专利名称：负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，更具体涉及到一种负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞肿瘤疫苗，本发明还涉及该疫苗的制备方法和在制备抗肿瘤药中的应用。
背景技术：
1.树突状细胞肿瘤疫苗肿瘤是仅次于心血管疾病，严重威胁人类生命的第二号“杀手”。现行的三大肿瘤治疗方法(手术、放疗与化疗)虽能缓解症状，但多数患者在经受手术、大剂量放、化疗的痛苦之后仍难以存活，且遇晚期肿瘤、肿瘤复发或肿瘤转移，则效果甚微，乃至无计可施。
免疫学突破性的研究进展为肿瘤免疫治疗提供了理论基础。肿瘤细胞是一种变异的细胞，表达区别于机体正常细胞的肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)，人体免疫系统能够识别、区分这些异已抗原，激活机体免疫系统，不断地清除机体内恶变的细胞，称之为人体的免疫监视能力(Immune Surveillance)。其间，一类特殊免疫细胞树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)起着举足轻重的作用。它是至今为止发现的体内功能最为强大的专职性抗原递呈细胞，表达丰富的抗原捕获分子(如MMR，DEC205，FcRs，TLRs)、抗原递呈分子(如MHC-I，MHC-II，CD1)及免疫共刺激分子(如CD80，CD86，CD40等)。捕获肿瘤抗原的DCs迁移至淋巴结，将加工、处理后的抗原信息递呈给T淋巴细胞(提供激活T淋巴细胞特异性第一信号)，同时其表面的免疫共刺激分子提供激活T淋巴细胞第二信号。T细胞经激活分化为具有特异性杀伤肿瘤细胞功能的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
鉴于树突状细胞强大的摄取、加工、递呈抗原以及激活特异性T淋巴细胞免疫应答的功能。体外用肿瘤抗原冲击树突状细胞，将携带肿瘤抗原信号的树突状细胞回输体内，激发机体主动特异性抗肿瘤细胞免疫应答，达到清除肿瘤细胞的功效，并在体内诱异免疫记忆，防止肿瘤的复发，该免疫治疗方法被认为是当今最先进、最有希望的肿瘤生物治疗手段。这种携带肿瘤抗原信号，启动/激发机体特异性抗肿瘤免疫反应的功能性树突状细胞统称为“树突状细胞肿瘤疫苗”(DC-based tumor vaccines)。
2.现有树突状细胞肿瘤疫苗种类及不足用人工合成的已知肿瘤抗原肽、肿瘤抗原蛋白、编码肿瘤抗原RNA、肿瘤细胞裂解液、肿瘤细胞提取物、凋亡肿瘤细胞等不同形式和来源的肿瘤抗原体外负载/冲击树突状细胞而制备的肿瘤疫苗均有报道。然而，1)迄今为止，已知的肿瘤特异性抗原种类有限，且存在MHC(主要组织相容性复合物)限制性，使得此类树突状细胞肿瘤疫苗的应用受到严重限制；2)一种类型的肿瘤存在不止一种肿瘤抗原，而是由多种肿瘤抗原构成的独特肿瘤抗原库(Antigen Repertoire)，故仅负载某种肿瘤抗原肽、蛋白或RNA的树突状细胞肿瘤疫苗将给予体内肿瘤细胞逃避免疫监视的机会；3)用肿瘤细胞裂解液、肿瘤细胞提取物、肿瘤细胞RNA作为抗原负载树突状细胞以及肿瘤细胞与树突状细胞的融合疫苗均可诱导、激活针对多种肿瘤抗原的T淋巴细胞克隆，防止因使用单个或已知几种肿瘤抗原负载树突状细胞所造成的免疫缺失，但其繁琐的抗原制备过程、生物/化学试剂的添加等不同程度地破坏肿瘤抗原或使肿瘤抗原丢失、RNA转染以及细胞融合效率的难以确定等多种因素均影响着树突状细胞肿瘤疫苗的功效。
3.热休克蛋白与树突状细胞肿瘤疫苗肿瘤抗原的抗原性(Antigenicity)、免疫原性(Immunogenicity)及抗原负载体系(Antigen Delivery System)是影响树突状细胞肿瘤疫苗功效的重要参数。以编码免疫刺激分子(GM-CSF，CD80，IL-2等)以及热休克蛋白HSP70，gp96等基因修饰肿瘤细胞或树突状细胞，以期提高树突状细胞肿瘤疫苗免疫反应性的方法不断有所报道。
热休克蛋白(HSPs)是存在于细胞浆和内质网膜内的蛋白质家族，由多个成员组成如HSP60，HSP70，HSP90及gp96等。高温、缺氧、辐射等应急状态均能不同程度地诱导热休克蛋白的表达。热休克蛋白作为分子伴侣(Chaperons)在蛋白合成后的折叠、转运，变性蛋白质的复性等过程中发挥重要作用。HSPs能结合细胞内5-25mer的多肽(包括肿瘤或病毒特异性抗原多肽)形成HSP-多肽复合物，参与多肽在胞浆网膜系统内的转运。
