用于改进对表达cd138的肿瘤细胞的靶向的方法和试剂的制作方法

专利名称：用于改进对表达cd138的肿瘤细胞的靶向的方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抵抗抗原CD138的免疫缀合物和包含所述免疫缀合物的组合物在减 少基质细胞粘着至表达⑶138的靶细胞上的应用，从而更有效地治疗涉及表达⑶138的细 胞的疾病状态。
背景技术：
作为细胞外基质的受体的⑶138在多发性骨髓瘤(MM)细胞上过表达，并且已经表 现出影响MM细胞发育和/或增殖。举例而言，CD138还在卵巢癌、肾癌、胆囊癌、乳腺癌、前列 腺癌、肺癌、结肠癌细胞和霍奇金氏淋巴瘤与非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病(CLL) 等的细胞上表达。在此用于说明本发明，特别是提供关于实施的额外详细说明的出版物和包括专利 等的其它材料，均通过参考并入。方便起见，所述出版物在下文中按照作者和日期引用，和 /或按照所附目录中的作者依照字母顺序列出。Tassone等(2004)已经报道了鼠IgGl抗体B-B4对在MM细胞表面上表达的 ⑶138抗原的良好结合。Tassone还报道了包含类美登素(maytansinoid)DMl作为效应分 子的免疫缀合物B-B4-DM1对多发性骨髓瘤细胞的高细胞毒性活性(还参见美国专利公开 20070183971)。Tassone还指出其B-B4缀合物即使在骨髓微环境中也有效，所述骨髓微环境诱导 多发性骨髓瘤(MM)细胞对通常施用至MM患者的许多药物(包括例如地塞米松)产生抗性。 Tassone的免疫缀合物能够有效地破坏骨髓基质环境中的MM肿瘤细胞。尽管Tassone等已经为提供MM的有效治疗和可以在此类治疗中使用的物质的组 成作为贡献，但本领域仍然存在许多需要。仍然存在对改进使用基于B-B4的免疫缀合物的治疗的需要。还存在对使用显示 一种或多种有利性质的基于B-B4的免疫缀合物的有效治疗的需要。免疫缀合物的性质优 选包括改进的抗原结合、改进的肿瘤细胞(特别是表达CD138的肿瘤细胞以及其附属细胞) 杀伤或对靶标更均勻的结合，但特别是更有效地抗击与表达CD138的细胞有关的疾病状态 的能力。

发明内容
本发明涉及一种用于减少有需要的受试对象的肿瘤细胞中基质细胞粘着至表达 CD138的肿瘤细胞的方法，所述方法包括
以对于减少基质细胞粘着至表达CD138的肿瘤细胞而言有效的量对所述肿瘤细 胞施用靶向所述表达CD138的肿瘤细胞(特别是含有如本文所公开的可切割连接子和效应 子的表达CD138的肿瘤细胞)的免疫缀合物，以及可选地以抑制、延缓和/或预防肿瘤细胞 生长的量对所述肿瘤细胞施用其它细胞毒性剂。所述粘着可以减少至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约 70%、约80%以上，和/或可以导致对粘着介导的药物抗性的缓解，所述抗性包括粘着介导 的抵抗其它细胞毒性剂(其不是上述免疫缀合物中的一种)的药物抗性，并且其中以抑制、 延缓和/或预防肿瘤细胞生长的量施用所述其它细胞毒性剂。可以依次地施用所述免疫缀 合物和该细胞毒性剂，其中所述细胞毒性剂可以在施用所述免疫缀合物之后施用，或可以 同时施用。本发明的免疫缀合物特别地包含(a)基因工程靶向抗体，和(b)效应分子，其中所述免疫缀合物均勻地靶向表达⑶138的靶细胞。本发明的基因工程靶向抗体可以⑴基本上由非人类抗体的抗CD138抗原结合区构成，或(ii)包含抗CD138抗原结合区(ABR)，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体。
所述ABR可以分别包含(a)包含SEQ ID NO 1的氨基酸残基99 111的重链可变区⑶R3禾口(b)包含SEQ ID NO 2的氨基酸残基89 97的轻链可变区CDR3。所述ABR还可以分别包含(a)包含SEQ ID NO 1的氨基酸残基31 35和51 68的重链可变区⑶Rl和 CDR2，和/或(b)包含SEQ ID NO 2的氨基酸残基24 34和50 56的轻链可变区⑶Rl和 CDR2。所述另外的抗体区可以分别包含(a) SEQ ID NO 1的氨基酸残基123 448，和/或(b) SEQ ID NO 2 的氨基酸残基 108 214，以及其突变体，所述突变体 (i)维持或降低所述基因工程靶向抗体的抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性 细胞毒性，和/或(ii)稳定所述基因工程靶向抗体。效应分子可以经由连接子连接至所述基因工程靶向抗体。所述连接子可以包含二 硫键。效应分子(例如DM4)可以在靶向抗体和该效应分子之间提供空间位阻。效应分子 可以为至少一种类美登素(maytansinoid)(例如DM1、DM3或DM4)、紫杉烷或CC1065，或其 类似物。所述免疫缀合物可以结合CD138，靶向变异(targeting variation)小于150%、 140%、130%、120%、110%、100%、90%、80%、70%、60%或 50%。
本发明还涉及一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含靶向⑶138的靶向剂，所述靶向剂包含分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性。所述免疫球蛋白 重链或其一部分的恒定区可以为IgG4同型的恒定区。本发明还涉及一种治疗受试对象中的MM的方法，所述方法包括提供一种或多种本文指定的免疫缀合物，和以对治疗多发性骨髓瘤而言有效的量对所述受试对象施用所述免疫缀合物。所述免疫缀合物的靶向剂可以包含与SEQ ID NO :2具有至少约70%序列同一性 的轻链序列。所述免疫缀合物的靶向剂还可以包含与SEQ IDNO :1具有至少约70%序列同 一性的重链序列。本发明还涉及一种用于免疫缀合物介导的药物输送的方法，所述方法包括提供一种或多种本文指定的免疫缀合物，和以治疗有效量施用所述免疫缀合物，其中所述IgG4同型缓解ADCC、补体依赖性细 胞毒性和/或Fc-介导的肝FcR的靶向。本发明还涉及一种抑制、延缓和/或预防细胞培养物中的肿瘤细胞生长的方法， 所述方法包括以抑制、延缓和/或预防肿瘤细胞生长有效的量对所述细胞培养物施用一种或多 种本文指定的一种或多种免疫缀合物。所述有效的量可以诱导表达CD138的肿瘤细胞和可 选的不表达CD138的辅助细胞(特别是肿瘤基质细胞)中的细胞死亡或连续细胞周期的停 滞。所述细胞培养物中的细胞可以获自癌症患者，并且在施用所述有效量的所述免疫缀合 物后，可以将所述细胞培养物的细胞再植入所述癌症患者。本发明还涉及一种用于在有需要的患者中抑制、延缓和/或预防包含⑶138肿瘤 细胞的肿瘤生长和/或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的方法，所述方法包括以抑制或降低所述肿瘤生长和/或所述肿瘤细胞扩散的量，对所述患者施用至少 一种或多种上述免疫缀合物，其中所述免疫缀合物抑制、延缓或预防所述肿瘤细胞的生长和/或扩散。所述免疫缀合物的效应分子可以为毒素、细胞毒性酶、低分子量细胞毒性药物、成 孔剂、生物响应修饰剂、前药激活酶、抗体、细胞因子或放射性核素。可以以5mg/m2 约300mg/m2的单次剂量可选地以每小时、每天、每周或其组合施 用本发明的免疫缀合物。包括每小时、每天和每周方案等的多剂量方案为本发明的一部分，并且特别包括 间隔为5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、 15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3
天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周的施用。本发明还涉及一种用于在有需要的患者中抑制、延缓和/或预防肿瘤的生长和/ 或恶性肿瘤细胞的扩散的方法，所述方法包括(a)以对于降低肿瘤负荷而言有效的量对所述患者施用一种或多种细胞毒性剂和 /或放射；和
(b)以对于抑制、延缓或预防肿瘤的生长和/或肿瘤细胞的扩散而言有效的量，对 所述患者施用至少一种本文指定的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物抑制、延缓或预防包含表达CD138的细胞的肿瘤细胞的生长 和/或扩散。特别地，本发明任何实施方式的细胞毒性剂可以为美法仑(mephalan)、长春新 碱(vincristine)、多柔比星(doxorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、环磷酰胺、足 叶乙甙(etoposide)、阿糖胞苷(cytarabine)、顺钼、沙利度胺(thalidomide)、泼尼松 (prednisone)、沙利度胺、硼替佐米(bortezomib)、来那度胺(Ienalidomide)、索拉非尼 (sorafenib)、罗明待辛(romicbpsin)或其组合，或可以为基于抗体的细胞毒性剂。本发明还涉及一种用于治疗患有会从抑制骨髓瘤细胞存活受益的疾病的受试对 象的方法，所述方法包括(a)提供至少一种本文指定的任何免疫缀合物，和(b)对所述受试对象施用所述免疫缀合物，从而选择性地降低所述受试对象的骨 髓瘤细胞的存活或生长。本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含用于抑制、延缓和/或预防 肿瘤的生长和/或肿瘤细胞的扩散的本文指定的任何免疫缀合物，以及一种或多种药物可 接受赋形剂。