色。然后用棉签仔细拭去微孔滤膜表面细胞及琼脂，残留在微孔滤膜与载物片之间的细胞即为已侵润的瘤细胞。可用普通显微镜进行计数及分析。
实施例二此实施例可用于检测抗肿瘤药物对肿瘤细胞侵润性质的影响。其操作过程如下在无菌条件下，预先在图2所示本装置的测试区上加蒸馏水使细胞外基质层水化。将外科手术切除的肿瘤剪碎成为小碎块，将数个肿瘤小碎块加到测试区，再将一定浓度琼脂覆盖于测试区，琼脂逐渐冷却形成半固体状。分别将不同的抗肿瘤药物添加到各个测试区琼脂表面。将本装置放入37℃孵箱进行细胞培养12小时以上。从37℃孵箱取出本装置，以福尔马林液固定细胞，磷酸缓冲液清洗后进行细胞染色。然后用棉签仔细拭去微孔滤膜表面细胞及琼脂，残留在微孔滤膜与载物片之间的细胞即为已侵润的瘤细胞。可用普通显微镜进行计数及分析。
实施例三此实施例可用于检测生物活性因子或抗肿瘤药物对肿瘤细胞侵润性质的影响。其操作过程如下在无菌条件下，预先在图3所示本装置的测试区上加蒸馏水使细胞外基质层水化。将培养的瘤细胞制备成单细胞悬液，将此瘤细胞悬液加到测试区，并加入适量细胞培养液。将本装置放入37℃孵箱进行细胞培养6小时以上。从37℃孵箱取出本装置，吸去细胞培养液，以福尔马林液固定细胞，磷酸缓冲液清洗后进行细胞染色。然后将指环状圆筒自测试区分离。用棉签仔细拭去微孔滤膜表面细胞及琼脂，残留在微孔滤膜与载物片之间的细胞即为已侵润的瘤细胞。可用普通显微镜进行计数及分析。
权利要求1.用于瘤细胞侵润性测量的装置，其特征是该装置包括一透明载物片，该载物片包括一个或一个以上测试区，每个测试区包括(1)一片透明微孔滤膜；(2)一层细胞外基质置于滤膜与载物片之间；(3)一层细胞外基质覆盖于滤膜表面；(4)胶粘物将滤膜周缘与载物片粘连密封；胶粘物在测试区周缘形成一条脊状突起。
2.根据权利要求1所述的用于瘤细胞侵润性测量的装置，其特征是所述透明载物片采用显微镜载物片。
3.根据权利要求1所述的用于瘤细胞侵润性测量的装置，其特征是所述微孔滤膜具亲水性，可用聚碳膜制作。
4.根据权利要求1所述的用于瘤细胞侵润性测量的装置，其特征是所述微孔滤膜的孔径在2-12微米之间。
5.根据权利要求1所述的用于瘤细胞侵润性测量的装置，其特征是所述微孔滤膜的孔径为8微米。
6.根据权利要求1所述的用于瘤细胞侵润性测量的装置，其特征是所述的胶粘物具疏水性，可采用树脂。
7.根据权利要求1所述的用于瘤细胞侵润性测量的装置，其特征是胶粘物表面涂有一层斥水性物质。
8.根据权利要求1所述的用于瘤细胞侵润性测量的装置，其特征是在胶粘物所形成的脊状突起的表面粘着一指环状圆筒，其筒壁高度为5-10毫米。
专利摘要一个测试肿瘤细胞侵润特性的装置。该装置系一载物片上有一个或多个测试区。每个测试区包括一微孔滤膜，微孔滤膜与载物片之间有一层细胞外基质，微孔滤膜表面有一层细胞外基质。在该装置上可直接作瘤细胞培养，染色并进行瘤细胞侵润性分析。
文档编号G01N21/84GK2731444SQ20042007794
公开日2005年10月5日 申请日期2004年7月20日 优先权日2004年7月20日
发明者韩可都, 韩可汉 申请人:韩可都, 韩可汉