Srivastava发现从肿瘤细胞或病毒感染细胞中提取的HSP-抗原多肽复合物免疫动物后能引起针对该肿瘤或病毒的特异性T淋巴细胞免疫应答，而仅免疫多肽或仅免疫HSP则不能诱导特异性免疫应答[1]。基于这一发现，美国Antigenics公司(www.antigenics.com)将从患者肿瘤组织或肿瘤细胞中提取的gp96及HSP70-多肽复合物免疫肿瘤患者，相应产品(Oncophage和AG-858)已获FDA批准进入I-II期临床试验。近期又发现树突状细胞表面存在多种HSPs的分子受体如CD91，CD40，LOX1，TLR2/4等，并证明HSPs能够介导外源性抗原多肽向HLA-I类与HLA-II类分子的递呈[2，3]。另又发现HSP60，HSP70，gp96自身能诱导树突状细胞表达免疫共刺激分子(CD83，CD80，MHC-I)和免疫活性因子(MIP，TNFa，IL-12与IP-10等)从而活化自然杀伤细胞(NK)，NKT细胞、中性粒细胞等诱导并扩大非特异性免疫应答，故HSPs有“天然免疫佐剂”的作用[4]。
1.Srivastava PK.Immunotherapy for human cancer using heat shockprotein-Peptide complexes.Curr Oncol Rep.2005 Mar；7(2)104-8.
2.Binder RJ，Vatner R，Srivastava P.The heat-shock protein receptorssomeanswers and more questions.Tissue Antigens.2004 Oct；64(4)442-51.
3.SenGupta D，Norris PJ，Suscovich TJ，et al.Heat shock protein-mediatedcross-presentation of exogenous HIV antigen on HLA class I and class II.JImmunol.2004 Aug 1；173(3)1987-93.
4.Binder RJ，Srivastava PK.Essential role of CD91 in re-presentation ofgp96-chaperoned peptides.
Proc Natl Acad Sci USA.2004 Apr 20；101(16)6128-33.
我国曹雪涛教授等提取热处理后肿瘤细胞的外排体体外冲击树突状细胞(专利申请号02145022.6，名称一种新型高效非细胞性疫苗的制备及其用途)，实验结果显示能激活树突状细胞和T淋巴细胞，有效诱导抗原特异性和非特异性的免疫应答反应，增强机体免疫功能。但上述(包括Antigenics公司)制备HSP-抗原肽复合物过程复杂、繁琐，不可避免造成对抗原的破坏、抗原的降解、以及抗原的丢失，从而影响肿瘤抗原谱或抗原肽库的完整性，同时亦增加了操作过程中污染控制的难度。
发明内容
本发明的一个目的是为了克服上述树突状细胞肿瘤疫苗的缺陷，提高树突状细胞肿瘤疫苗的免疫反应性和功效，提供一种制备简捷、快速、高效的负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞肿瘤疫苗。
本发明的另一个目的是提供上述树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述树突状细胞肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药中的应用。
本发明技术方案的理论基础是利用热休克法诱导肿瘤细胞高效表达多种HSPs，在此基础上诱导肿瘤细胞凋亡(Apoptosis)，再将完整的富含热休克蛋白的凋亡肿瘤细胞负载树突状细胞制备树突状细胞肿瘤疫苗。树突状细胞可将负载的上述肿瘤细胞所含有的肿瘤抗原递呈至表面，激活T淋巴细胞对该肿瘤产生特异性细胞免疫应答。
本发明的目的是通过下列措施实现的一种负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞肿瘤疫苗，它是通过下列步骤制备获得的1).热休克法处理肿瘤细胞；2).富含热休克蛋白的凋亡肿瘤细胞的制备热休克法处理后的肿瘤细胞回复至37℃培养适当时间，得富含热休克蛋白的肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞的凋亡，收集凋亡的热休克肿瘤细胞，备用；3).体外诱导树突状细胞；4).富含热休克蛋白的凋亡肿瘤细胞负载树突状细胞将按上述方法制备的凋亡的热休克肿瘤细胞与树突状细胞混合培育，共同培育后按常规离心法收集负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞，制备成树突状细胞肿瘤疫苗。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其中热休克法处理肿瘤细胞是将肿瘤细胞于39℃-43℃加热培养30分钟至4小时。