所述药物组合物可以包含本文所指定的细胞毒性剂。本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒在分开的容器中包含组合使用以抑制、延 缓和/或预防肿瘤的生长和/或肿瘤细胞的扩散的药物组合物，其中一个容器包含有效量 的上述药物组合物，和其中另一容器包含含有有效量的用于抑制、延缓和/或预防肿瘤的 生长和/或肿瘤细胞的扩散的试剂(优选细胞毒性剂)的第二药物组合物，以及一种或多 种药物可接受赋形剂。本发明还涉及一种用于在有需要的受试对象中抑制、延缓和/或预防包含CD138 肿瘤细胞的肿瘤生长和/或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的方法，所述方法包括(a)提供免疫缀合物，所述免疫缀合物包含经由可切割连接子连接至效应分子的抗⑶138的基因工程靶向抗体，其中所述效 应分子是空间位阻性的，和(b)以抑制、延缓和/或预防所述肿瘤的生长和/或所述肿瘤细胞的扩散的量，对 所述受试对象施用所述(a)的免疫缀合物，其中所述(a)的免疫缀合物提供的肿瘤生长抑 制活性比其无位阻对应物(counterpart)的活性高出约10%、约20%、约30%、约40%以上。包含非可切割连接子的无位阻对应物的肿瘤生长抑制活性可以高于其包含可切 割连接子的无位阻对应物的肿瘤生长抑制活性，例如可以高出至少约5%、至少约10%、至 多约15%。所述抗CD138的基因工程靶向抗体可以基本上由非人类抗体的抗CD138抗原结合 区构成，或可以包含非人类抗体的抗CD138抗原结合区和另外的抗体区，其中所述另外的 抗体区的至少一部分出自人类抗体。所述可切割连接子可以包含二硫键。所述效应分子可以为DM4。所述免疫缀合物可以是药物组合物的一部分，并且可以以至少一次量为约5mg/m2 约300mg/m2的剂量施用 至所述受试对象。本发明提供一种用作药物的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含(a)基因工程靶向抗体，所述基因工程靶向抗体(i)基本上由非人类抗体的抗CD138抗原结合区构成，或(ii)包含抗CD138抗原结合区，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体，以及(b)效应分子其中所述免疫缀合物均勻地结合至⑶138。本发明提供另一种用作药物的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含靶向⑶138的靶向剂，所述靶向剂包含分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性。特别地，在本发明的一个方面，将上述段落的免疫缀合物用于治疗多发性骨髓瘤。 特别地，所述免疫缀合物能够用于制造多发性骨髓瘤治疗用药物。本发明还提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物用于将免疫缀合物介导的药物 输送至患者，特别是用于缓解ADCC、补体依赖性细胞毒性和/或Fc-介导的肝FcR靶向， 其中所述免疫缀合物包含靶向CD138的靶向剂，所述靶向剂包含分离的多肽，所述多肽包 含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白重链或其一部分与SEQ IDNO 1具有至少70%序列同一性，并且所述免疫球蛋白重链或其一部分的恒定区为IgG4 同型的恒定区。本发明还提供用于治疗患者中癌症的肿瘤细胞，其中所述肿瘤细胞已经在细胞培 养中用免疫缀合物处理，所述免疫缀合物包含(a)基因工程靶向抗体，所述基因工程靶向抗体(i)基本上由非人类抗体的抗CD138抗原结合区构成，或(ii)包含抗CD138抗原结合区，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体，以及(b)效应分子其中所述免疫缀合物均勻地结合至⑶138。本发明还提供用于治疗患者中癌症的肿瘤细胞，其中所述肿瘤细胞已经在细胞培 养中用免疫缀合物处理，所述免疫缀合物包含靶向⑶138的靶向剂，所述靶向剂包含分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性。本发明提供一种用于在患者中抑制、延缓和/或预防包含⑶138肿瘤细胞的肿瘤 生长和/或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含(a)基因工程靶向抗体，所述基因工程靶向抗体(i)基本上由非人类抗体的抗CD138抗原结合区构成，或(ii)包含抗CD138抗原结合区，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和
另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体，以及(b)效应分子其中所述免疫缀合物均勻地结合至⑶138。作为另一种选择，本发明提供在患者中抑制、延缓和/或预防包含⑶138肿瘤细胞 的肿瘤生长和/或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含靶向⑶138的靶向剂，所述靶向剂包含分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性。此外，本发明提供一种药物，所述药物包含免疫缀合物和一种或多种癌症药物作 为组合制剂，以用于同时、分开或依次地用于治疗包含表达CD138的细胞的肿瘤细胞，其中 所述免疫缀合物包含(a)基因工程靶向抗体，所述基因工程靶向抗体(i)基本上由非人类抗体的抗CD138抗原结合区构成，或(ii)包含抗CD138抗原结合区，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体，以及(b)效应分子其中所述免疫缀合物均勻地结合至⑶138，并且其中所述一种或多种癌症药物能够降低肿瘤负荷。作为另一种选择，本发明提供一种药物，所述药物包含免疫缀合物和一种或多种 癌症药物作为组合制剂，以用于同时、分开或依次地用于治疗包含表达CD138的细胞的肿 瘤细胞，其中所述免疫缀合物包含靶向⑶138的靶向剂，所述靶向剂包含分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性，并且其中所述一种或多种癌症药物能够降低肿瘤负荷。在上两段应用的另一方面，将所述组合制剂施用至已经采用放射治疗的患者。在一个替代性方面，本发明提供免疫缀合物在制备用于治疗包含表达CD138的细 胞的患者中的肿瘤细胞的药物中的应用，所述免疫缀合物包含(a)基因工程靶向抗体，所述基因工程靶向抗体(i)基本上由非人类抗体的抗CD138抗原结合区构成，或(ii)包含抗CD138抗原结合区，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体，以及(b)效应分子其中所述免疫缀合物均勻地结合至⑶138。以及其中将所述药物施用至已用放射治疗的患者，以降低肿瘤负荷。此外，本发明提供免疫缀合物在制备用于治疗包含表达CD138的细胞的患者中的 肿瘤细胞的药物中的应用，所述免疫缀合物包含靶向⑶138的靶向剂，所述靶向剂包含分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白重链或其一部分与SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性，以及其中将所述药物施用至已用放射治疗的患者，以降低肿瘤负荷。在上述段落中，所述药物能够抑制、延缓和/或预防患者中肿瘤的生长和/或恶性 肿瘤细胞的扩散。此外，本发明还提供一种用于抑制个体中骨髓瘤细胞存活的免疫缀合物，其中所 述免疫缀合物包含(a)基因工程靶向抗体，所述基因工程靶向抗体(i)基本上由非人类抗体的抗CD138抗原结合区构成，或(ii)包含抗CD138抗原结合区，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体，以及(b)效应分子其中所述免疫缀合物均勻地结合至⑶138。此外，本发明提供一种用于抑制个体中骨髓瘤细胞存活的免疫缀合物，其中所述 免疫缀合物包含靶向⑶138的靶向剂，所述靶向剂包含分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性。特别地，在上两段中所述免疫缀合物能够选择性地降低个体中所述骨髓瘤细胞的 存活或生长。此外，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物用于在个体中抑制、延缓和/ 或预防包含CD138肿瘤细胞的肿瘤的生长和/或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散，其中所述免 疫缀合物包含经由可切割连接子连接至效应分子的抗⑶138基因工程靶向抗体，其中所述 效应分子为空间位阻性的。特别地，在上段中，所述免疫缀合物能够提供的抑制肿瘤生长的活性比其无位阻 对应物活性高出约10 %、约20 %、约30 %、约40 %以上。本发明还提供一种CD138靶向剂，所述CD138靶向剂用于减少受试对象的肿瘤细 胞中的基质细胞粘着至表达CD138的肿瘤细胞的方法。本发明还提供一种药物，所述药物包含CD138靶向剂和其它试剂(例如靶向免疫 缀合物或细胞生长抑制剂)作为组合制剂以用于同时(共施用)、分开或依次地用于减少受 试对象的肿瘤细胞中的基质细胞粘着至表达CD138的肿瘤细胞的方法。特别地，在上段中，所述组合制剂能够抑制、延缓和/或预防受试对象中肿瘤细胞 的生长。


