专利名称：一种蛇毒抗肿瘤侵袭与转移的解离素的制作方法
技术领域：
本发明涉及生化与生物医药领域，具体的说是一种蛇毒抗肿瘤侵袭与转移 的解离素。
背景技术：
整合素是普遍存在于细胞中的一种跨膜糖蛋白，广泛参与体内的生理和病 理过程，其拮抗剂在抗血小板聚集、抗肿瘤以及抗肿瘤转移中展示出良好的应 用前景，是药物开发的一个重要方向。根据阻断受体的作用机制不同，整合素
拮抗剂可分为以下两类(l)抗整合素单克隆抗体如GPIIb/IIIa受体人-鼠嵌合 单克隆抗体阿西单抗(Abciximab， c7E3),已获美国FDA批准用于临床，是目前 最成功的抗血小板药物。(2)能够封闭整合素结合位点的拮抗剂包括来源于天然 生物毒素的解离素(disintegrin)以及以合成多肽和肽类衍生物等。解离素是 主要从蛇毒中分离的能够阻断整合素与其配体结合的一类富含半胱氨酸的小分 子多肽，含有精-甘-天冬氨酸(Arg-Gluy-Asp， RGD)、赖-甘-天冬氨酸 (Lys-Gluy-Asp，KGD)等序列。RGD序列是ECM及其基底膜中的纤维蛋白原、纤 维粘连蛋白、凝血酶敏感蛋白、骨桥蛋白和血管性假血友病因子等所含有的高 度保守的氨基酸序列，其与肿瘤细胞、新生血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞表 面以及血小板等表面的整合素结合，参与肿瘤细胞的侵润过程。含有RGD序列 的解离素可以竞争性地与上述整合素配体结合，干扰肿瘤细胞一ECM或其他细胞 间的相互作用，从而抑制血小板聚集形成瘤栓、肿瘤血管新生，达到抑制肿瘤 细胞侵润、转移的目的。
蛇毒是多种酶或非酶蛋白质或多肽的混合物，含有多种分子量不等，等电 点各异的蛋白质或多肽分子。分离蛇毒中活性成分有多种层析方法根据分子 量差异分离蛋白的凝胶过滤层析法，根据等电点差异分离蛋白的离子交换层析 法，以及根据疏水性差异分离蛋白的疏水层析和反相层析法等。
现有的80余种解离素中，有41种报道有抑制血小板聚集的作用，其中35
种解离素的氨基酸序列中含有RGD序列，可见解离素分子，活性中心的RGD三 肽活性基元对维持抑制血小板聚集的活性是必须的。解离素的分子结构特征是 在多肽分子中含有能与整合素结合的三基肽，如RGD、 KGD、 MLD (蛋氨酸一 亮氨酸一天冬氨酸，Met-Leu-Asp)和KTS (赖氨酸-苏氨酸-天冬氨酸，Lys-Thr-Ser ) 等，同时含有一定数量的二硫键。根据分子大小和二硫键数目分为4类(1) 短链解离素(41-51个氨基酸，4对二硫键)；(2)中链解离素(约70个氨基酸， 6对二硫键)；(3)长链解离素(83个氨基酸，7对二硫键)；(4)双链解离素(同 双链和异双链)。目前已发现的解离素大部分为中链解离素。
发明内容
本发明的目的是要提供一种应用色谱技术从短尾蝮蛇蛇毒(Gloydius brevicaudus venom， GBV)中分离纯化出具有抑制肿瘤血管生成，抗肿瘤侵袭、 转移等作用的中链解离素(解离素蛋白)；及其抗肿瘤侵袭、转移和肿瘤血管生 成作用和制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是
1、 短尾蝮蛇毒解离素的分离将粗毒先经Superdex 75凝胶过滤色谱去除 大分子组分，得到含解离素的主要蛋白峰；再用等电点差异分离蛋白的离子交 换层析法进一步分离；采用弱阴离子DEAEsepharose作为介质、三羟甲基氨基 甲烷(Tris)缓冲液作为洗脱液，使带负电荷的解离素与色谱柱上正电荷基团 结合，再通过增加离子强度使带负电荷的无机离子置换结合在色谱柱上的解离 素，即获得分离。所述的缓冲液pH为pH=8.5，盐浓度达0.05mol丄1，此时解 离素组分全部被洗脱，收集的组分可直接进行生化及药理活性的测定。
2、 解离素的纯化
应用凝胶过滤，再经离子交换色谱所得的活性组分，并非是单一蛋白的组 分，它是分子量和等电点相近的蛋白质或多肽的混合物。对于蝮科蛇毒，可抑 制ADP诱导的血小板聚集，分子量小于10000Da的除解离素外还有磷脂酶 A2(PLA2、。对于混有PLA2的解离素组分，依据解离素与PLA2的疏水性有较大