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其中诱导肿瘤细胞凋亡的方法是生物法、物理法；其中生物法采用抗肿瘤药物处理肿瘤细胞或采用无血清培养法处理肿瘤细胞，物理法采用同位素射线、紫外线、缺氧或加热方式处理肿瘤细胞。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其中体外诱导树突状细胞是通过取单个核细胞培养一定时间后，洗去未贴壁细胞，加入含GM-CSF和IL-4的细胞因子组合、GM-CSF和IL-15的细胞因子组合、GM-CSF和IFNα的细胞因子组合、或者GM-CSF和TNFα的细胞因子组合的培养基诱导成单核细胞来源的树突状细胞；或者，取CD34+前体造血细胞，加入含GM-CSF、TNFa和Flt3-L细胞因子的培养基诱导成CD34-DCs。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其中单个核细胞、CD34+前体造血细胞来源于自体外周血、或者脐带血、或者HLA主要配型相合者的外周血。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其中凋亡的热休克肿瘤细胞负载树突状细胞时所加入的凋亡的热休克肿瘤细胞与树突状细胞的数量比例为1∶1-3。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，它包括下列步骤
1).热休克法处理肿瘤细胞；2).富含热休克蛋白的凋亡肿瘤细胞的制备热休克法处理后的肿瘤细胞回复至37℃培养适当时间，得富含热休克蛋白的肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞的凋亡，收集凋亡的热休克肿瘤细胞，备用；3).体外诱导树突状细胞；4).富含热休克蛋白的凋亡肿瘤细胞负载树突状细胞将按上述方法制备的凋亡的热休克肿瘤细胞与树突状细胞混合培育，共同培育后按常规离心法收集负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞，制备成树突状细胞肿瘤疫苗。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其中热休克法处理肿瘤细胞是将肿瘤细胞于39℃-43℃加热培养30分钟至4小时。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其中诱导肿瘤细胞凋亡的方法是生物法、物理法；其中生物法采用抗肿瘤药物处理肿瘤细胞或采用无血清培养法处理肿瘤细胞，物理法采用同位素射线、紫外线、缺氧或加热方式处理肿瘤细胞。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其中体外诱导树突状细胞是通过取单个核细胞一定时间后，洗去未贴壁细胞，加入含GM-CSF和IL-4的细胞因子组合、GM-CSF和IL-15的细胞因子组合、GM-CSF和IFNα的细胞因子组合、或者GM-CSF和TNFα的细胞因子组合的培养基诱导成单核细胞来源的树突状细胞；或者取CD34+前体造血细胞，加入含GM-CSF、TNFa和Flt3-L细胞因子的培养基诱导成CD34-DCs。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其中单个核细胞、CD34+前体造血细胞前体造血细胞来源于自体外周血、或者脐带血、或者HLA主要配型相合者的外周血。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其中凋亡的热休克肿瘤细胞负载树突状细胞时所加入的凋亡的热休克肿瘤细胞与树突状细胞的数量比例为1∶1-3。
所述的树突状细胞肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药中的应用。
本发明的有益效果1.与基因转染法、化学法等比较，热休克法处理肿瘤细胞具有操作简单、无须复杂仪器设备和化学试剂、且可迅速、高效诱导多种热休克蛋白表达等诸多优点；1)采用本发明热休克法对肿瘤细胞株SKmel28，HepG-2，Me275，Me290以及MCF7处理的效果分别将肿瘤细胞株SKmel28，HepG-2，Me275，Me290以及MCF7置于5％CO2，42℃细胞培养箱内2小时、4小时或42℃4小时后再加入凋亡诱导剂BA(BetulinicAcid，BA)于5％CO2，37℃细胞培养箱继续培育24小时。收集肿瘤细胞，加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂制备细胞匀浆，12000rpm，4℃离心20min，收集上清液。Micro BSATM法(Pierce，USA)及ELISA法(Stressgenes，Canada)分别检测细胞匀浆上清液中总蛋白及HSP60与HSP70水平。HSPs含量表达为ng/mg.Pr.。热休克前后肿瘤细胞内HSP60与HSP70蛋白水平的变化结果见图1，结果表明肿瘤细胞经过热休克处理后HSP60与HSP70含量明显增加，并且经诱导凋亡后HSP60与HSP70含量仍然较高。