图1提供连接有效应分子的nBT062的示意图。图2为BT062的化学示意图。图3显示安丝菌素P-3向美登醇(maytansinol)的转换(简化起见省略立体化 学)。图4显示DM4的代表性合成图。
图5为抗体缀合(nBT062至DM4)的示意图。图 6 显示对 nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DMl、nBT062-SMCC-DMl 和 nBT062 抗体 与0PM-2细胞的结合的分析。将不同浓度的ΠΒΤ062和缀合物给予所述细胞，并通过FACS 分析测定平均荧光。图 7 (A)-(D)描述 nBT062-DMx 缀合物对 M0LP-8(CD138+)和 BJAB (CD138-)细胞的 体外细胞毒性。在平底板中培养所述细胞，并且与指定浓度的免疫缀合物一起温育5天。加 入WST试剂，过3个小时估算细胞活力。在(D)中，在存在或不存在阻断抗体(ΙμΜ ηΒΤ062) 时分析nBT062-SPDB-DM4的细胞毒性活性。图8显示用㈧PBS、⑶ΠΒΤ062抗体、(C)游离DM4或⑶非靶向缀合物 huC242-DM4处理的个体小鼠，在用M0LP-8肿瘤细胞接种后随时间(天)的肿瘤体积。图 9 显示用(A)PBS, (B) nBT062-SPDB_DM4、(C) B-B4-SPP-DM1 或(D) nBT062-SPP-DMl处理的个体小鼠在用M0LP-8肿瘤细胞接种后随时间(天)推移的肿瘤体积。图10描述CB. 17SCID小鼠中M0LP-8人类多发性骨髓瘤异种移植物在接种后随时 间(天)推移的平均肿瘤体积(+/-SD)。图IlA和B显示在SCID小鼠的大体积(bulky)M0LP_8肿瘤模型中，nBT062_DMx针 对CD138+M0LP-8肿瘤细胞的抗肿瘤活性。对于各组，肿瘤体积以平均值(+/-SD)给出。图12为反映在人类骨髓的环境中的SCIDhu/INA-6模型中含有DMx缀合物的 ΠΒΤ062对多发性骨髓瘤细胞的抗肿瘤效力的图。将由多发性骨髓瘤细胞产生的可溶性 人类IL-6受体(shuIL-6R)用作肿瘤负荷的指示物。三角形nBT062-SPP_DMl，正方形 nBT062-SPDB-DM4 ；菱形运载剂对照。图13显示体外nBT062-SPDB-DM4介导的旁观者杀伤(bystander killing)。将 CD138阳性0PM2细胞和CD138阴性Namawla细胞与不同浓度的nBT062-SPDB_DM4 —起培
养，并测定细胞活力。OD45tl值代表细胞活力的测定值。图14在(A)中显示通过不同MM细胞的⑶138表达，在(B)中显示D0X40细胞(上 图)和OPMl细胞(下图)的显微分析。⑶138显示在右侧，核酸显示在左侧。图 15 (A)描述 40 小时、80 小时和 120 小时后 nBT062-SMCC-DMl、nBT062-SPDB-DM4 和nBT062-SPP-DMl对MM细胞的细胞毒性。图15(B)描述从三个不同的患者分离的MM 细胞用nBT062-SPDB-DM4处理2天后的细胞活力。图15(C)显示在确定细胞活力前与 nBT062-SPDB-DM4 一起培养72h的源自3个健康受试对象的外周血单核细胞(PBMC)。图16(A)显示其中OPMl细胞已经用免疫缀合物处理0h、12h或24h的细胞周期 分析，并通过PI染色分析细胞周期曲线。图16(B)中，在存在或不存在免疫缀合物时培养 OPMl细胞24h、48h或72h。通过Apo 2. 7抗体染色和流式细胞仪分析估算凋亡细胞百分比。 图16 (C)中，在存在885μ g/ml nBT062-SPDB_DM4时培养OPMl细胞指定的时间(左图)，或 用不同浓度的免疫缀合物(中图)培养OPMl细胞。泛半胱天冬酶(pan-caspase)抑制剂 zVAD-fmk阻断的nBT062-SPDB-DM4诱导半胱天冬酶_8、_9和-3以及聚(ADP-核糖)聚合 酶(PARP)在OPMl细胞中的切割(右图)。图17在(A) (C)中显示IL-6、IGF-I和BMSC对匪细胞生长和匪细胞对免疫 缀合物的敏感性的影响。图17(D)显示使用地塞米松代替免疫缀合物的实验。图17(E)显示在存在或不存在免疫缀合物时，采用肿瘤细胞和BMSC共培养物的细胞粘着实验结果。图18㈧描述对通过OPMlepp细胞的GFP表达的分析。图18⑶显示在用 5X IO6OPMIgfp 细胞注射的 SCID 组中，nBT062-SPDB_DM4、nBT062-SPP-DMl 或缓冲液对 照对肿瘤尺寸的影响。图18(C)中与仅用运载剂处理的对照组(实线；正常盐水，η = 5)相比，nBT062-SPDB-DM4显著地增加存活(P < 0. 0023，虚线，η = 5)。图18(D)证明 nBT062-SPDB-DM4诱导体内凋亡。
具体实施例方式本发明涉及一种包含CD138靶向剂的免疫缀合物，和所述免疫缀合物的效应分子 向靶点的输送，以及所述效应分子在靶细胞、组织和器官中、其上或其附近的位点特异性释 放。可以通过在靶点处从免疫缀合物的靶向剂部分切割/分离而激活所述效应分子。本发 明特别涉及这些免疫缀合物在抗击体内肿瘤生长中的应用，和这些免疫缀合物克服或减少 在骨髓微环境中遭遇的保护性机制的能力的应用。可以对需要治疗性治疗的受试对象或分离自需要治疗性治疗的此类受试对象的 细胞施用本发明的免疫缀合物。可以通过在靶细胞、组织或器官中、其上或其附近切割/分 离而从所述免疫缀合物释放效应分子。在一实例中，对患有癌症的患者施用所述免疫缀合物，所述免疫缀合物包含靶向 表达⑶138的细胞的抗体ΠΒΤ062，以及至少一种作为效应分子的高细胞毒性药物或毒素。 在该实例中，对患者静脉内施用治疗有效量的免疫缀合物，以使所述免疫缀合物在癌细胞 中富集。然后通过自然手段使所述效应分子从所述抗体释放。在切割之后或期间，可以通过 烷基化稳定所述效应分子，并且使所述效应分子扩散到周围的不表达CD138的辅助细胞， 例如基质细胞。在第二实例中，对患有癌症的患者施用所述免疫缀合物，所述免疫缀合物包含靶 向表达CD138的细胞的抗体ΠΒΤ062，和作为效应分子的至少一种高细胞毒性药物或毒素， 以及另外的细胞毒性剂。在该实例中，依次施用治疗有效量的免疫缀合物和细胞毒性剂。首 先对患者静脉内施用所述免疫缀合物，以使所述免疫缀合物在骨髓微环境中的癌细胞中富 集。所述免疫缀合物基本上克服了细胞粘着介导的药物抗性(CAM-DR)，并且破坏了骨髓微 环境中相当大部分的表达CD138的肿瘤细胞。特别地，所述效应分子通过天然手段从所述 抗体释放并且破坏肿瘤细胞。所述免疫缀合物至少部分地避免肿瘤细胞粘着至基质细胞， 某些所述基质细胞可能被扩散的效应分子破坏。12小时的时间间隔后，施用所述细胞毒性 剂。细胞毒性剂(其活性通常被CAM-DR至少降低)能够作用于不与基质细胞相粘连的肿 瘤细胞上并且破坏逃过免疫缀合物作用的表达CD138的肿瘤细胞。CD138 或粘结蛋白聚糖-l(syndecan-l)(也称 SYNDl ；SYNDECAN ；SDC ；SCDl ；CD138 抗原，SwissProt登录号P18827人类)为一种膜糖蛋白，最初记载其存在于源自上皮的细 胞上，随后发现于造血细胞上(Sanderson，1989)。⑶138具有长的细胞外结构域，该细胞外 结构域与可溶性分子(例如生长因子EGF、FGF、HGF)和不溶性分子(例如细胞外基质成分 胶原蛋白和纤连蛋白)通过硫酸乙酰肝素链结合(Langford，1998 ；Yang，2007)，并且充当 细胞外基质的受体。CD138还通过由粘附细胞表达的肝素结合分子介导细胞与细胞的粘着。 已经显示⑶138起骨髓瘤细胞的生长因子的共受体的作用(Bisping，2006)。血浆细胞分化的研究表明，CD138也必须被视为一种分化抗原(Bataille，2006)。在恶性造血中，⑶138在大多数的以下细胞上高度表达MM细胞、卵巢癌、肾癌、胆 囊癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌细胞和霍奇金氏淋巴瘤与非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋 巴性白血病(CLL) (Horvathova，1995)、急性淋巴性白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML) (Seftalioglu, 2003 (a) ；Seftalioglu, 2003 (b))、实体组织肉瘤、结肠癌以及表达 CD138 的 其它恶性血液病和实体肿瘤的细胞(Carbone等，1999 ；Sebestyen等，1999 ；Han等，2004 ； Charnaux 等，2004 ；0，Connell 等，2004 ；Oroszh 和 Kopper，2001)。已经对⑶138表达显示为阳性的其它癌症为多种卵巢腺癌、膀胱移行细胞癌、肾 透明细胞癌、肺鳞状细胞癌、乳腺癌和子宫癌(参见，例如，Davies等，2004 ；Barbareschi 等，2003 ；Mennerich 等，2004 ； Anttonen 等，2001 ；Wijdenes, 2002)。在正常人类造血腔中，CD138表达局限于血浆细胞(WijdeneS，1996 ;Chilosi， 1999)，并且⑶138不在外周血淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和红细胞上表达。特别地，⑶34+ 干细胞和祖细胞(progenitor cell)不表达⑶138，并且抗⑶138mAb不影响造血干细胞培 养物中集落形成单位的数量(Wijdenes，1996)。