差异解离素疏水性小于PLA2，选用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，在C18 柱上用乙腈梯度洗脱将它们分离(疏水性小的应先出峰)。应用RP-HPLC除了 能去除解离素组分中的PLA2外，由于RP-HPLC纯化得到的蛋白质可以通过冻 干去除有机溶剂(乙腈)和离子对试剂(三氟乙酸)而得到蛋白质纯品，与离 子交换层析的纯化产物需要透析、浓縮相比；解离素含4 8对二硫键，性质十 分稳定，即使在高浓度的有机溶剂中也不致失活，这都是采用RP-HPLC纯化解 离素的依据所在。本发明在RP-HPLC精细纯化解离素组分时，有两个洗脱峰具 有血小板聚集抑制活性，分别对应于乙腈浓度23%和40%。经滴定法检测洗脱 峰的PLA2活力、电泳测定分子量大小及抑制血小板聚集活性的强弱，判定两个 洗脱峰中的后者是PLA2，前者为不含PLA2的解离素纯品，去除了混杂的PLA2。
本发明采用Superdex 75、 DEAE S印harose Fast Flow离子交换层析、 Lichrospher C18反相层析从短尾蝮蛇蛇毒粗毒中分离得到了一个解离素纯品 GbvIV4:
1 GEECDCGSPG NPCCDAATCK LRQGAQCAWG LCCDQCRIMK 41KGTVVRIACG DDMDCYYNGI SAGCPRNNF二
本发明的有益效果是本发明GBVIV4与其他已有的解离素有很高的同源 性，但是一种氨基酸序列全新的解离素蛋白，它有很强的抑制ADP和凝血酶诱 导的血小板聚集活性，这是因为它封闭了血小板膜受体-GPlIb-ffla的结合位点, 从而拮抗血小板聚集作用。这又从功能上说明GbvIV4是一种新的解离素。因此， 本发明解离素能抑制ADP及凝血酶诱导的血小板聚集，在体外具有较强的抗肿 瘤细胞粘附、迁移、侵袭活性。对人胃癌细胞株SGC-7901和人脐静脉内皮细胞 株ECV304均有抑制生长作用，还能抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用。
图1为短尾蝮蛇毒superdex 75凝胶过滤色谱分离得到7个蛋白峰，分别
记为GBVI、 II 、 III、 IV、 V、 VI、 W。测定各洗脱峰对血小板聚集的影响，发
现组分IV具有抑制血小板聚集的活性，初步鉴定为解离素组分(其余蛋白峰对
血小板聚集没有明显影响)。
图2短尾蝮蛇毒解离素的DEAE S印harose Fast Flow离子交换色谱 GBVIV用HiPr印DEAE S印harose Fast Flow 16/10柱进一步纯化，得到8
个蛋白峰，分别记为GBVIV1 8。经鉴定GBVIV4具有抑制血小板聚集作用。 图3短尾蝮蛇毒解离素的Lichrospher C18高效液相色谱 活性峰GBVIV4经预装柱Lichrospher C18 4. 6/250反相层析柱，得到7个
蛋白峰，分别测定这些洗脱峰的血小板聚集抑制活性，结果发现第一个主峰具
有强烈的血小板聚集抑制活性，暂定名为GBVIV4。
图4短尾蝮蛇毒解离素(GbvIV4)的分子量 质谱法测定GBVIV4分子量为7442Da。
具体实施例方式
本发明的具体方案由以下实施例给出。 实施例1:
分离取短尾蝮蛇粗毒0.5g溶于5ml 0.01 mol/L Tris-HC1缓冲液，4。C过 夜；低温(4°C) 10000r/min离心15分钟，取上清液上Superdex 75 pg柱(26 X800臓)，用含0. 15mol/L NaCl的0. Olraol/L Tris-HC1 (pH8. 0)缓冲液洗脱， 流速1.5ml/min，部分收集器收集洗脱液，3ml/管，紫外分光光度计测定洗脱液 在280nm波长处的光密度值(OD赢m)，根据002, 值的大小绘出洗脱曲线。短尾蝮 蛇粗毒经Superdex 75柱层析,分离得到7个蛋白峰，分别记为Gbv I 、 II 、 III、
iv、 v、 vi、 vn (附图i)。测定各洗脱峰对血小板聚集的影响，发现组分iv具 有抑制血小板聚集的活性，初步鉴定为解离素组分(其余蛋白峰对血小板聚集 没有明显影响)。经鉴定具有抑制血小板聚集活性的组分，经低温真空浓縮到适
当体积后用Sephadex G-25凝胶过滤脱盐。S印hadex G-25用双蒸水浸泡平衡并 装柱(22X850mm)。样品上样后用双蒸水洗脱，流速12 ml/h,部分收集器收集 洗脱液，3ml/管，紫外分光光度计测定OD，，绘制洗脱曲线。