2)基因转染法与热休克法诱导肿瘤细胞表达热休克蛋白效果比较收集肿瘤细胞株SKmel28、egfp或热休克蛋白gp96逆转录病毒载体转染的SKmel28细胞株(SKmel28-egfp和SKmel28-gp96-egfp)，以及热休克法和BA处理的SKmel28细胞，制备细胞匀浆、细胞上清液及上清液总蛋白含量检测方法同1)。上清液进行8％SDS-PAGE电泳(20ug总蛋白/泳道)后转印至PDVF膜上，用鼠抗人gp96 mAb(SPA-851，Stressgenes，Canada)及羊抗鼠二抗依次与膜共育，Fluoro BlotTMperoxidasesubstrate(Pierce)作显色系统。每泳道所加样本如下所示1.SKmel28，2.SKmel28-egfp，3.SKmel28-gp96-egfp，4.SKmel28，42℃2h，5.SKmel28，42℃4h，6.SKmel28，42℃4h+BA 24h，7.SKmel28，BA 24h，M.Protein weight marker。结果见图2，结果表明热休克法效果较好，诱导的gp96含量较高。
图1、2表明热休克法处理的肿瘤细胞表达HSP的种类多、含量较高。
2.热休克法可增加肿瘤细胞的抗原性热休克法诱导肿瘤基因MAGEB3，MAGEB4的表达将Me290细胞株置5％CO2，37℃(Me290un)，或42℃4h(Me290 heat)，或加入Actinomycin D，42℃4h(Me290 heat/Act D)；收集细胞，按试剂盒说明书抽提总RNA，逆转录为cDNA后进行实时定量PCR(RT-PCR，_TaqMan PDARs试剂盒)，GAPDH基因作为内对照。纵轴数字表示MAGEB3，MAGEB4基因表达水平与GAPDH基因表达水平的比值，结果见图3，结果表明热休克法可诱导肿瘤基因的表达水平，从而增加肿瘤细胞的抗原性。
3.肿瘤细胞内HSPs的高表达可增加肿瘤抗原肽与HSPs形成复合物的机会，减少新生肿瘤抗原肽被降解的可能性，同时HSPs具有天然免疫佐剂的功能，将增强肿瘤细胞的抗原性与免疫原性。
4.由于本发明采用凋亡的肿瘤细胞作为抗原来源，凋亡肿瘤细胞浆膜是完整的，提供了保护肿瘤抗原的良好环境，不会因裂解细胞释放的酶类、抗原提取过程中添加生化或化学物质导致蛋白变性或降解，因而保持肿瘤细胞的抗原性与肿瘤抗原肽库的完整性。
用整个凋亡肿瘤细胞作为抗原，由树突状细胞去识别、加工并递呈相应的多种肿瘤抗原或多个抗原位点(epitopes)，可诱导、激活针对肿瘤细胞表达的多种肿瘤抗原的多个T细胞克隆(CD4+T与CD8+T，疫苗的多价性)，降低因使用单个或已知几种肿瘤抗原负载树突状细胞所造成肿瘤逃避免疫监视的风险。
6.树突状细胞表达多种HSPs(HSP60，HSP70和gp96等)受体，用高表达HSPs的凋亡肿瘤细胞作为抗原负载树突状细胞，将有利于树突状细胞通过HSP受体介导的高效抗原摄取，提高肿瘤细胞的负载效率。
1)凋亡的热休克肿瘤细胞SKmel28、凋亡细胞(未热休克)SKmel28细胞标记7-AAD与CD11c-APC标记的单核细胞来源的树突状细胞(MDDCs)按1∶3，1∶1，3∶1比例共同培育3h，加入0.05％胰酶/0.02％EDTA PBS缓冲液反应5min，洗涤离心后，用PBS悬浮细胞作流式细胞分析。每个样本至少采集50000个细胞。流式图中数字为CD11c-APC与7-AAD双阳性树突状细胞(吞噬凋亡细胞的树突状细胞)占树突状细胞总数(CD11c-APC阳性)的百分比。结果见图4，结果显示凋亡的热休克肿瘤细胞有助于树突状细胞的摄取。
2)共聚焦显微镜技术进一步证实树突状细胞能吞噬凋亡肿瘤细胞MDDCs与凋亡肿瘤细胞Me275共同培育3小时。收集细胞，作常规染色，以鼠抗人CD1a-FITC标记MDDCs，gp100-Texas-Red标记肿瘤细胞。用Leica TCS-NT SP共聚焦显微镜(FITC 510-550nm，Texas-Red 580-660nm，Bars＝10um)进行检测。结果见图5。