在非造血腔中，⑶138主要在肺、肝、皮肤、 肾和肠内的单层上皮和复层上皮上表达。在内皮细胞上仅看到弱的染色(Bernfield，1992 ； Vooijs，1996)。据报道，CD138以多态性形式存在于人类淋巴瘤细胞中(Gattei，1999)。已经报道单克隆抗体 B-B4、BC/B-B4、B-B2、DL-101、1D4、MI15、1. BB. 210、2Q1484、 5卩7、104-9、281-2，特别是8-84对0)138有特异性。其中B-B4、1D4和MI15既识别CD138 的完整分子也识别其核心蛋白，并且据显示识别相同或密切相关的表位(Gattei，1999)。此 前的研究报道，B-B4不识别可溶性CD138，但仅识别膜结合形式的CD138 (Wi jdenes，2002)。B-B4，一种鼠IgGlmAb，与人类粘结蛋白聚糖-1(⑶138)上的核心蛋白的90 95 位残基之间的线性表位结合(Wi jdenes，1996 ；Dore, 1998)。与CD138的表达模式一致，据显 示B-B4与血浆细胞系RPMI8226强烈地反应，但不与内皮细胞反应。同样与⑶138的表达模 式一致，B-B4还与上皮细胞系A431(源自角质形成细胞源)和H印G2(源自肝细胞)反应。 免疫毒素B-B4-皂草素对血浆细胞系RPMI8226也是高度毒性的，事实上比游离皂草素的毒 性明显更强。然而，从两个受测的上皮细胞系看出，B-B4-皂草素仅对细胞系A431显示毒 性，但在集落形成测试中皂草素对A431细胞的生长晕未显示出抑制作用(Vooi js，1996)。 其它研究者报道了 MM相关抗原抗肿瘤缺少特异性(Couturier，1999)。在本发明的背景下，抗体/免疫缀合物“基本上由特定成分组成”是指抗体/免疫 缀合物由指定的成分和任何不会在实质上影响所述抗体的基本特性的其它材料或成分组 成。本发明使用术语“肿瘤细胞”来包括癌细胞以及可能形成或可能不形成实体肿瘤 的部分的癌前细胞。本发明的“靶向剂”能够与由靶细胞表达的分子相连，并且包括肽和非肽类。特别 地，本发明的靶向剂包括靶向抗体和非免疫球蛋白靶向分子，所述非免疫球蛋白靶向分子 可以基于包括但不限于AFFILIN 分子、ANTICALINS⑧和AFFIB0DIES 的非免疫球蛋白蛋 白。非免疫球蛋白靶向分子还包括非肽靶向分子(例如靶向DNA和RNA寡核苷酸(适体))， 以及生理学配体，特别是所关注的抗原的配体，例如CD138。本发明的“靶向抗体”为天然抗体或基于天然抗体，或通过合成或通过基因工程而产生，并且与目的细胞(靶细胞)上的抗原结合。本发明的靶向抗体包括单克隆抗体、多克 隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、或抗体片段。所述靶向抗体可以被基因工程 化以便例如提高其与靶细胞的亲和性(Ross，2003)，或减少其免疫原性。所述靶向抗体可以 与包括效应分子的脂质体制剂相连(Carter，2003)。抗体片段包含完整抗体的一部分，优选 完整抗体的抗原结合区或可变区。本发明的抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和 Fv片段以及双链抗体(diabody)；结构域抗体(domain antibody) (dAb) (Ward，1989 ；美国 专利6，005, 079)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在单链可 变片段抗体(scFv)中，重链和轻链(VH和VL)可以通过短的氨基酸连接子连接，所述连接 子具有例如(Gly4Ser)n的序列并且具有足够的柔性而使两个结构域能装配成功能性抗原 结合袋。添加各种信号序列可以使得靶向抗体具有更精确的靶向性。添加轻链恒定区(CL) 可以允许经由二硫键的二聚化，从而提供更高的稳定性和亲合力。如果可获得针对所关注 的靶标的mAb，可以通过RT-PCR获得用于构建scFv的可变区，所述RT-PCR从提取自亲本杂 交瘤的mRNA克隆出该可变区。作为另一种选择，所述scFv可以通过噬菌体展示技术从头 产生(Smith，2001)。如本文所用，当参照靶向抗体使用时，术语“功能片段”是指能够特异 性结合抗原的靶向抗体的一部分，所述抗原与所参照的抗体特异性地结合。本发明的双特 异性抗体可以例如具有对靶组织有反应性的至少一条臂，以及对连接子部分有反应性的一 条臂(美国专利公开20020006379)。本发明的双特异性抗体还可以与靶细胞上的超过一种 抗原结合(Carter，2003)。本发明的抗体可以通过例如引入半胱氨酸残基来引入巯基来修 饰(01afsen,2004)。根据本发明，所述靶向抗体可以源自任何来源，并且可以为但不限于骆驼抗体、小 鼠抗体、嵌合人类/小鼠抗体或嵌合人类/猴抗体，特别是例如ΠΒΤ062等的嵌合人类/小 鼠抗体。人源化抗体为含有源自人类抗体和源自非人类抗体的序列的抗体，其也在本 发明范围内。用于将抗体人源化的合适方法包括CDR移植(互补决定区移植)(EP 0 239 400 ；WO 91/09967 ；美国专利 5，530，101 ；和 5，585，089)、表面修饰(veneering) 或表面重塑(resurfacing) (EP 0 592 106 ；EP 0 519 596 ；Padlan, 199 ；Studnicka 等，1994 ；Roguska 等，1994)、链改组(chain shuffling)(美国专利 5，565，332)以及 De Immuno sat ion (Bi ο vat ion，LTD)。在CDR移植中，将来自例如mAb B-B4等的小鼠互补 决定区(CDR)移植至人类可变框架，然后将该人类可变框架与人类恒定区连接，从而形成 人类B-B4抗体(hB-B4)。现在已经将几种通过⑶R-移植人源化的抗体用于临床，包括 MYL0TARG (Sievers 等，2001)和 HECEPTIN(Pegram 等，1998)。表面重塑技术使用分子模塑、统计分析和诱变的组合来将抗体可变区的非⑶R 表面改变成与靶标宿主的已知抗体表面类似。在例如美国专利5，639，641中公开了用于 将抗体表面重塑的策略和方法，以及用于降低不同宿主内抗体免疫原性的其它方法。可 以通过包括噬菌体展示方法的本领域已知的各种方法来制备人类抗体。还参见美国专利 4，444，887,4, 716，111,5, 545，806 和 5，814，318 ；以及国际专利申请公开 WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735 和 WO 91/10741。经受任何非天然修饰的靶向抗体，例如，嵌合人类/小鼠抗体或嵌合人类/猴抗 体、人源化抗体或经基因工程化以便例如提高与靶细胞的亲和性或减少其免疫原性的抗
13体，以及抗体片段、特别是已经经受任何非天然修饰的此类靶向抗体的功能片段、双链抗 体；结构域抗体；线性抗体；单链抗体分子；和多特异性抗体在本文也称为基因工程靶向抗 体。嵌合抗体，保留非人类抗体(例如它们所基于的小鼠抗体)的抗体结合区(ABR或 Fab区)，同时可以由例如人类抗体提供任何恒定区。通常，抗体恒定区的嵌合和/或交换 不会影响抗体的亲和力，这是因为有助于抗原结合的抗体区不受交换的影响。在本发明的 优选实施方式中，本发明的基因工程抗体，特别是嵌合抗体可以比其所基于的对应非人类 抗体具有更高的结合亲和力(通过Kd值表达)。具体地，ΠΒΤ062抗体和基于该抗体的抗体 可以比小鼠B-B4具有更高的抗体亲和性。在本发明的另一实施方式中，包含这些基因工程 抗体/嵌合抗体的免疫缀合物也显示出这种更高的抗体亲和性。在某些实施方式中这些免 疫缀合物也可以显示其它有利性质，例如比其含有B-B4的对应物使肿瘤负荷降低得更多。 在优选实施方式中，基因工程化、特别是嵌合的靶向抗体显示出特征为解离常数K11(IiM)小 于1. 6、小于1. 5或为1. 4或约小于1. 4的结合亲和力，而其小鼠对应物的特征在于解离常 数K11(IiM)为约1.6或大于1.6。优选包含靶向抗体等靶向剂的免疫缀合物的特征在于，解 离常数KD(nM)小于2. 6、小于2. 5、小于2. 4、小于2. 3、小于2. 2、小于2. 1、小于2. 0、小于 1.9或为约1.9，而包含小鼠对应物抗体的免疫缀合物的特征可以在于解离常数K11(IiM)为 约2. 6或大于2. 6 (比较表3、材料和方法)。也可以使用完全人类抗体。可以通过噬菌体展示方法筛选这些抗体，其中⑶138 或其抗原性决定子用于选择性地与表达例如B-B4可变区的噬菌体结合(参见，Krebs, 2001)。有利的是，该方法可以与亲和力成熟技术联合，来提高抗体的亲和力。本文涉及的 所有抗体均为分离的抗体。在一个实施方式中，未缀合形式的靶向抗体被中等或较弱地内化。在37°C下温育 3小时后，中等内化构成约30% 约75%的抗体内化，弱内化构成约0. 01% 最大约30% 内化。在另一优选实施方式中，所述靶向抗体结合CD138，例如抗体B-B4、BC/B-B4、B-B2、 DL-101、1D4、MI15、1. BB. 210、2Q1484、5F7、104_9、281_2，特别是 B-B4。通过将 SP02/0 骨髓 瘤细胞与Balb/c小鼠的脾细胞杂交产生的杂交瘤细胞，已经于2007年12月11日保藏在 DSMZ—Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg l，D-38124Braunschweig。这些表达B-B4的杂交瘤细胞的识别号为DSM ACC2874。