纯化经S印hadex G-75纯化的峰GbvIV，以HiPr印DEAE S印harose Fast Flow 16/10预装柱在AKTA Explorer蛋白纯化系统上进行离子交换层析。洗脱 液配制A液为0.05mol/LpH8. 5的Tris缓冲液；B液为含lmol/L氯化钠的A 液。上样后以A液洗脱未结合的组分，之后增加B液进行线性梯度洗脱，洗脱 梯度为0—30%，洗脱速度为3 ml/min，收集3 ml/管。测定0D28。，绘制洗脱曲 线。结果得到8个蛋白峰，分别测定这些洗脱峰的血小板聚集抑制活性，结果 第4峰具有强烈的血小板聚集作用(附图2)。将上述具有血小板聚集抑制活性 的组分经Lichrospher C18 4.6/250反相色谱柱，在Waters 600E高效液相色 谱仪上进行层析分离。流动相A: 0. 1%TFA+5%ACN;流动相B: 0. 08% TFA+ 80% ACN。 线性梯度洗脱，0 50min从100% A到讓B。根据0D,的数值，手工收集各 洗脱峰。活性峰GbvIV4浓縮后上样于预装柱Lichro印her C18 4.6/250反相层析 柱，得到7个蛋白峰，分别测定这些洗脱峰的血小板聚集抑制活性，结果第一 个主峰具有强烈的血小板聚集抑制活性，暂定名为GbvIV4 (附图3)。
GbvIV4氨基酸序列分析和分子量测定测序结果显示GbvIV4由70个氨基 酸组成，首次发现其活性中心的三基序为CGD，而非RDG或KGD，其中含12个 半胱氨酸，可以组成6对二硫键，符合中链解离素特征。质谱法测定GbvIV4分 子量为7442Da。
将测序结果输入GenBank中进行同源性分析，发现500个blast hits具有 同源性。根据blast的结果，可以得出三点结论(1) GbvIV4分子中含有特征 性CGD三肽基序；(3)有7种已知解离素的氨基酸序列与GbvIV4序列的同源性 达到了80%以上；(2)未査到与GbvIV4 70个氨基酸完全一致的蛋白质序列，表明这是一种新的蛋白质。
本实例得到的解离素(GbvIV4)具有抑制肿瘤血管生成，抗肿瘤侵袭、转移
等作用。 SEQUENCE LISTING
〈110〉福建医科大学
〈120〉一种蛇毒抗肿瘤侵袭与转移的解离素
〈160〉 1 〈210〉 1 〈211〉 70 〈212〉 PRT
<213>短尾蝮蛇(Gloydius brevicaudus) <400> 1
Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys Asp 5 10 15
Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gin Gly Ala Gin Cys Ala Trp Gly
20 25 30
Leu Cys Cys Asp Gin Cys Arg lie Met Lys Lys Gly Thr Val Val
35 40 45
Arg lie Ala Cys Gly Asp Asp Met Asp Cys Tyr Tyr Asn Gly lie
50 55 60
Ser Ala Gly Cys Pro Arg Asn Asn Phe *
65 70
权利要求
1、一种短尾蝮蛇毒解离素的分离，其特征是将粗毒先经Superdex 75凝胶过滤色谱去除大分子组分，得到含解离素的主要蛋白峰；再用弱阴离子DEAEsepharose作为介质、三羟甲基氨基甲烷缓冲液作为洗脱液分离等电点不同，分子量相近的蛋白，最后以Lichrospher C18反相层析去除等电点相近疏水性不同的成分，从而纯化解离素，获得纯品。
全文摘要
本发明公开了一种蛇毒抗肿瘤侵袭与转移的解离素，属生化与生物医药领域。即应用色谱技术从短尾蝮蛇蛇毒中分离纯化出具有抑制肿瘤血管生成，抗肿瘤侵袭、转移等作用的中链解离素-GBVIV4。GBVIV4与其他解离素有很高的同源性，是一种氨基酸序列全新的解离素蛋白，有很强的抑制ADP和凝血酶诱导的血小板聚集活性，因为它封闭了血小板膜受体-GPIIb-IIIa的结合位点，从而拮抗血小板聚集作用。因此，本发明解离素能抑制ADP及凝血酶诱导的血小板聚集，在体外具有较强的抗肿瘤细胞粘附、迁移、侵袭活性。对人胃癌细胞株SGC-7901和人脐静脉内皮细胞株ECV304均有抑制生长作用，还能抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用。
文档编号C07K14/46GK101177452SQ20071000964
公开日2008年5月14日 申请日期2007年10月11日 优先权日2007年10月11日
发明者许云禄, 陈晓春 申请人:福建医科大学