7.富含HSPs的凋亡肿瘤细胞与MDDCs共同孵育，可诱导MDDCs的成熟MDDCs分别与凋亡的热休克或凋亡(未经热休克)肿瘤细胞Me275(1∶1)共同培育24小时。收集细胞，作常规染色。以鼠抗人CD11c-APC，HLA-DR-PerCP，和CD80-PE或CCR7-PE单抗染色细胞后，作流式细胞分析。结果见图6，结果表明凋亡的热休克肿瘤细胞可诱导CD80，HLA-DR与CCR7的表达，增加树突状细胞的免疫激发能力及向淋巴结迁移的能力。
8.凋亡的热休克肿瘤细胞负载的树突状细胞具有更强的免疫激发能力GM-CSF/IL-4体外诱导的HLA-A201+健康志愿者MDDCs与凋亡的热休克肿瘤细胞共育2小时后，经流式细胞仪分选出MDDCs并加入细胞因子使之成熟。从同一份外周血单个核细胞中分离出CD45RA+CD8+CCR7+CD45RO-的处女型T(Naive CD8T)淋巴细胞；用成熟树突状细胞反复刺激T淋巴细胞2次，每周一次。收集刺激的T淋巴细胞(CTL)，用经典的4小时51Cr释放试验检测CTL杀伤活性。CTL1为未负载肿瘤抗原的树突状细胞刺激的CD8T淋巴细胞，CTL2为用负载凋亡肿瘤细胞的树突状细胞所刺激的CD8T淋巴细胞；CTL3为用负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞所刺激的CD8T淋巴细胞。实验结果来自三个独立健康志愿者，以均值+/-标准差表示，结果见图7。结果表明负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞体外刺激的CD8T淋巴细胞具有较强的特异性肿瘤杀伤能力(4h-51Cr-Releasing Assay)。同时，负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞体外致敏的CD8T淋巴细胞具有较强的抑制肿瘤细胞回复生长的能力(Tumor inhibitioncapacity)。
9.简便、安全、无毒在本疫苗制备体系中，无外源质粒、载体、化学试剂等的掺入，且操作简便，无须预先研究、合成或分离肿瘤抗原并省略复杂的MHC分型操作。
图1是热休克前后肿瘤细胞内HSP60与HSP70蛋白水平变化。
图2是热休克法与基因转染法诱导肿瘤细胞gp96表达水平的比较。
图3是热休克法诱导肿瘤基因MAGEB3，MAGEB4的表达。
图4是凋亡的热休克肿瘤细胞SKmel28、凋亡的未热休克肿瘤细胞与MDDC细胞共育后流式细胞分析对照图。
图5是共聚焦显微镜技术证实MDDCs摄取凋亡肿瘤细胞照片。
图6是凋亡的热休克肿瘤细胞可诱导MDDCs成熟(流式细胞分析)。
图7是负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞体外刺激的CD8T淋巴细胞具有较强的特异性肿瘤杀伤能力。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
以下实施例中所用的细胞因子购于R&D公司(USA)。
混合人AB血清系由AB型血型的健康志愿者血清混合而成的市售血清制品。
实施例1负载凋亡的热休克黑色素瘤细胞Me290的MDDC肿瘤疫苗1.热休克法处理黑色素瘤细胞Me290
将黑色素瘤细胞Me290接种于10％FCS的RPMI1640细胞培养基中，将细胞移至5％CO2，42℃细胞培养箱或42℃水浴，加热培养2h。
2.诱导热休克后的Me290细胞凋亡将上述热休克后的Me290细胞移回至5％CO2，37℃细胞培养箱内继续培养，同时加入BA(植物中提取的抗癌药物，购自Sigma公司)，作用浓度为10ug/ml，继续培养48h后，离心法收集凋亡的肿瘤细胞，用PBS洗涤3次，最后将收集的肿瘤细胞悬浮于RPMI1640培养基中，经100GY的γ-射线照射后使用。
3.体外诱导MDDCs(单核细胞来源的树突状细胞，下同)采集新鲜肝素抗凝的黑色素瘤患者外周血，经Ficoll梯度离心后获得外周单个核细胞(PBMNCs)，将PBMNCs悬浮于含2％灭活混合人AB血清的RPMI1640培养基中，细胞浓度为2-3×106/ml；按每孔3ml接种细胞于6孔细胞培养板内，于5％CO2，37℃细胞培养箱内放置1h使单核细胞贴壁，用PBS缓冲液轻轻洗涤培养孔以除去未贴壁细胞；于每孔加入3ml含100ng/ml重组人GM-CSF，25ng/ml IL-4和5％灭活混合人AB血清的RPMI1640培养基。于诱导第3天，每孔轻轻吸去1ml培养上清，重新加入1ml新鲜配制的RPMI1640培养基及细胞因子继续诱导。
4.凋亡的热休克Me290细胞负载自体MDDCs收集诱导第5天的自体MDDCs，悬浮于5％自体灭活血清或5％灭活混合人AB血清的RPMI1640培养基中，按1∶1细胞数量比例于MDDCs中加入上述制备的凋亡的热休克Me290细胞，共育48小时。常规离心法洗涤、收集负载了凋亡的热休克Me290细胞的MDDCs，按适当浓度悬浮于生理盐水中，即得负载凋亡的热休克Me290细胞的树突状细胞疫苗。