在 另一实施方式中，所述靶向抗体基本上不结合非细胞表面表达的CD138。在本发明的背景 下，当特异性抗体的名称与术语“靶向抗体”结合(例如“ΠΒΤ062靶向抗体”)时，这是指该 靶向抗体具有抗体ΠΒΤ062的结合特异性。如果说靶向抗体“基于”一种特异性抗体，这是 指该靶向抗体具有该抗体的结合特异性，但可以采用与上述对靶向抗体的描述一致的任何 形式。在本发明的背景下，当特异性抗原的名称与术语“靶向抗体”结合(例如“CD138靶 向抗体”)时，这是指该靶向抗体具有对CD138的结合特异性。在本发明的背景下，如果例 如描述靶向抗体“选择性地”进行某事，例如“选择性地靶向细胞表面表达的CD138”，或对 某事是“选择性的”，这是指在所提供的实例的情况下，与任何其它抗原相比，对细胞表面表 达的⑶138存在显著的选择性(即，对⑶138阳性细胞比对于⑶138阴性细胞更高的亲和 性)。由于该选择性，显著减少了甚至避免给定环境中不利的副作用。本发明的“非免疫球蛋白靶向分子”包括源自非免疫球蛋白蛋白的靶向分子以及非肽靶向分子。将包括在该定义中的小的非免疫球蛋白蛋白设计成对特别是表面表达的 ⑶138具有特异性亲和性。这些小的非免疫球蛋白蛋白包括基于支架的基因工程分子，例如 具有相对低分子量(例如IOkDa 20kDa)的Affilin 分子。合适的支架包括例如Y晶 体。这些分子在其自然状态对靶标分子无特异性结合活性。通过对蛋白表面经由溶剂暴露 的氨基酸的局部限定随机化而进行基因工程化，形成全新的结合位点。由此将此前的非结 合蛋白转变成特异性结合蛋白。可以将此类分子特异地设计成结合例如CD138等的靶标， 并允许特异性输送一种或多种效应分子(参见，www. scilproteins. com的scil Proteins GmbH, 2004) 0另一种非免疫球蛋白靶向分子源自脂钙蛋白(lipocalin)，并且包括例如 ANTICALINS ，所述ANTICALINS 与免疫球蛋白在结构上具有某种程度的相似性。然而脂钙 蛋白由具有160 180个氨基酸残基的单链多肽构成。可以将脂钙蛋白的结合袋改造以便 以高亲和性和特异性来识别所关注分子(参见，例如，Beste等，1999)。人工细菌受体(例 如商标为Affibody (Affibody AB)的受体)也在本发明范围内。这些人工细菌受体分子 为较小的简单蛋白，并且可以由基于蛋白A(金黄色葡萄球菌)的一种IgG结合结构域的支 架的三螺旋束构成。这些分子具有与许多免疫球蛋白类似的结合性质，但是明显更小，分子 量通常不超过IOkDa,并且相对稳定。合适的人工细菌受体分子例如美国专利5，831，012 ； 6，534，628 和 6，740，734 中所述。其它“非免疫球蛋白靶向分子”为正讨论的抗原的生理学配体。⑶138的生理学 配体包括但不限于例如ADAMTS4(聚蛋白多糖酶-1)、抗凝血酶-3、bFGF、组织蛋白酶G、 CCL5 (RANTES)、CCL7、CCLll、CCLl7、CD44、胶原蛋白(1型胶原蛋白、2型胶原蛋白、3型胶原 蛋白、4型胶原蛋白、5型胶原蛋白、6型胶原蛋白)、CXCL1、弹性蛋白酶、gpl20、HGF[肝细胞 生长因子]、层粘连蛋白-1、层粘连蛋白_2、层粘连蛋白_5、中期因子(midkine)、MMP-7、嗜 中性粒细胞弹性蛋白酶和多效生长因子(pleiotrophin) (HBNF，HBGF-8)。非肽靶向分子包 括但不限于与CD138结合的DNA和RNA寡核苷酸(适体)。本发明的“效应分子”为如下的分子或衍生物或其类似物所述分子连接至靶向 剂、特别是靶向抗体和/或基因工程靶向抗体，并且对靶细胞发挥所期望的作用，例如凋 亡、或另一类型的细胞死亡、或连续的细胞周期停滞。本发明的效应分子包括在靶细胞中 能够发挥所期望作用的分子，并且包括，但不限于，毒素、药物(特别是低分子量细胞毒性 药物)、放射性核素、生物响应修饰剂、成孔剂、核糖核酸酶、具有凋亡诱导活性的凋亡信号 传导级联的蛋白、细胞毒性酶、前药激活酶、反义寡核苷酸、抗体或细胞因子以及其功能衍 生物或类似物/片段。毒素可以包括细菌性毒素，例如但不限于白喉毒素或外毒素A ；植物 毒素，例如但不限于蓖麻毒蛋白。具有凋亡诱导活性的凋亡信号传导级联的蛋白包括但不 限于粒酶B、粒酶A、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、截短的 Bid(tBid)、Bax 和 Bak。在优选实施方式中，所述效应子增加免疫缀合物的内部效应子输送，尤其当免疫 缀合物的靶向抗体所基于的抗体的天然形式可被较弱地内在化时。在另一优选实施方式 中，所述效应子的天然形式是非选择性的。在某些实施方式中，当处于天然形式时，所述效 应子具有高度的非选择性毒性，包括系统毒性。本发明效应分子的“天然形式”为在与靶向 剂连接而形成免疫缀合物之前的效应分子。在另一优选实施方式中，与靶向剂缀合后基本 上消除了效应分子的非选择性毒性。在另一优选实施方式中，当到达靶细胞时，所述效应分子在靶细胞中引起死亡或连续的细胞周期停滞。本发明的药物效应分子包括但不限于 如下的药物包括例如充当微管蛋白聚合的抑制剂的小型高细胞毒性药物(例如类美登素 类、多拉司他汀(dolastatins)、奥雷司他汀(auristatin)和念珠藻环肽(cryptophycin)) 的药物；DNA烷基化剂，如CC-1065类似物或衍生物(美国专利5，475，092 ；5, 585，499 ； 6，716，821)和倍癌霉素(duocarmycin)；烯二炔类(enediyne)抗生物例如卡里奇霉素 (calicheamicin)和埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及强效类紫杉烷(taxoid)(紫杉烷) 药物(Payne，2003)。特别优选类美登素类和卡里奇霉素类。效应子类美登素包括任何 来源的类美登素，包括但不限于合成的美登醇和美登醇类似物和衍生物。多柔比星、道诺 霉素、甲氨蝶呤、长春碱、新制癌菌素、大分子霉素、三亚胺醌(trenimon)和α -鹅膏菌素 (amanitin)为本发明范围内的一些其它效应分子。作为效应分子的反义DNA分子也在本发 明范围内。当特定药物或药物种类的名称与术语“效应子”或“效应分子”结合时，是指基 于该特定药物或该药物种类的本发明的免疫缀合物的效应子。美登素是最初源自埃塞俄比亚灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)的一种天然 产物(Remillard，1975 ；美国专利3，896，111)。该药物抑制微管蛋白聚合，从而导致阻断 有丝分裂和细胞死亡(Remillard，1975 ；Bhattacharyya, 1977 ；Kupchan, 1978)。美登素的 细胞毒性比临床使用的影响微管蛋白聚合的抗癌药(例如长春花生物碱类或紫杉醇)高 200 1000倍。然而，美登素的临床试验表明，其由于高的系统毒性而缺少治疗窗。美登素 和类美登素类是高度细胞毒性的，但是其在癌症治疗中的临床应用受其严重的系统性副作 用限制，该副作用主要归因于其对肿瘤的不良选择性。使用美登素的临床试验显示出对中 枢神经系统和胃肠系统的严重副作用。类美登素类也已经从其它植物、包括滑桃树(Trewia nudiflora)的种子组织分离 出(美国专利4，418，064)。某些微生物也产生类美登素，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4，151，042)。本发明还涉及任何来源的类美登素，包括合成的美登醇和美登醇类似物，其公开 于例如美国专利 4，137，230,4, 248，870,4, 256，746,4, 260，608,4, 265，814,4, 294，757、 4，307，016,4，308，268,4，308，269,4，309，428,4，313，946,4，315，929,4，317，821, 4，322，348,4, 331，598,4, 361，650,4, 362，663,4, 364，866,4, 371，533,4, 424，219 和 4，151，042 中。在一个优选实施方式中，类美登素为含巯基的类美登素，并且更优选根据Chari 等的美国专利6，333，410或Chari等(Chari, 1992)中公开的方法产生。在本发明的背景下，DM-I (N2-脱乙酰基-N2-(3-巯基氧代丙基)美登素)为 一种优选的效应分子。DMl比美登素的细胞毒性高3倍 10倍，并且通过借助于二硫键将 其连接至针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体而已被转化成前药。某些此类缀合物(有时称为 “肿瘤激活的前药” (TAP))在血液腔中无细胞毒性，因为它们在与靶细胞连接时被激活并内 化，由此释放药物(Blattler，2001)。已经开发出几种抗体-DMl缀合物(Payne，2003)，并 且在临床试验中评价。例如，在结直肠癌患者中huC242-DMl治疗被良好耐受，不会诱导任 何可检测的免疫响应，并且具有长循环时间(TOlcher，2003)。其它特别优选的类美登素包含含有空间位阻巯基键的侧链，该类美登素例如但不 限于类美登素N2’-脱乙酰基-N2’-(4-巯基-1-氧代戊基)美登素(也称为“DM3”)和N2’-脱乙酰基-N2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)美登素(也称为“DM4”)。DM4的合成如图 3和图4所示并且在本文其它部分有所描述。DM4与DMl和DM3的不同之处在于其在α C 处携带有甲基。