实施例2负载凋亡的热休克肝癌细胞的MDDC肿瘤疫苗1.肝癌样本的处理取新鲜肝癌组织(手术或穿刺)即刻放置于无菌容器中。保存液为新鲜配制的含双抗(青/链霉素)的RPMI1640培养基。将剪碎的肝癌组织块置于无菌注射器内反复研磨，最后将细胞悬浮于保存液内，200目滤网过滤制备成单细胞悬液。
2、热休克肝癌细胞将上述制备的肝癌细胞悬液接种于含有2％混合人AB血清的RPMI1640细胞培养基中，置5％CO2，40℃细胞培养箱或40℃水浴，加热培养3h。
3.诱导热休克后的肝癌细胞凋亡将上述热休克后的肝癌细胞移至5％CO2，37℃细胞培养箱内，加入5-FU(5-氟尿嘧啶)继续培养36小时后，收集凋亡的肝癌细胞，以PBS洗涤3次，最后将收集的凋亡的肝癌细胞悬浮于RPMI 1640培养基中，经100GY的γ-射线照射后使用。
3.体外诱导MDDCs取肝素抗凝的肝癌患者自体外周血经Ficoll分离后获得外周单个核细胞(PBMNCs)，将PBMNCs悬浮于含2％灭活人AB血清的RPMI1640培养基中，细胞浓度为2-3×106/ml；按每孔3ml接种细胞于6孔细胞培养板，于5％CO2，37℃细胞培养箱内放置1h使单核细胞贴壁，用PBS缓冲液轻轻洗涤培养孔以除去未贴壁细胞；于每孔加入3ml含100ng/ml重组人GM-CSF、100ng/ml IL-15(R&D，USA)和5％灭活混合人AB血清的RPMI1640培养基。于诱导第3天，轻轻吸去1ml培养上清，重新加入1ml新鲜配制的培养基和细胞因子继续诱导。
4.将凋亡的热休克肝癌细胞负载自体MDDCs于诱导第5天的MDDCs中，按1∶1细胞数量比例加入上述制备的凋亡的热休克肝癌细胞，共育48小时后，常规离心法洗涤、收集负载了凋亡的热休克肝癌细胞的MDDCs，悬浮于生理盐水中，即得负载凋亡的热休克肝癌细胞的MDDC疫苗。
实施例3负载凋亡的热休克乳腺癌细胞MCF7的CD34-DC肿瘤疫苗1.热休克法处理乳腺癌细胞MCF7将乳腺癌细胞MCF7接种于10％FCS的RPMI1640细胞培养基中，于5％CO2，37℃细胞培养箱培育12h后，将细胞移至5％CO2，43℃细胞培养箱或43℃水浴，加热培养4h。
2.诱导热休克后的MCF7乳腺癌细胞凋亡将上述热休克后的MCF7肿瘤细胞回至5％CO2，37℃细胞培养箱内继续培养24小时后，收集MCF7肿瘤细胞。经150GYγ-射线照射后，于5％CO2，37℃细胞培养箱无血清培养36小时，收集凋亡的MCF7肿瘤细胞，悬浮于RPMI1640培养基中。
3.体外分离纯化CD34+造血前体细胞，诱导CD34-DCs(CD34+造血前体细胞诱导成的树突状细胞)。
取乳腺癌患者外周血(经G-CSF造血动员后)，Ficoll分离获得外周单个核细胞(PBMNCs)，加入CD34单克隆抗体包被的磁珠分离纯化得到CD34+造血前体细胞(纯度＞90％)，将其悬浮于含5％灭活混合人AB血清的X-VIVO培养基中，培养基中含GM-CSF(50ng/ml)，TNFa(10ng/ml)，Flt3-L(100ng/ml)。培养第5天补充新鲜培养基与细胞因子，观察并及时调整细胞密度。
4.凋亡的热休克MCF7细胞负载自体CD34-DCs收集诱导培养第9天的CD34-DCs，悬浮于含5％灭活混合人AB血清的X-VIVO培养基中，按CD34-DCs与凋亡的热休克MCF7细胞之间细胞数量比为2∶1的比例加入上述制备的凋亡的热休克MCF7细胞，共育时间48小时后，收集负载了凋亡的热休克MCF7细胞的CD34-DCs，悬浮于无菌PBS中，即得负载凋亡的热休克乳腺癌细胞MCF7的CD34-DC肿瘤疫苗。
实施例4负载凋亡的热休克的胸水肿瘤细胞的MDDCs肿瘤疫苗1.热休克法处理转移到胸水中的肿瘤细胞无菌采集肿瘤患者的胸水(含转移肿瘤细胞)，离心法收集肿瘤细胞，PBS洗涤2次后将细胞悬浮于含2％混合人AB血清的RPMI1640细胞培养基中，于5％CO2，42℃细胞培养箱或42℃水浴，加热培养4h。
2.诱导热休克后的肿瘤细胞凋亡将上述热休克后的肿瘤细胞移回至5％CO2，37℃细胞培养箱内继续培养24小时后，收集肿瘤细胞。经150GY γ-射线照射后，于5％CO2，37℃细胞培养箱无血清培养36小时，收集凋亡肿瘤细胞，悬浮于RPMI1640培养基中。
3.体外诱导异体MDDCs取肝素抗凝的与肿瘤患者HLA主要配型相符的健康志愿者外周血，经Ficoll分离后获得外周单个核细胞(PBMNCs)，将PBMNCs悬浮于含2％灭活人AB血清的RPMI1640培养基中，细胞浓度为2-3×106/ml；按每孔3ml接种细胞于6孔细胞培养板，于5％CO2，37℃细胞培养箱内放置1h使单核细胞贴壁，用PBS缓冲液轻轻洗涤培养孔以除去未贴壁细胞；于每孔加入3ml含100ng/ml重组人GM-CSF、200ng/ml IFNa(R&D，USA)和5％灭活混合人AB血清的RPMI1640培养基。于诱导第3天，轻轻吸去1ml培养上清，重新加入1ml新鲜配制的培养基继续诱导。