当将DM4经由连接子(具体为但不限于包含二硫键的连接子)连接至例如 ΠΒΤ062等靶向剂时，会导致空间位阻。携带有空间位阻巯基的各种类美登素(拥有一个或 两个取代基、特别是烷基取代基，例如DM4的甲基取代基)公开于2004年11月25日公布 的美国专利申请2004/0235840，本文通过参考并入其全部内容。由与DM3和DM4的硫原子 相邻的碳上的例如甲基等烷基赋予的空间位阻可以影响免疫缀合物细胞内切割的速率。因 此可变的烷基单元可以影响体外和体内潜力、效力和安全性/毒性。如Goldmahker等在美国专利公开2006/0233814中所报道，一旦在靶标处释放药 物，此类空间位阻诱导游离药物的烷基化(例如，甲基化)。烷基化可以增加该药物的稳定 性，从而提供所谓的旁观者效应。然而，本领域技术人员将意识到，当将效应子经由连接子 连接至靶向剂时，其它包含处在导致空间位阻的位置的例如烷基等取代基的效应分子也是 本发明的一部分(美国专利公开2004/0235840)。优选的是，这种位阻诱导游离药物的化学 修饰(例如烷基化)从而增加其总体稳定性，这使得该药物在表达CD138的肿瘤细胞中不 仅诱导细胞死亡或连续的细胞周期停滞，而且在必要时还影响例如支持或保护肿瘤免受药 物影响且通常不表达CD138的辅助细胞(特别是肿瘤基质的细胞和肿瘤血管的细胞)以致 减少或丧失其支持或保护功能。还特别优选DNA烷基化剂作为效应分子，并且所述DNA烷基化剂包括但不限于 CC-1065类似物或衍生物。CC-1065为分离自泽耳链霉菌(Sti^ptomyces zelensis)的培养 物的强效抗肿瘤抗生物，并且在体外已经显示出特殊的细胞毒性(美国专利4，169，888)。 例如美国专利5，475，092,5, 585，499和5，739，350所述的CC-1065类似物或衍生物落在本 发明范围内。本领域技术人员会容易地意识到，美国专利5，846，545所述的修饰的CC-1065 类似物或衍生物，和例如美国专利6，756，397所述的CC-1065类似物或衍生物的前药也 在本发明范围内。在本发明的某些实施方式中，CC-1065类似物或衍生物可以如美国专利 6，534，660中所述而合成。作为优选效应分子的另一组化合物为紫杉烷，特别是高强效紫衫烷和含有巯基或 二硫基的紫杉烷。紫杉烷为抑制微管蛋白解聚从而导致维管组装和细胞死亡速率增加的有 丝分裂纺锤体毒剂。在本发明范围内的紫杉烷公开于例如美国专利6，436，931、6，340，701、 6，706，708 和美国专利公开 20040087649,20040024049 和 20030004210 中。其它紫杉烧 公开于例如美国专利6，002，023、美国专利5，998，656、美国专利5，892，063、美国专利 5，763，477、美国专利5，705，508、美国专利5，703，247和美国专利5，367，086中。本领域技 术人员可以理解，PEG化(PEGylated)的紫杉烷(例如美国专利6，596，757中所述的紫杉 烷)也在本发明范围内。本发明的卡里奇霉素效应分子包括Y II、N-乙酰基卡里奇霉素和卡里奇霉素的 其它衍生物。卡里奇霉素以序列特异性方式与DNA的小槽结合，进行重排并使自由基暴露， 从而引起双链DNA的断裂，进而导致细胞凋亡和死亡。可用于本发明背景下的卡里奇霉素 效应分子的一个实例描述于美国专利5，053，394中。本发明的免疫缀合物包含至少一种靶向剂(特别是靶向抗体)和一种效应分子。 所述免疫缀合物可以包含例如用于稳定化的其它分子。对于免疫缀合物，术语“缀合物”通常用于定义靶向剂与一种或多种效应分子的有效结合，并不旨在仅指任一类有效结合， 特别是不限于化学“缀合”。只要所述靶向剂能够与靶点结合，并且连接的效应子(特别 是当输送至靶点时)如预期地充分起作用，任何连接模式都是适合的。本发明的缀合方法 包括但不限于在将效应分子和/或靶向抗体事先修饰或未事先修饰时将效应分子直接连 接至靶向抗体，或经由连接子连接。连接子可以在功能上分类成例如酸不稳定性连接子、 光不稳定性连接子、酶可切割连接子，例如可以被肽酶切割的连接子。在本发明许多实施 方式中优选可切割连接子。可以在细胞环境、特别是细胞内环境中存在的条件下切割此类 可切割连接子，当切割时所述环境对药物释放无有害作用。如存在于特定的细胞内区室的 PH4 5等低pH会切割酸不稳定连接子，而光不稳定连接子可以通过例如红外光切割。然 而，优选被大多数细胞中存在的生理条件切割或者在该生理条件下切割的连接子，本文将 之称为生理性可切割连接子。因此，在本发明许多实施方式中优选二硫键连接子。这些连 接子可通过能在生理条件下发生的二硫键交换而切割。优选的异双官能二硫键连接子包括 但不限于N- 丁二酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(参见，例如Carlsson等 (1978))、N-丁二酰亚胺基4-(2_吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(参见，例如美国专利号 4，563，304)、N- 丁二酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(参见，例如CAS登记号 341498-08-6)、N_ 丁二酰亚胺基4_(N_马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC)(参 见，例如Yoshitake等，(1979))和N- 丁二酰亚胺基4_甲基-4-[2-(5-硝基吡啶基)二硫 代]戊酸酯(SMNP)(参见，例如美国专利号4，563，304)。用于本发明组合物的最优选的连 接子分子为SPP、SMCC和SPDB。其它合适的连接子可以包括“非可切割性”键，例如但不限于磺酸丁二酰亚胺基 马来酰亚胺基甲基环己烷甲酸酯(SMCC)，其为能够将化合物与含SH化合物连接的异双官 能连接子。双官能连接子分子和异双官能连接子分子，例如针对糖的异双官能连接子分子 (例如S- (2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰胼(TPCH))，也在本发明范围内(Vogel，2004)。例 如类美登素等效应分子可以经由两步反应法缀合至靶向抗体，所述两步反应法包括第一 步，将靶向抗体用交联剂(例如N-丁二酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP))修饰，以向 所述靶向抗体引入二硫代吡啶基。在第二步中，可以将具有巯基的反应性类美登素(例如 DMl)加入经修饰的抗体，从而引起在所述经修饰的抗体中硫代吡啶基的置换和二硫键连接 的细胞毒性类美登素/抗体缀合物的产生(美国专利5，208，020)。然而，一步缀合法，例如 在Chari等的美国专利公开20030055226中描述的方法，也在本发明范围内。在本发明的 一种实施方式中，将同类或不同类的多种效应分子与靶向抗体相连。如本文别处所讨论，所 用连接子的性质可能影响旁观者杀伤(Kovtim等，2006)。也参见图13的讨论。可以经由例如美国专利6，716，821中所述的PEG连接基团，将CC-1065类似物或 衍生物缀合至所述靶向剂。卡里奇霉素可以经由连接子缀合至靶向抗体(美国专利5，877，296和美国专利 5，773，001)，或根据美国专利5，712，374和美国专利5，714，586中公开的缀合方法缀合至 靶向抗体。用于制备卡里奇霉素缀合物的另一优选方法记载于美国专利公开20040082764。 本发明的免疫缀合物可以采用重组融合蛋白的形式。术语“细胞毒性剂”包含“细胞毒性药物/癌症药物”，包括化疗剂，例如美法仑、环 磷酰胺、长春新碱、多柔比星和脂质体多柔比星(DOXIL)、环磷酰胺、足叶乙甙、阿糖胞苷和顺钼，例如泼尼松(prednisone)和地塞米松等糖皮质激素类和例如沙利度胺、硼替佐米、 来那度胺(Ienalidomide)等试剂，以及例如索拉非尼(sorafenib)等激酶抑制剂或例如罗 明待辛(romicbpsin)等HDAC (组蛋白脱乙酰酶)抑制剂，以及生长抑制剂、抗激素剂、抗血 管生成剂、保心剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、血管生成抑制剂、蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制 剂。该定义还包括抗体类细胞毒性剂，包括具有在本领域内了解的细胞毒性作用的免疫缀 合物和抗体。Anti-CD40为优选的抗体。其它抗体包括但不限于例如AVASTIN(贝伐单抗 (bevacizuab))或 MYELOMACIDE (米拉珠单抗(milatuzumab))。THAL0MID(a-(N-邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺；沙利度胺)是免疫调节剂。 沙利度胺的经验式为C13HltlN2O4，克分子量为258. 2。沙利度胺的CAS号为50-35-1。其似乎 具有多种作用，包括以各种方式抑制骨髓瘤细胞生长和存活的能力和抑制新血管生长的能 力。VELCADE是用于治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂。据信VELCADE作用在骨髓 瘤细胞上而引起细胞死亡，和/或通过作用于骨微环境而间接作用，从而抑制骨髓瘤细胞 生长和存活。在不受特定理论或作用模式的限制下，VELCADE因而破坏正常细胞过程，导致 促进凋亡的蛋白酶体抑制。REVLIMID是免疫调节剂。认为REVLIMID影响骨髓瘤细胞中的多种途径，从而诱导 凋亡、抑制骨髓瘤细胞生长、抑制血管内皮生长因子(VEGF)，由此抑制血管生成和降低骨髓 瘤细胞粘着至骨髓基质细胞。地塞米松为充当消炎剂和免疫抑制剂的合成糖皮质激素留体。当施用至癌症患者 时，地塞米松能够对抗癌症治疗的副作用。地塞米松还能够单独给药或与包括沙利度胺、阿 霉素或长春新碱等的其它抗癌剂一起给药。术语“与…组合”不限于在精确地同一时间施用。相反，该术语涵盖依次或以一定 的时间间隔施用本发明的免疫缀合物与其它治疗方案(例如放射治疗)或试剂(特别是上 述的细胞毒性剂)，以使它们可以共同起作用，从而提供与仅使用本发明的免疫缀合物或例 如其它试剂的治疗相比更大的益处。优选所述免疫缀合物和其它试剂累加地起作用，特别 优选它们协同地起作用。以对于预期目的有效的量合适地提供此类分子。熟练的医学从业 者能够根据经验，或通过考虑试剂的药代动力学和作用模式来确定各治疗剂的合适剂量、 以及施用的合适时机和方法。如本发明的背景下所用，“共施用”是指与免疫缀合物同时施 用，通常是以组合剂型施用。术语“序列同一性”是指对核苷酸序列或氨基酸序列同一性的量度。通常，比对所 述序列，从而获得最高量级的匹配。“同一性”本身在本领域具有公知的含义，并且可以使用 已公开的技术计算(参见，例如 Computational Molecular Biology,Lesk,Α. Μ.编，Oxford University Press, New York,1988 ；Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith,D. W.编，Academic Press,New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.禾口 Griffin, H. G.编，Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G, Academic Press,1987 ；禾口 Sequence Analysis Primer,Gribskov,M. and Devereux,J.编，M Stockton Press,New York,1991)。 尽管存在许多测定两个多核苷酸或多肽序列之间同一性的方法，术语“同一性”对本领域技 术人员而言是公知的(CariIlo, H. & Lipton, D. , SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。
任何特定的核酸分子是否与例如ΠΒΤ062核酸序列或其一部分具有至少50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性，可以如下常规 确定使用已知的计算机程序例如DNAsis软件(Hitachi Software, San Bruno，Calif.)进 行初始序列比对，然后使用ESEE3. 0版DNA/蛋白质序列软件(cabotOtrog. mbb. sfu. ca)进 行多重序列比对。氨基酸序列是否与例如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2或其一部分具有至少50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，96%、97%、98%或 99% 的同一性，能够使用已知 的计算机程序例如 BESTFIT 程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix 用第 8 版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison, Wis. 53711)而常规地确定。BESTFIT 使用 Smith 和 Waterman，Advances in Applied Mathematics 2 =482-489(1981)的局部同源性算法，来寻找两个序列之间同源性最高的片 段。当使用DNAsis、ESEE, BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与 本发明的参照序列具有例如95%同一性时，将参数设置如下在参照核酸或氨基酸序列的 全长上计算同一性百分比，允许同源性中的间隔(gap)至多为参照序列中核苷酸总数的5%。在本发明的背景下，如果提及与特定序列的残基组合的序列同一性，则该序列同 一性涉及所指定的所有残基的总和。基本抗体分子为双官能结构，其中可变区与抗原结合，而剩下的恒定区可以引起 非抗原依赖性响应。大多数抗体类型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)由恒定区确定。这些类 型可以进一步分成亚类(同型)。例如，IgG类具有四种同型，即根据恒定区确定的IgGl、 IgG2、IgG3、和IgG4。各种人类抗体类型中，已知仅人类IgGl、IgG2、IgG3和IgM有效地激 活补体系统。尽管恒定区不形成抗原结合位点，恒定区和铰链区的排布可以对所述分子赋 予片段柔性，这使其可与抗原结合。不同的IgG同型能够与例如单核细胞、B细胞和NK细胞等细胞上的Fc受体结合， 从而激活细胞以释放细胞因子。不同的同型还可以激活补体，导致局部或系统性炎症。特别 是，不同的IgG同型可以以不同的程度结合Fc y R0 Fc Y R为一组属于Ig超家族的表面糖蛋 白，主要在白细胞上表达。将Fc γ R糖蛋白分成三类，称为Fc γ RI (⑶64) ,FcyRII (⑶32)和 FcyRIII(CD16)0尽管IgGl、IgG2和IgG3与各种此类Fc γ R糖蛋白强烈地结合，IgG4显 示出弱得多的结合。具体而言，化64为？(^1 1的中间体结合剂，其产生相对低的ADCC(抗 体依赖性细胞毒性)甚至不产生ADCC，并且不与Fc γ RIIIA或Fc γ RIIA结合。IgG4也是 Fc y RIIB的弱结合剂，所述Fc y RIIB为抑制性受体。此外，IgG4仅介导微弱的补体固定或 不介导补体固定，具有微弱的补体依赖性细胞毒性(CDC)或不具有CDC。在本发明的背景 下，IgG4可以具体用于预防Fc介导的肝FcR靶向，这是因为其没有显示出与LSEC(肝窦状 内皮细胞)上的FcR γ II的相互作用，还显示出与Kupffer细胞(巨噬细胞)上的FcRy I III无相互作用或具有弱相互作用，并且与肝NK细胞上的FcR γ III无相互作用。进一步降 低任何⑶C的某些突变也是本发明的一部分。例如在327、330和331位的IgG4残基显示 出ADCC (抗体依赖性细胞毒性)和CDC的降低(Amour, 1999 ；Shields, 2001)。使抗体稳定 化的多种突变之一也是本发明的一部分(本文也称为“稳定化突变”)。这些突变特别包括IgG4的CH2区中的亮氨酸突变成谷氨酸，和IgG4铰链核心中的丝氨酸交换为脯氨酸。在 本发明的某些实施方式中，这些突变使半分子(half-molecule)的量减少至小于10%、小 于5%且优选小于2%或1%。此外，如此稳定化的抗体的体内半衰期可以增加几天，包括1 天、2天、3天、4天和超过5天(Schuurman，1999)。本文所述的包括靶向抗体等靶向剂，还可以根据它们与抗原、特别是CD138的结 合亲和性来描述或说明。例如靶向抗体等靶向剂的优选结合亲和性的特征在于，解离常数 Kd(nM)小于1. 6、小于1. 5或约为1. 4或小于1. 4。对于包含如靶向抗体等所述靶向剂的免 疫缀合物而言，解离常数K11(IiM)优选小于1. 6、小于1. 5或小于2. 5、小于2. 4、小于2. 3、小 于2. 2、小于2. 1、小于2. 0、小于1. 9或约为1. 9。本发明的抗原结合区(ABR)会基于所用的靶向抗体或基因工程靶向抗体的类型 而变化。在天然存在的抗体中和在大多数嵌合抗体和人源化抗体中，抗原结合区由重链的 前两个结构域和轻链组成。然而，在没有轻链的重链抗体中，抗原结合区仅由例如重链的 前两个结构域组成，而在将抗体分子的轻链和重链可变区合并于单个多肽链中的轻链抗体 (ScFv)中，ABR仅由一个多肽分子提供。FAB片段通常通过木瓜蛋白酶消化而获得，并且具 有一条轻链和重链的一部分，因此包含仅具有一个抗原结合位点的ABR。另一方面，双链抗 体为具有两个抗原结合区的小的抗体片段。然而，在本发明的背景下，靶向抗体或基因工程 靶向抗体的抗原结合区为任何主要决定靶向抗体或基因工程靶向抗体的结合特异性的区 域。如果据称ABR或另一靶向抗体区“出自某种抗体”，例如人类或非人类抗体，这是 指在本发明的背景下ABR或者与相应的天然存在的ABR相同，或者基于该相应的天然存在 的ABR。如果ABR具有天然存在的ABR的结合特异性，则该ABR基于天然存在的ABR。然而， 此类ABR可以包含例如点突变、添加、缺失或例如糖基化等翻译后修饰。特别地，此类ABR可 以与天然存在的ABR的序列具有超过70 %、超过80 %、超过90 %、优选超过95 %、超过98 % 或超过99%的序列同一性。在本发明的背景下，靶向剂(例如靶向抗体，特别是包含靶向抗体的免疫缀合物) 的均勻靶向(homogenous targeting)是对与用该靶向剂获得所述靶向的期望结果相关的 差异的量度。在本发明的某些实施方式中，所期望的结果通过与靶标的简单结合而获得。 即，例如，其中某种靶向剂提供抵抗随后结合的防护的实施方式的情况。然而，靶向剂的均 勻性(homogeneity)可以通过例如包含所述靶向剂的免疫缀合物的效力而容易地估算。例 如，所述免疫缀合物针对例如CD138等肿瘤抗原(该肿瘤抗原包含旨在破坏肿瘤细胞和/ 或使肿瘤生长停滞的效应子)的效力可以通过包含表达CD138抗原的细胞的肿瘤的生长抑 制程度而确定。