4.将凋亡的热休克胸水肿瘤细胞负载异体MDDCs于诱导第5天的MDDCs中，按MDDCs与凋亡的热休克的胸水肿瘤细胞之间细胞数量比为1∶1的比例加入上述制备的凋亡的热休克的胸水肿瘤细胞，共育48小时后，常规离心法洗涤、收集负载了凋亡的热休克胸水肿瘤细胞的MDDCs，悬浮于生理盐水中，即得负载凋亡的热休克胸水肿瘤细胞的MDDC肿瘤疫苗。
实施例5负载凋亡的热休克的CML患者白血病细胞的CD34-DCs疫苗1.热休克法处理CML白血病细胞取肝素抗凝的CML(慢性粒细胞性白血病)患者外周血，Ficoll分离后获得外周单个核细胞(PBMNCs)，将PBMNCs悬浮于含2％混合人AB血清的RPMI1640培养基中，作为白血病细胞，置于5％CO2，42℃细胞培养箱或42℃水浴中加热培养2h，将细胞置于5％CO2，37℃细胞培养箱，同时加入MTX(氨甲蝶呤)，继续培育24h，离心收集白血病细胞，经100GYγ-射线照射后使用。
2.体外诱导CD34-DCs取新鲜肝素抗凝脐带血(HLA主要配型相符)，Ficoll分离后获得外周单个核细胞(PBMNCs)，加入CD34单抗磁珠分离纯化得到CD34+造血前体细胞(纯度＞90％)，将其悬浮于含5％混合人AB灭活血清的X-VIVO培养基中。于培养基中加入GM-CSF(50ng/ml)、TNFa(10ng/ml)和Flt3-L(100ng/ml)。培养第5天补充新鲜培养基与细胞因子，观察并及时调整细胞密度。
3.热休克凋亡白血病细胞负载CD34-DCs收集诱导第9天的CD34-DCs，悬浮于5％混合人AB灭活血清的X-VIVO培养基中，按1∶1细胞数量比例加入上述制备的热休克凋亡白血病细胞，共育时间36小时。常规离心法收集负载了凋亡的热休克白血病细胞的CD34-DCs，悬浮于生理盐水中，即得负载凋亡的热休克白血病细胞的树突状细胞疫苗。
实施例6负载凋亡的热休克腹水肿瘤细胞的MDDCs疫苗1.热休克法处理腹水肿瘤细胞无菌采集晚期肿瘤转移患者的腹水(含转移肿瘤细胞)，离心法收集肿瘤细胞，PBS洗涤2次后将细胞悬浮于含2％混合人AB血清的RPMI1640细胞培养基中，于5％CO2，42℃细胞培养箱或42℃水浴，加热培养4h。
2.诱导热休克后的肿瘤细胞凋亡将上述热休克后的肿瘤细胞移回至5％CO2，37℃细胞培养箱内继续培养24小时，收集肿瘤细胞，经150GYγ-射线照射后，于5％CO2，37℃细胞培养箱无血清培养24小时，收集凋亡肿瘤细胞，悬浮于RPMI1640培养基中。
3.体外分离纯化CD34+造血前体细胞，诱导CD34-DCs取经G-CSF造血动员的新鲜肝素抗凝健康志愿者外周血(HLA主要配型相符)，Ficoll分离后获得外周单个核细胞(PBMNCs)，加入CD34单抗磁珠分离纯化得到CD34+造血前体细胞(纯度＞90％)，将其悬浮于含5％混合人AB灭活血清的X-VIVO培养基中。于培养基中加入GM-CSF(50ng/ml)、TNFa(10ng/ml)和Flt3-L(100ng/ml)。培养第5天补充新鲜培养基与细胞因子(同前)，观察并及时调整细胞密度。
4.凋亡的热休克腹水肿瘤细胞负载CD34-DCs收集诱导培养第9天的CD34-DCs，悬浮于5％混合人AB灭活血清的X-VIVO培养基中，按1∶1细胞数量比例加入上述制备的凋亡的热休克腹水肿瘤细胞，共育48小时。常规离心法收集负载了凋亡的热休克腹水肿瘤细胞的CD34-DCs，悬浮于生理盐水中，即得负载凋亡的热休克腹水肿瘤细胞的树突状细胞的CD34-DCs疫苗。
权利要求
1.一种负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于它是通过下列步骤制备获得的1).热休克法处理肿瘤细胞；2).富含热休克蛋白的凋亡肿瘤细胞的制备热休克法处理后的肿瘤细胞回复至37℃培养适当时间，得富含热休克蛋白的肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞的凋亡，收集凋亡的热休克肿瘤细胞，备用；3).体外诱导树突状细胞；4).富含热休克蛋白的凋亡肿瘤细胞负载树突状细胞将按上述方法制备的凋亡的热休克肿瘤细胞与树突状细胞混合培育，共同培育后按常规离心法收集负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞，制备成树突状细胞肿瘤疫苗。
2.根据权利要求1所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于热休克法处理肿瘤细胞是将肿瘤细胞于39℃-43℃加热培养30分钟至4小时。
3.根据权利要求1所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于诱导肿瘤细胞凋亡的方法是生物法、物理法；其中生物法采用抗肿瘤药物处理肿瘤细胞或采用无血清培养法处理肿瘤细胞，物理法采用同位素射线、紫外线、缺氧或加热方式处理肿瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于体外诱导树突状细胞是通过取单个核细胞培养一定时间后，洗去未贴壁细胞，加入含GM-CSF和IL-4的细胞因子组合、GM-CSF和IL-15的细胞因子组合、GM-CSF和IFNα的细胞因子组合、或者GM-CSF和TNFα的细胞因子组合的培养基诱导成单核细胞来源的树突状细胞；或者，取CD34+前体造血细胞，加入含GM-CSF、TNFa和Flt3-L细胞因子的培养基诱导成CD34-DCs。
5.根据权利要求4所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于单个核细胞、CD34+前体造血细胞来源于自体外周血、或者脐带血、或者HLA主要配型相合者的外周血。
6.根据权利要求1所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于凋亡的热休克肿瘤细胞负载树突状细胞时所加入的凋亡的热休克肿瘤细胞与树突状细胞的数量比例为1∶1-3。
7.如权利要求1所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于它包括下列步骤1).热休克法处理肿瘤细胞；2).富含热休克蛋白的凋亡肿瘤细胞的制备热休克法处理后的肿瘤细胞回复至37℃培养适当时间，得富含热休克蛋白的肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞的凋亡，收集凋亡的热休克肿瘤细胞，备用；3).体外诱导树突状细胞；4).富含热休克蛋白的凋亡肿瘤细胞负载树突状细胞将按上述方法制备的凋亡的热休克肿瘤细胞与树突状细胞混合培育，共同培育后按常规离心法收集负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞，制备成树突状细胞肿瘤疫苗。
8.根据权利要求7所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于热休克法处理肿瘤细胞是将肿瘤细胞于39℃-43℃加热培养30分钟至4小时。
9.根据权利要求7所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于诱导肿瘤细胞凋亡的方法是生物法、物理法；其中生物法采用抗肿瘤药物处理肿瘤细胞或采用无血清培养法处理肿瘤细胞，物理法采用同位素射线、紫外线、缺氧或加热方式处理肿瘤细胞。
10.根据权利要求7所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于体外诱导树突状细胞是通过取单个核细胞一定时间后，洗去未贴壁细胞，加入含GM-CSF和IL-4的细胞因子组合、GM-CSF和IL-15的细胞因子组合、GM-CSF和IFNα的细胞因子组合、或者GM-CSF和TNFα的细胞因子组合的培养基诱导成单核细胞来源的树突状细胞；或者取CD34+前体造血细胞，加入含GM-CSF、TNFa和Flt3-L细胞因子的培养基诱导成CD34-DCs。
11.根据权利要求10所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于单个核细胞、CD34+前体造血细胞前体造血细胞来源于自体外周血、或者脐带血、或者HLA主要配型相合者的外周血。
12.根据权利要求7所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于凋亡的热休克肿瘤细胞负载树突状细胞时所加入的凋亡的热休克肿瘤细胞与树突状细胞的数量比例为1∶1-3。
13.权利要求1所述的树突状细胞肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法与应用。该疫苗通过将热休克法处理肿瘤细胞，再诱导肿瘤细胞凋亡，制备树突状细胞，将凋亡的热休克肿瘤细胞负载于树突状细胞而得到。该疫苗可减少免疫逃避，疗效好，可用于抗肿瘤药的制备；该制备工艺简单、快速、成本低。
文档编号A61K39/00GK1686538SQ20051003868
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月4日 优先权日2005年4月4日
发明者时宏珍 申请人:南京大陆产业投资集团有限公司