此类免疫缀合物可以在其效力方面显示出较高的差异。例如，有时其可以以 高效力使肿瘤生长停滞，但其它时候该效力很难超过对照的效力。另一方面，免疫缀合物在 效力方面的较低差异，显示出免疫缀合物和/或靶向剂分别一致地提供所期望的结果。一 种靶向均勻性定量方法为计算靶向差异(targeting variation) 0在包含某种靶向剂的免 疫缀合物使肿瘤生长停滞的情况下，靶向差异可以如下计算首先确定肿瘤达到预定体积 (例如300mm3)的时间。优选地，选择预定体积从而使在达到所述预定体积之前和之后的任 何肿瘤生长均以大致相同的速率稳定地增加。在对于一组受试对象已经确定所述时间后， 计算受试对象组(例如，SCID小鼠或显示均勻肿瘤生长的另一合适的模型)中这些时间的平均值(Tm)。然后将Tm与观察值相关联，所述观察值获自显示出最低靶向效力并因此与达 到所述预定体积所需时间(Tf)最少的肿瘤相关的组内受试对象，并在另一方面，获自显示 出最低靶向效力并因此与达到所述预定体积所需时间(Ts)最多的肿瘤有关的组内受试对 象，所述相关性通过根据下式计算预定体积的靶向差异而获得靴向差异[%] = Ts-Tf/TmX 100在一个优选实施方式中，本发明的包含基因工程靶向抗体的免疫缀合物的靶向差 异小于150%、小于140%、小于130%、小于120%、小于110%、小于100%、小于90%、小于 80%、小于70%、小于60%或小于50%，在某些实施方式中甚至小于45%。优选地，所述靶 向差异为约10% 约150%，优选约10% 约100%、约10% 约80%、约10% 约70%、 约10% 约60%、约10% 约50%。靶向的均勻性还可以通过其它手段(例如确定肿瘤生长延迟)而定量。另外，本 领域技术人员易于理解，特定尺寸的肿瘤体积仅仅是一个可以基于其而确定靶向差异的参 数。根据所期望的结果，可以使用其它参数，包括时间(例如衡量肿瘤生长延迟的时间)或 结合百分比(％)。本领域技术人员能够容易地确定这些其它参数。图9 (C)和(D)中显示包含小鼠抗体BB4的免疫缀合物(BB4_SPP_DM1 ；图9C)和包 含基于该抗体的基因工程靶向抗体nBT062的免疫缀合物(nBT062-SPP-DMl ；图9D)之间， 靶向/结合的均勻性的差异。从这些图可以看出，使用包含基因工程靶向抗体的免疫缀合 物获得的结果比使用包含上述小鼠抗体的免疫缀合物获得的结果明显更均勻。这由于BB4 的抗体结合区在nBT062中未经修饰而特别显著。由此，包含小鼠抗体的抗体结合区而不是 小鼠抗体其它部分的免疫缀合物显示出远超出本领域技术人员预期结果的性质。nBT062(也参见图1)为小鼠人类嵌合IgG4mAb，为B-B4的一种嵌合形式。创造 该嵌合形式的B-B4来降低HAMA(人类抗小鼠抗体)响应，同时维持B-B4的抗体结合区 对CD138的功能。令人惊奇的是，使用包含该基因工程靶向抗体的免疫缀合物获得的结果 明显更加均勻(结果中的差异降低)。以下说明用于产生ΠΒΤ062的方案。表达ΠΒΤ062 的中国仓鼠卵巢细胞已经于2007年12月11日保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D_38124Braunschweig0 识别号为DSM ACC2875。基于B-B4的CD138特异性嵌合抗体在本文通称为c_B_B4。已从ΠΒΤ062用核苷酸序列的翻译物预测了重链和轻链的氨基酸序列。重链和轻 链的预测氨基酸序列如表1所示。预测的可变区用粗体标出，预测的CDR用下划线标出。表1. nBT062的预测的氨基酸序列nBT062 重链预测序列(SEQ ID NO 1)
1QVQLQQSGSE LMMPGASVKI SCKATGYTFS
51 ILPGTGRTIY NEKFKGKATF TADISSNTVQ 101 YYCaTFYYAMD YWGQGTSVTV SSASTKGPSV 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS 251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY 301 TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL 351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM
NYWIEWVKQR PGH6LEWI6E MQLSSLTSED SAVYYCARRD
FPLAPCSRST SESTAALGCL SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK VDGVEVHNAK TKPREEQFNS PSSIEKTISK AKGQPREPQV VEWESNGQPE NNYKTTPPVL HEALHNHYTQKSLSLSLG(K)
22
C端赖氨酸易于剪切，并且可以由于不完全切割而在某种程度上存在。括号中的 (K)不是SEQ ID NO 1的一部分。nBT062 轻链预测序列(SEQ ID NO 2) 权利要求
一种用于减少有需要的受试对象的肿瘤细胞中基质细胞粘着至表达CD138的肿瘤细胞的方法，所述方法包括以对于减少基质细胞粘着至表达CD138的肿瘤细胞有效的量对所述肿瘤细胞施用靶向所述表达CD138的肿瘤细胞的免疫缀合物，和可选地以抑制、延缓和/或预防肿瘤细胞生长的量对所述肿瘤细胞施用其它细胞毒性剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫缀合物包含效应分子和靶向剂，其中所述 效应分子和所述靶向剂经由可切割连接子而相互连接。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述可切割连接子含有二硫键。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述连接子为SPP或SPDB。
5.如权利要求1 4中任一项所述的方法，其中所述粘着减少至少约10%、约20%、约 30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%、约 80% 以上。
6.如权利要求1 4中任一项所述的方法，其中所述粘着减少导致粘着介导的药物抗 性的缓解。
7.如权利要求6所述的方法，其中使对不是所述免疫缀合物的其它细胞毒性剂的粘着 介导的药物抗性减少，并且其中以抑制、延缓和/或预防肿瘤细胞生长的量施用所述其它 细胞毒性剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒性剂为美法仑、长春新碱、多柔比星、地 塞米松、环磷酰胺、足叶乙甙、阿糖胞苷、顺钼、沙利度胺、泼尼松、沙利度胺、硼替佐米、来那 度胺、索拉非尼、罗明待辛或其组合。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒性剂为基于抗体的。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述效应分子为空间位阻的。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中所述效应分子为类美登素、紫杉烷或CC1065、 或其类似物的至少一种。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述效应分子为至少一种类美登素，例如DM1、DM3 或 DM4。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述效应分子为DM4。
14.如权利要求1 4中任一项所述的方法，其中所述免疫缀合物的靶向剂包含免疫球蛋白重链或其部分的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白重链或其部分与SEQ ID NO 1具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列同一性。
15.如权利要求7所述的方法，其中依次地施用所述免疫缀合物和所述细胞毒性剂，其 中在施用免疫缀合物之后施用细胞毒性剂。
16.如权利要求7所述的方法，其中将所述免疫缀合物和所述细胞毒性剂共同施用。
17.如权利要求1 4和7 9中任一项所述的方法，其中所述受试对象为罹患以 下疾病之一的癌症患者多发性骨髓瘤、卵巢癌、肾癌、胆囊癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结 肠癌、霍奇金氏淋巴瘤与非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病 (ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、实体组织肉瘤或结肠癌。
18.如权利要求17的方法，其中所述患者罹患多发性骨髓瘤。
全文摘要
本申请公开了对CD138具有特异性的免疫缀合物及其使用方法，该免疫缀合物减少表达CD138的肿瘤细胞粘着至基质细胞。该粘着的减少使得肿瘤细胞不仅对所述免疫缀合物易感，还对其它试剂、特别是细胞毒性剂易感。
文档编号A61K47/48GK101945892SQ200880126958
公开日2011年1月12日 申请日期2008年12月23日 优先权日2007年12月26日
发明者克里斯托夫·尤尔克, 克里斯托夫·布鲁切尔, 本杰明·德尔肯, 秀岛辉, 肯尼思·安德森 申请人:生物测试股份公司;伊缪诺金公司;丹纳-法伯癌症研究所